李舸，李航，劉書華，李韻峰，關(guān)雅倫，李雪嬌，黃韌，張鈺

(廣東省實驗動物重點實驗室 廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州　510663)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)是常見的中樞神經(jīng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化、日常生活能力進行性減退，并伴有各種精神癥狀和行為障礙[1-2]，已成為嚴(yán)重威脅老年人健康的主要疾病之一。目前，對于AD發(fā)病機制，普遍的觀點認(rèn)為β淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)過度聚集形成老年斑和tau蛋白過度磷酸化聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)是引起AD的主要原因[3]。因此，在過去的幾十年中，根據(jù)AD病人Aβ和tau突變編碼序列特征，利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了大量針對上述兩種基因突變所致的小鼠AD動物模型，并廣泛應(yīng)用于AD發(fā)病機制研究和治療藥物篩選評價[4]，近年來，隨著研究的深入，細胞衰老[5]、炎癥[6]、血管損傷[7]等因素也被認(rèn)為在Aβ產(chǎn)生和清除中起到了關(guān)鍵作用，因此，針對這些因素構(gòu)建新的AD動物模型，對于闡明AD致病機理和新藥研發(fā)具有重要意義。

早期研究發(fā)現(xiàn)，分泌型糖蛋白Slit2在發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，其通過與下游的4個Robo受體結(jié)合指導(dǎo)神經(jīng)軸突排列[8]，此外，Slit2在細胞遷移，腫瘤血管形成和炎癥發(fā)生也發(fā)揮了重要的功能[9]。近年來的報道指出，Slit2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理和病理過程中扮演了重要的角色，生理條件下，Slit2具有較強地抑制神經(jīng)炎癥的功能[10]，但在病理條件下，過表達Slit2可能通過破壞血管結(jié)構(gòu)引起血腦屏障通透增強[11-12]。前期的研究顯示，過表達Slit2基因小鼠顯示AD樣的行為認(rèn)知異常，但Tg-Slit2小鼠的異常表型是否與Aβ的產(chǎn)生有關(guān)還不清楚。

因此，在本研究中，我們對比研究了老年Tg-Slit2小鼠和AD小鼠Tg-2576在Aβ沉積中的差異，并利用功能基因PCR芯片技術(shù)，針對上述兩種小鼠腦組織中AD相關(guān)基因表達進行檢測分析和對比研究，初步探討Slit2基因與AD疾病的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物

6周齡SPF級雄性Tg-Slit2小鼠(C57BL/6背景)和Tg-2576小鼠(C57BL/6背景)各10只(體重18～20 g)由廣東藥科大學(xué)王麗京教授惠贈，6周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠(體重18～20 g)購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心【SCXK(粵)2013-0002】。所有小鼠飼養(yǎng)至14月齡，飼養(yǎng)期間動物自由采食飲水，12 h循環(huán)燈光，恒定濕度，室溫(23±2)℃。動物飼養(yǎng)和實驗在廣東省實驗動物監(jiān)測所設(shè)施內(nèi)進行【SYXK(粵)2016-0122】。本研究所涉及的動物實驗獲得廣東省實驗動物監(jiān)測所(AAALAC認(rèn)證機構(gòu))動物實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準(zhǔn)(IACUC編號2014027)。

1.1.2儀器與試劑

Purified anti-β-Amyloid，1-40 Antibody(SIG-39140，Biolegend，美國)，Purified anti-β-Amyloid，1-42(SIG-39142，Biolegend，美國)，Antibody SP Mouse HRP Kit(康為世紀(jì)，中國)，Trizol試劑(Invitrogen，美國)，氯仿、異丙醇、無水乙醇、二甲苯(上?；瘜W(xué)試劑有限公司，中國)，DEPC水(生工生物工程有限公司，中國)，AmbionTMDNase I(RNase-free)試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)，AmbionTMRNase Inhibitor(Thermo Fisher Scientific，美國)，RNeasy? MinEluteTM純化試劑盒(Qiagen，德國)，溴化乙錠(華美生物工程公司，中國)，瓊脂糖(生工生物工程有限公司，中國)，SuperScript. III Reverse Transcriptase(Invitrogen，美國)，2X SuperArray PCR master mix (Qiagen，德國)， Mouse Alzheimer’s Disease RT2ProfilerTMPCR Array(Qiagen，德國)。

冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific，美國)，恒溫水浴鍋(上海皓莊儀器有限公司，中國)，凝膠電泳系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)，凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)，Nanodrop紫外分光光度計(Thermo Fisher Scientific，美國)，ABI-7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)。

