黃鶴飛，強偉杰，楊慶，李玉潔，翁小剛，王婭杰，李琦，蔡維艷，陳濤,朱曉新*，陳穎*

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京　100700； 2. 三峽大學(xué)，湖北 宜昌　443002;3．三峽食品藥品檢驗檢測中心，湖北 宜昌　443002)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種臨床常見的以腹痛、腹部不適和大便習(xí)慣改變?yōu)橹饕卣鞯穆怨δ苄阅c道病變，屬中醫(yī)“腹痛”、“泄瀉”范疇；其因為外感時邪，內(nèi)傷飲食或情志所傷等致臟腑功能失調(diào)，從而腸道氣機不利、傳導(dǎo)失司而導(dǎo)致痛、瀉等癥。IBS病程漸進、遷延難愈、常易復(fù)發(fā)。IBS全球發(fā)病率約為10%～30%，我國患病率在20%左右[1]。近年來隨著生活節(jié)奏增快和壓力增大，發(fā)病率有上升的趨勢。

臨床主要依據(jù)“IBS羅馬Ⅲ診斷標準”進行癥狀學(xué)診斷。但是目前對IBS診斷標準的解釋和應(yīng)用存在較強的主觀性，缺乏特異性的形態(tài)學(xué)或生物化學(xué)的診斷標識。2016年頒布的《羅馬Ⅳ：功能性胃腸病》中認為包括IBS在內(nèi)的功能性胃腸道疾病是“腦-腸互動障礙相關(guān)的疾病，其病因可能包括動力紊亂、內(nèi)臟高敏感、黏膜和免疫功能改變、腸道菌群改變和神經(jīng)中樞系統(tǒng)處理過程的改變”。這種疾病定義的變更與新的腦-腸交互觀點更為吻合。傳統(tǒng)中醫(yī)認為胃腸疾病與“心”相關(guān)：“腦為奇恒之府；大腸為傳化之腑；濁氣出，精汁藏，則臟腑得養(yǎng)，氣機調(diào)暢，神乃正常；胃不和則臥不安；久慮傷脾”[2]；因此在治療脾胃相關(guān)疾病時需要“心胃”并治[3]。腦腸肽(brain-gut peptides，BGP)是指一類既存在胃腸道又存在于腦組織內(nèi)，參與生理活動的物質(zhì)，包括神經(jīng)遞質(zhì)、胃腸激素等，因大多為肽類故稱為腦腸肽。在腦腸軸的交互作用中，BGP作為兼有神經(jīng)遞質(zhì)和激素雙重作用的重要功能因子，起到搭建連接橋梁和調(diào)控功能的作用。目前發(fā)現(xiàn)的BGP有60余種，與IBS有密切關(guān)系的有降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、胃動素(MTL)、神經(jīng)肽Y(NPY)、P物質(zhì)(SP)、生長抑素(SS)、血管活性腸肽(VIP)、膽囊收縮素(CCK)等。

在IBS的腦腸交互研究中，BGP逐漸成為研究的熱點，但是尚未有IBS動物模型的中樞和腸道BGP的變化的系統(tǒng)研究。本文擬從BGP調(diào)節(jié)的角度，研究戊己丸對IBS的調(diào)控作用，將對理解IBS的發(fā)病機制，揭示藥物作用的新靶點，為IBS的臨床診斷和治療方法的發(fā)現(xiàn)提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物

SPF級SD大鼠60只，雄性，(250±20)g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心【SCXK(軍)2012-0004】。在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動物室屏障環(huán)境【SYXK(京)2013-0035】進行實驗，實驗過程按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，并通過中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動物實驗倫理審查(倫理審批號：20150410-01)。

1.1.2儀器和試劑

Potter S型勻漿機，Spectra max Plus384微孔板檢測系統(tǒng)，CGRP、MTL、NPY、SP、SS、VIP、CCK的ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，戊己丸(含黃連:制吳茱萸:炒白芍為6∶1∶6；黃連、制吳茱萸和土炒白芍提取物由中日友好醫(yī)院藥劑室制備，為真空干燥固體粉末，得率分別為19.3%，17.7%，9.37%)，匹維溴銨片(法國蘇威制藥廠)。

1.2　方法

1.2.1實驗分組

隨機將大鼠分為6組：為正常組對照(NC)，模型組(M)，陽性藥組(PC)，戊己丸低(W-L)、中(W-M)、高劑量組(W-H)，每組10只。除正常組動物外，均采用單籠飼養(yǎng)，自由飲食，12 h/12 h黑暗與光照交替，室溫24℃。大鼠在造模成功后，給予以臨床1、2、4倍量戊己丸提取物為低劑量(630 mg/kg)、中劑量(1260 mg/kg)、高劑量(2520 mg/kg)藥物組；陽性藥組給予匹維溴銨13.5 mg/kg，以20 mL/kg灌胃給藥；正常組、模型組均給予等量蒸餾水。每天8點灌胃給藥，持續(xù)給藥7 d。