1.2　方法

1.2.1小鼠腦組織樣品Aβ1-40和Aβ1-42免疫組化染色

14月齡的雄性Tg-Slit2、Tg2576和C57BL/6小鼠頸椎脫臼安樂死后，取右半腦4%多聚甲醛固定過夜，組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟后，包埋成石蠟組織塊。組織塊修塊后4 μm切片，經(jīng)45℃溫水展片后，貼于明膠玻片上放入烘箱中烘烤過夜用于后期染色。

組織切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水、抗原修復(fù)后，按照SP Mouse HRP Kit試劑盒說明書，滴加山羊血清封閉，加入1∶200稀釋的purified anti-β-amyloid1-40 antibody孵育過夜，經(jīng)PBS充分漂洗后，滴加生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗工作液室溫孵育30 min，經(jīng)PBS漂洗后，加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素室溫孵育30 min，經(jīng)PBS再次漂洗后，加入DAB顯色工作液，并在顯微鏡下觀察顯色。顯色完成后，將組織切片放入自來水中終止顯色，之后組織切片經(jīng)蘇木素復(fù)染、脫水透明，封片后在顯微鏡下進行鏡檢。

1.2.2小鼠腦組織樣品總RNA提取及純化

14月齡的雄性Tg-Slit2、Tg2576和C57BL/6小鼠頸椎脫臼安樂死后，取左半腦加入2 mL的Trizol試劑并充分勻漿，加入0.4 mL氯仿震蕩混勻后，離心吸取水相加入0.5 mL異丙醇混勻后再次離心后，棄上清加入75%乙醇清洗RNA沉淀，干燥后加入適量DEPC水溶解RNA。

取適量RNA，按照AmbionTMDNase I (RNase-free) 試劑盒操作說明，去除樣品中的基因組DNA，并按照RNeasy? MinEluteTM純化試劑盒操作說明，對RNA樣品進行進一步的過柱純化。

1.2.3腦組織總RNA樣品質(zhì)量檢測

利用Nanodrop紫外分光光度計測量RNA濃度，并獲得OD260和OD280值初步確定樣品的純度。將少量RNA樣品在70℃熱變性后，經(jīng)過變性瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射光下，觀察28S和18S核糖體RNA的條帶情況進一步分析樣品的純度。

1.2.4cDNA合成

按照SuperScript. III Reverse Transcriptase試劑盒操作說明，將適量的總RNA，oligo(dT)和dNTPs按比例充分混合，65℃水浴后，加入反轉(zhuǎn)錄酶混合混勻在50℃溫育后，于70℃溫育滅活反轉(zhuǎn)錄酶，之后將cDNA置于-20℃保存。

1.2.5功能基因PCR芯片分析

按照SuperArray PCR master mix 使用說明，將稀釋的cDNA與PCR預(yù)混液按比例混合，打開RT2ProfilerTMPCR Array Mouse Alzheimer’s Disease(表1)上的覆蓋膜，加20 μL混合液到PCR Array對應(yīng)的每個孔中，按照以下步驟設(shè)置實時定量PCR程序：1)聚合酶激活/變性(95℃，10 min)；2)擴增40個循環(huán)(95℃，15 s； 60℃，1 min；收集熒光)；3)溶解曲線分析。

1.3　數(shù)據(jù)分析

利用2-ΔΔCt法計算基因表達相對差異，并通過SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)采用Student’st-test進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2　結(jié)果

2.1　腦組織Aβ1-40和Aβ1-42免疫組化分析

利用免疫組化染色，我們分別對14月齡的老年雄性C57BL/6小鼠、Tg-Slit2小鼠和Tg-2576小鼠腦皮層中的Aβ1-40 h和Aβ1-42進行了免疫組織染色(圖1)，結(jié)果顯示，C57BL/6小鼠(圖1 A，Aβ1-40；圖1D，Aβ1-42)和Tg-Slit2小鼠(圖1B，Aβ1-40；圖1E，Aβ1-42)腦皮層中未見Aβ1-40和Aβ1-42的陽性染色，而Tg-2576小鼠腦皮層中出現(xiàn)大量Aβ1-40(圖1C)和Aβ1-42(圖1F)陽性染色，并表現(xiàn)出典型的Aβ1-40(圖1C，黑色箭頭)和Aβ1-42(圖1F，黑色箭頭)沉積。