1.2.2PI-IBS大鼠模型的建立及結(jié)腸運動能力檢測[4]

大鼠禁食12 h后，經(jīng)肛門插入8 cm深硅膠管，灌入1 mL的4%乙酸水溶液，將尾部抬高30 s，然后注入1 mL的生理鹽水沖洗結(jié)腸。乙酸刺激后的第8天用膠帶束縛大鼠的上半身(包括前肩、前上肢、胸部)，限制大鼠前上肢抓撓頭面部，但不限制其活動，束縛時間為1 h。分別于建模前、給藥前及給藥后測量以下指標。

大鼠2 h內(nèi)排便的糞粒數(shù)：清早未刺激前計2 h內(nèi)大鼠排便的糞粒數(shù)。

大鼠結(jié)腸運動的描記：將橡膠小囊與直徑為2 mm的塑料導(dǎo)管連接，將塑料導(dǎo)管與三通管(一端接壓力換能器，另一端接1 mL的注射器)連接，注射器注入水，排凈氣泡，將壓力換能器與多導(dǎo)生理記錄儀相連，記錄30 min結(jié)腸運動的曲線。然后計算連續(xù)30 min的曲線下面積為大鼠的結(jié)腸運動指數(shù)(motility index，MI)。

大鼠直腸內(nèi)玻璃小球排出時間：取玻璃小球(直徑3 mm)放入距肛門3 cm的直腸內(nèi)，移至墊清潔濾紙的籠內(nèi)喂食飲水，計時。計算直腸內(nèi)玻璃小球排出時間。

1.2.3樣品采集及指標檢測

實驗結(jié)束后，麻醉后取腦組織。量取距肛門8 cm處取結(jié)腸組織2 cm。加3倍體積生理鹽水勻漿后，按照ELISA試劑盒的操作說明檢測CGRP、MTL、NPY、SP、SS、VIP、CCK的含量。樣品體積50～100 μL，檢測波長為450 nm。

1.3　統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差來表示，各組間均數(shù)比較采用t檢驗。

2　結(jié)果

2.1　動物一般狀態(tài)

與正常大鼠比較，PI-IBS模型大鼠體重降低、攝食量減少、排便量增多、出現(xiàn)稀便和無定形軟便、自主運動量減少。戊己丸和陽性藥治療7 d后，大鼠體重和攝食量均增加；排便量減少；稀便減少；自主運動量接近正常。

2.2　結(jié)腸運動能力

2.2.1大鼠2 h內(nèi)排出的糞粒數(shù)

造模前，各組大鼠2 h內(nèi)排出的糞粒數(shù)無差異。造模后，PI-IBS大鼠排出的糞粒數(shù)較正常組顯著增加(P< 0.05)。戊己丸或陽性藥治療后，大鼠2 h內(nèi)排出糞粒數(shù)顯著降低(P< 0.05)。結(jié)果見圖1。

注：與正常組比較，*P< 0.05；與模型組比較，#P< 0.05。圖1　大鼠2 h內(nèi)排出的糞粒數(shù)Note. Compared with the control group, *P< 0.05; Compared with the model group, #P< 0.05.Fig.1　The number of fecal pellets discharged within 2 h of the rats

2.2.2大鼠結(jié)腸運動變化

造模前，各組大鼠的MI無差異。造模后，PI-IBS大鼠結(jié)腸MI較正常大鼠顯著增加(P< 0.05)。戊己丸或陽性藥治療后，與PI-IBS模型大鼠比較，戊己丸中、高劑量組和陽性藥組大鼠的MI值顯著降低(P< 0.05)。結(jié)果見圖2。

2.2.3大鼠直腸內(nèi)玻璃小球排出時間

造模前，各組大鼠的玻璃小球排出時間無差異。造模后，PI-IBS大鼠直腸內(nèi)玻璃小球排出時間較正常大鼠顯著縮短(P< 0.05)。戊己丸或陽性藥治療后，與PI-IBS模型大鼠比較，戊己丸各給藥組和陽性藥組大鼠直腸玻璃小球排出時間顯著增加(P< 0.05)。結(jié)果見圖3。