2.2　用于功能芯片分析的腦組織總RNA樣品質(zhì)量分析

利用紫外分光光度計對每個待測樣品的總RNA樣品的濃度和純度進行了分析，結(jié)果顯示，所有樣品的RNA濃度均在300 ng/μL左右(表2)，樣品在260 nm和280 nm處的吸收光密度值(optical density，OD)比值表明，所有樣品的比值均在1.9～2.0之間(表2)，基本排除樣品中可能存在的DNA和蛋白污染情況。利用變性瓊脂糖凝膠電泳，對所有待測樣品RNA的完整性和純度進行了檢測顯示，所有樣品的28S和18S核糖體RNA條帶清晰完整，樣品的RNA完整性較好，在28S核糖體RNA條帶上方并未出現(xiàn)其他雜帶(圖2)，表明RNA制備過程中未出現(xiàn)DNA污染。

2.3　Mouse Alzheimer’s Disease RT2 ProfilerTM PCR Array PCR芯片擴增曲線分析

樣品的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行功能基因PCR芯片分析后，對每一個樣品PCR后的擴增曲線進行分析，結(jié)果顯示，所有樣品的擴增效率較為一致，不同基因Ct值的擴增曲線表現(xiàn)為平行位移，擴增曲線斜率差異較小，90%以上的基因Ct值在20～30之間(圖3)。功能基因PCR芯片檢測結(jié)果可以用于基因差異化表達分析。

表1　Mouse Alzheimer’s Disease RT2 ProfilerTM PCR Array 芯片陣列布局Tab.1　The array layout for the Mouse Alzheimer’s Disease RT2 ProfilerTM PCR Array

注：黑色箭頭為Aβ沉積。Bar=100 μm。圖1　老年小鼠腦皮層組織Beta淀粉樣蛋白Aβ1-40和Aβ1-42免疫組織化學(xué)染色(×200)Note. The accumulation of Aβ is indicated by black arrow. Bar=100 μm.Fig.1　Immunohistochemical analysis for Aβ1-40 and Aβ1-42 in the brain cortex of aging mice(×200)

樣品編號Sample IDOD260OD280OD260/ OD280濃度(ng/μL)Concentration (ng/μL)Tg-Slit2-17.7623.9461.97310.47Tg-Slit2-28.1384.2141.93325.53Tg-Slit2-37.9334.1351.92317.31Tg-Slit2-48.3944.3661.92335.76Tg-2576-18.2164.2461.94328.64Tg-2576-27.8463.9192.00313.83Tg-2576-37.8454.0831.92313.79C57BL/6-18.1764.1221.98327.06C57BL/6-28.0004.0591.97320.01C57BL/6-37.9544.1471.92318.18C57BL/6-48.1204.2711.90324.80

注：條帶1，Tg-Slit2-1；條帶2，Tg-Slit2-2；條帶3，Tg-Slit2-3；條帶4，Tg-Slit2-4；條帶5，Tg-2576-1；條帶6，Tg-2576-2；條帶7，Tg-2576-3；條帶8，C57BL/6-1；條帶9，C57BL/6-2；條帶10，C57BL/6-3；條帶11，C57BL/6-4。圖2　變性凝膠電泳分析腦組織總RNA樣品純度Note. Lane 1, Tg-Slit2-1. Lane 2, Tg-Slit2-2. Lane 3, Tg-Slit2-3. Lane 4, Tg-Slit2-4. Lane 5, Tg-2576-1. Lane 6, Tg-2576-2. Lane 7, Tg-2576-3. Lane 8, C57BL/6-1. Lane 9, C57BL/6-2. Lane 10, C57BL/6-3. 條帶11, C57BL/6-4.Fig.2　Purity analysis for total RNA in the brain tissues by denaturing gel electrophoresis

圖3　Mouse Alzheimer’s Disease RT2 ProfilerTM PCR Array的PCR芯片擴增曲線Fig.3　Amplification curves for RT2 ProfilerTM PCR Array Mouse Alzheimer’s Disease PCR array

2.4　Mouse Alzheimer’s Disease RT2 ProfilerTM PCR Array PCR芯片檢測結(jié)果

利用 Mouse Alzheimer’s Disease RT2ProfilerTMPCR Array PCR芯片結(jié)合雙ΔΔCt法，我們分別對14月齡的老年雄性Tg-Slit2小鼠和Tg-2576小鼠腦組織中AD相關(guān)基因與同年齡C57BL/6小鼠進行了相對表達量分析，結(jié)果表明，在總共檢測的84個基因中，Tg-Slit2小鼠相對于C57BL/6小鼠有43個基因表達上調(diào)，37個基因表達下調(diào)，4個基因表達不變，而Tg-2576小鼠則有38個基因表達上調(diào)，43個基因表達下調(diào)，3個基因表達不變(圖4)。進一步的統(tǒng)計學(xué)分析顯示，Tg-Slit2上調(diào)的43個基因中有16個基因顯著上調(diào)，下調(diào)的37個基因中有8個顯著下調(diào)，而Tg-2576小鼠上調(diào)的38個基因中有14個基因顯著上調(diào)，下調(diào)的43個基因中有17個顯著下調(diào)(圖5)。

圖4　Mouse Alzheimer’s Disease RT2 ProfilerTM PCR Array的PCR芯片總體結(jié)果Fig.4　The overall results for RT2 ProfilerTM PCR Array Mouse Alzheimer’s Disease PCR array

圖5　RT2 ProfilerTM PCR Array Mouse Alzheimer’s Disease PCR芯片差異表達基因分析Fig.5　Analysis of differential expression genes for Mouse Alzheimer’s Disease RT2 ProfilerTM PCR Array

2.5　Aβ產(chǎn)生和清除相關(guān)基因表達分析

依據(jù)Mouse Alzheimer’s Disease RT2ProfilerTMPCR Array PCR功能芯片的基因分類說明，我們對老年Tg-Slit2小鼠和Tg-2576小鼠中與Aβ產(chǎn)生相關(guān)的基因進行篩選分析后發(fā)現(xiàn)，在編碼組成剪切淀粉樣前體蛋白APP的跨膜蛋白復(fù)合物γ-分泌酶的三個亞基的基因中，催化亞基Psen2基因在Tg-2576小鼠腦中表達相對于同年齡的C57BL/6小鼠呈現(xiàn)出顯著上調(diào)，Aph1a和Ncstn差異無顯著性，而Tg-Slit2小鼠除了起穩(wěn)定γ-分泌酶的Aph1a基因表達顯著上調(diào)外，其催化亞基Psen2和Ncstn與C57BL/6小鼠差異無顯著性(表3)。

另一方面，我們進一步分析與Aβ清除相關(guān)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(Lrp)基因表達后發(fā)現(xiàn)，Lrp6和Lrp8在老年Tg-2576小鼠腦中表達相對于C57BL/6小鼠顯著下降，而Tg-Slit2小鼠與C57BL/6小鼠相比差異無顯著性(表3)。

表3　Aβ產(chǎn)生和清除相關(guān)基因表達Tab.3　Expression of genes related to Aβ generation and clearance

注：與C57BL/6小鼠比較，*P< 0.05；**P< 0.01。

Note.*P< 0.05；**P< 0.01, compared with C57BL/6 mice.

3　討論

在本研究中，我們利用特異性的Aβ1-40抗體對老年C57BL/6小鼠、Tg-Slit2小鼠和Tg-2576小鼠腦組織中Aβ1-40和Aβ1-42進行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，相比于Tg-2576小鼠，老年Tg-Slit2小鼠和C57BL/6小鼠腦皮層組織中并未出現(xiàn)明顯的Aβ1-40和Aβ1-42沉積，進一步利用功能基因PCR芯片對Aβ產(chǎn)生和清除相關(guān)基因差異化表達分析發(fā)現(xiàn)，三種小鼠內(nèi)源性淀粉樣前體蛋白APP基因表達并無差異，而Tg-Slit2小鼠在編碼組成剪切淀粉樣前體蛋白APP的跨膜蛋白復(fù)合物γ-分泌酶的催化亞基基因Psen2表達較Tg-2576顯著下降，而與Aβ清除相關(guān)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白Lrp6和Lrp8表達顯著上調(diào)。