注：與正常組比較，*P< 0.05；與模型組比較，#P< 0.05。圖2　大鼠結(jié)腸運動指數(shù)(MI)Note. Compared with the control group, *P< 0.05; Compared with the model group, #P< 0.05.Fig.2　Distal colon motility index (MI) of the rats

注：與正常組比較，*P< 0.05；與模型組比較，#P< 0.05。圖3　大鼠直腸內(nèi)玻璃小球排出時間(s)Note. Compared with the control group, *P< 0.05; Compared with the model group, #P< 0.05.Fig.3　Glass pellet discharge time (s) of the rats

2.3　對結(jié)腸組織中腦腸肽的影響

與正常大鼠比較，PI-IBS大鼠結(jié)腸組織中CGRP、MTL、NPY、SP、SS、VIP和CCK水平均顯著降低(P< 0.05)；陽性藥可顯著逆轉(zhuǎn)NPY、VIP和CCK水平的降低(P< 0.05)；中劑量的戊己丸給藥后，結(jié)腸組織中的NPY和VIP可顯著增加(P< 0.05)。結(jié)果見圖4。

2.4　對大鼠腦組織中腦腸肽的影響

與正常大鼠比較，PI-IBS大鼠腦組織中CGRP、MTL、SS和VIP顯著增加(P< 0.05)；陽性藥組可顯著逆轉(zhuǎn)腦組織中MTL、SS和VIP水平的升高(P< 0.05)；戊己丸中、高劑量組顯著降低CGRP、MTL、SS和VIP水平(P< 0.05)。與正常大鼠比較，PI-IBS大鼠腦組織中NPY和SP顯著降低。戊己丸高劑量給藥后，NPY水平有顯著的升高(P< 0.05)。結(jié)果見圖5。

3　討論

本研究采用乙酸灌腸聯(lián)合束縛應(yīng)激法建立的PI-IBS大鼠模擬了臨床上PI-IBS患者的大部分典型癥狀。在灌注乙酸后三天，大鼠均出現(xiàn)嚴重的腹瀉；隨著時間的延長，腹瀉癥狀均有不同程度的緩解；到乙酸灌腸后第7天進行胃腸動力檢測發(fā)現(xiàn)大鼠的結(jié)腸運動顯著增強，排便及大便性狀異常，同時病理學(xué)結(jié)果表明結(jié)腸黏膜完整，無器質(zhì)性損害。這些癥狀也與現(xiàn)有的最新臨床診斷標準(羅馬IV)中描述的很一致。戊己丸是具有瀉肝和胃，降逆止嘔之功效的經(jīng)典名方，被中國藥典2010版收錄，用于治療肝火犯胃，肝胃不和所致的胃脘灼熱疼痛，口苦嘈雜、嘔吐吞酸，腹痛泄瀉等癥狀。在我們的前期研究中，發(fā)現(xiàn)其能顯著改善IBS患者和模型動物的腹瀉、腹痛等癥狀，還具有改善感染后的腸壁緊密連接改變所導(dǎo)致的腸黏膜通透性的改變，調(diào)控腸道微生物菌群的平衡，改善腸黏膜免疫功能等作用[4]。

注：(A)大鼠結(jié)腸組織中CGRP含量；(B)大鼠結(jié)腸組織中MTL含量；(C)大鼠結(jié)腸組織中NPY含量；(D)大鼠結(jié)腸組織中SP含量；(E)大鼠結(jié)腸組織中SS含量；(F)大鼠結(jié)腸組織中VIP含量；(G)大鼠結(jié)腸組織中CCK含量。與正常組比較，*P< 0.05；與模型組比較，#P< 0.05。圖4　大鼠結(jié)腸組織中腦腸肽含量Note: (A) Content of CGRP. (B) Content of MTL. (C) Content of NPY. (D) Content of SP. (E) Content of SS. (F) Content of VIP. (G) Content of CCK. Compared with the control group, *P<0.05; Compared with the model group, #P<0.05.Fig.4　Contents of brain-gut peptides in the rat colon tissues

注：(A)大鼠腦組織中CGRP含量；(B)大鼠腦組織中MTL含量；(C)大鼠腦組織中NPY含量；(D)大鼠腦組織中SP含量；(E)大鼠腦組織中SS含量；(F)大鼠腦組織中VIP含量；(G)大鼠腦組織中CCK含量。與正常組比較，*P< 0.05；與模型組比較，#P< 0.05。圖5　大鼠腦組織中腦腸肽含量Note. NC: (A) Content of CGRP. (B) Content of MTL. (C) Content of NPY. (D) Content of SP. (E) Content of SS. (F) Content of VIP. (G) Content of CCK. Compared with the control group, *P< 0.05;Compared with the model group, #P< 0.05.Fig.5　Contents of brain-gut peptides in the rat brain tissues