Aβ是淀粉樣前體蛋白APP經(jīng)過蛋白酶水解后的產(chǎn)物，Aβ的異常聚集是導(dǎo)致AD發(fā)生的重要原因之一。γ-分泌酶是APP水解過程中的關(guān)鍵限速酶[13]，APP前體蛋白的γ位點經(jīng)過γ-分泌酶切割后，釋放APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，并生成由39-43個氨基酸殘基組成的Aβ肽段，其中以Aβ1-40和1-42最為常見，這些肽段一旦形成，極易形成聚集和沉淀，最終引起AD病變[14]。盡管我們在免疫組化中發(fā)現(xiàn)，老年Tg-2576小鼠腦組織中形成典型的Aβ沉積，而Tg-Slit2小鼠和C57BL/6小鼠未出現(xiàn)陽性表達，但在功能芯片檢測結(jié)果中，三種小鼠的Aβ前體APP的相對表達量卻未出現(xiàn)差異。分析Aβ形成原因，我們認(rèn)為Tg-2576小鼠主要通過基因修飾技術(shù)轉(zhuǎn)入人“Swedish”AD家族的APP突變基因(第670個氨基酸由賴氨酸突變?yōu)樘於０返?71個氨基酸由甲硫氨酸突變?yōu)榱涟彼?導(dǎo)致Aβ的過度產(chǎn)生，最終導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生一系列的AD樣病變，包括老年斑的形成、突觸可塑性的異常、膠質(zhì)細胞激活、氧化應(yīng)激增加等[15]。作為非APP過表達轉(zhuǎn)基因小鼠，Tg-Slit2小鼠和C57BL/6小鼠的Aβ來源只能由內(nèi)源性的鼠源APP表達產(chǎn)生，而根據(jù)功能芯片檢測說明，我們發(fā)現(xiàn)芯片主要特異性地針對鼠源的APP基因序列進行檢測，因此，我們認(rèn)為無論是Tg-2576小鼠還是Tg-Slit2小鼠，在本研究中，這兩個基因的轉(zhuǎn)入并未對鼠源APP的表達產(chǎn)生影響，同時，該結(jié)果也與在免疫組化中未發(fā)現(xiàn)Tg-Slit2小鼠和C57BL/6出現(xiàn)Aβ沉積相一致。

作為Aβ形成的關(guān)鍵限速酶，γ-分泌酶是一個由四個亞基構(gòu)成的跨膜蛋白復(fù)合體，包括催化活性中心presenilin(Psen)，底物識別蛋白nicastrin(Ncstn)，穩(wěn)定蛋白Anterior pharynx defective 1 homolog(Aph1)和presenilin enhancer(PEN2)[16]。最近的研究表明，過表達Psen2能夠?qū)е耇g2576小鼠在3-4個月即出現(xiàn)記憶功能損傷，損傷的提前發(fā)生與Psen2催化Aβ產(chǎn)生過早沉積相關(guān)[17]，而關(guān)于Aph1的研究發(fā)現(xiàn)，表達Aph1α影響APP水解后的Aβ肽段大小，但與Aβ產(chǎn)生的總量不相關(guān)[18]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在功能基因PCR芯片檢測的與APP水解相關(guān)的γ-分泌酶三個亞基中，盡管Tg-Slit2小鼠出現(xiàn)Aph1α基因的表達顯著上調(diào)，但與Aβ產(chǎn)生密切相關(guān)Psen2基因表達并未出現(xiàn)與Tg-2576小鼠相似的顯著上調(diào)的表型，這一表型也與我們在Aβ免疫組化染色結(jié)果相一致。

另一方面，對于腦內(nèi)Aβ的清除，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白在這一過程中扮演了重要的角色，腦內(nèi)的Aβ與ApoE結(jié)合后，通過腦血管內(nèi)皮細胞上的LRP轉(zhuǎn)運至外周血液，同時血液中游離的Aβ與可溶性的LRP結(jié)合，降低血液中的Aβ濃度，促進Aβ的外周降解[19]。研究表明，LRP的突變后導(dǎo)致Aβ在Tg2576小鼠腦組織中發(fā)生過早沉積，此外，Aβ沉積所產(chǎn)生的毒性作用將誘導(dǎo)加速LRP在該小鼠腦血管內(nèi)皮中的降解[20]。此外，LRP6缺陷導(dǎo)致小鼠神經(jīng)突觸功能異常，進一步在轉(zhuǎn)基因小鼠AD模型和臨床AD病人研究發(fā)現(xiàn)，LRP6功能缺失與Aβ沉積產(chǎn)生的神經(jīng)毒性密切相關(guān)[21]。對于LRP8，該基因缺陷將導(dǎo)致小鼠記憶功能受損，同時，過度激活的γ-分泌酶參與并促進LRP8蛋白的水解[22]。因此，在本研究中，老年Tg-Slit2小鼠并未出現(xiàn)Tg-2576小鼠典型的Aβ沉積可能與其LRP功能維持密切相關(guān)。

綜上所述，在本研究中，我們利用功能基因PCR芯片對比研究了Tg-Slit2小鼠與Tg-2576小鼠AD相關(guān)基因表達差異，從Aβ產(chǎn)生和清除方面，14月齡過表達Slit2小鼠未產(chǎn)生Aβ的沉積，Aβ相關(guān)基因也未顯示出與Tg2576小鼠相似的改變，過表達Slit2是否與AD相關(guān)關(guān)還需要進一步研究。