IBS與腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)及腦腸軸功能失調(diào)密切相關(guān)。ENS是分布于胃腸道的一個巨大網(wǎng)絡(luò)，通過各種BGP的釋放和傳遞，把內(nèi)臟與中樞關(guān)聯(lián)起來。這些同時在中樞和外周分泌的BGP，一方面作為神經(jīng)傳遞和調(diào)節(jié)的介質(zhì)調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺和運動；另一方面在胃腸道的分泌起重要的調(diào)節(jié)作用。如CGRP由初級感覺神經(jīng)元釋放，參與疼痛信號的傳導(dǎo)過程；MTL主要存在于十二指腸和近端空腸黏膜隱窩及絨毛中，少量存在于胃竇及下部小腸黏膜中[5]，可作用于消化道平滑肌細胞，促進胃腸運動，增強水以及電解質(zhì)的運輸；MTL可促進胰多肽和SS的釋放從而引起胃腸動力改變。NPY及其受體在CNS的痛覺調(diào)制中起重要作用。在CNS中，NPY可調(diào)節(jié)下丘腦激素的合成與釋放；在外周器官交感神經(jīng)末梢，NPY與去甲腎上腺素共存，參與對胃腸道的功能調(diào)節(jié)。SP是連接中樞和免疫的一種信號傳導(dǎo)分子。在ENS，SP存在于多肽神經(jīng)元中，可以增加胃腸蠕動，激活釋放5-HT和組胺[6]。SP還能夠刺激和加速胃腸蠕動，向腦內(nèi)痛覺中樞傳遞痛覺信息。SS由胃腸D細胞分泌，可抑制胃腸和膽道平滑肌的活動，抑制胃酸的分泌。VIP可抑制胃腸道環(huán)形平滑肌[7]，VIP還可刺激胃腸黏膜分泌細胞，增加水、電解質(zhì)的黏膜分泌，繼而出現(xiàn)腹瀉及黏液便[8]。CCK可使膽囊和胃腸平滑肌收縮，調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)，并影響迷走傳人神經(jīng)途徑中其他激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些腦腸肽雖然已經(jīng)被證實可以被傳遞到靶細胞傳遞信息，通過內(nèi)分泌系統(tǒng)影響神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的功能，但是，這些腦腸肽指標變化與疾病發(fā)病機制的關(guān)系，以及涉及到的具體作用機制還很不明確。從文獻可見[9-12]：IBS病人或疾病模型的血漿/血清、腦組織和腸道組織內(nèi)的腦腸肽與正常組相比具有顯著的改變；大多腦腸肽在循環(huán)系統(tǒng)的變化趨勢與腸道組織中的一致。腦和腸道組織的樣本在臨床上很難得到。因此，血清/血漿中的腦腸肽有可能作為一個潛在的指標，為IBS疾病的診斷及藥效的判定提供實驗支持。

本研究建立的PI-IBS大鼠的結(jié)腸組織和腦組織內(nèi)多種腦腸肽的水平均有顯著的變化，提示這些腦腸肽在腦-腸中可能參與IBS的病理生理過程。由于目前對IBS的具體的發(fā)病機制尚不明確，腦腸肽調(diào)節(jié)IBS研究僅有5-羥色胺信號系統(tǒng)受到了較多的關(guān)注。大多數(shù)腦腸肽的變化是涉及到哪些信號通路以及與疾病機制的關(guān)系還很不明確，仍然需要進一步從分子生物學(xué)層面進行研究。本研究中可被調(diào)節(jié)的異常變化的腦腸肽可能成為潛在的診斷和治療IBS的生物學(xué)指標，可進一步應(yīng)用于治療IBS藥物的作用機制研究。

研究結(jié)果表明：基于“瀉肝和胃，降逆止嘔”理論的戊己丸方能夠改善該IBS大鼠的癥狀，同時也具有明顯的調(diào)節(jié)腦腸肽的作用。戊己丸對腦組織中的SS、NPY、CGRP、SP、VIP具有調(diào)節(jié)作用，其中對SS、NPY、CGRP、VIP作用顯著；對結(jié)腸組織中的CGRP、MTL、NPY、SS、VIP具有調(diào)節(jié)作用。進一步研究戊己丸對各種腦腸肽影響的作用機制，以及戊己丸主要有效成分與腦腸肽的PK-PD相關(guān)性將有利于闡釋中藥復(fù)方治療IBS的作用機制，為尋找治療IBS的藥物作用靶點提供指導(dǎo)。