袁圓，王璇，張志成，李娜，王文廣，匡德宣，代解杰

(中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所, 中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所實驗樹鼩標準化與應用研究省創(chuàng)新團隊，云南省眼科疾病防治研究重點實驗室，昆明　650118)

哺乳動物呼腸孤病毒(mammalian orthoreovirus, MRV)是基因組含10個節(jié)段的呼腸孤病毒科 (Reoviridea)正呼腸孤病毒屬 (Orthoreovirus) RNA病毒[1]，標準株可根據紅細胞凝集活性分為： T1L(Long株)、T2J(Jone 株)和T3D/T3A(Dearing株/ Abney株)[2]。MRV具有廣泛的宿主譜，但一般僅在幼體或免疫功能不全的動物體內引起嚴重感染[3]。由于MRV特殊的基因組[4]特性和廣泛的宿主譜特征可能對人造成潛在威脅[5]，且其作為溶瘤病毒在肝癌治療中的重要價值[6]，故對呼腸孤病毒引起宿主免疫的特征的研究十分必要。目前呼腸孤病毒免疫學方面相關研究多集中于番鴨[7]、草魚呼腸孤病毒[8]，哺乳動物呼腸孤病毒免疫相關的研究十分有限；樹鼩(tree shrew)作為靈長類近親，近期也從其糞便中分離出的兩株分屬于T1型和T3型的呼腸孤病毒MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2013[9]，關于兩株病毒的特征和引發(fā)宿主免疫的變化規(guī)律亟待補充。前期研究表明，呼腸孤病毒感染正常樹鼩后，僅在感染前期有較高的復制表達，后期病毒表達水平有所下降，甚至逐漸被機體清除[10]；在此過程中與適應性免疫相關的II型干擾素基因有所上調[11]，但機體清除呼腸孤病毒的具體免疫機制以及機體適應性免疫在此過程中發(fā)揮的作用尚未明晰。臨床檢測中CD4+/CD8+和IL-4/IFN-γ常作為適應性免疫功能評價的指標[12]，綜合常用的評價指標[13]，以及適應性免疫中發(fā)揮主要功能的細胞類群，本文選用：CD4(一般表達于輔助性T細胞)、CD8(一般表達于殺傷性T細胞，cytotoxic lymphocyte，CTL表面)、 CD19(表達于所有B細胞)、IFN-γ(由CD4+Th1類細胞分泌，可協(xié)同CTL細胞共同發(fā)揮細胞免疫作用)[14]作為實時監(jiān)測機體適應性免疫反應變化情況的指標，用MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2013感染自身未攜帶呼腸孤病毒的樹鼩，通過對感染后樹鼩體內病毒載量及四個指標的變化情況初步推斷呼腸孤病毒引起宿主免疫反應的過程，為樹鼩源呼腸孤病毒自身感染特性的研究提供科學依據，對人獸共患疾病的防治也有重要的指導意義。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物

普通級遠交繁殖的F4代中緬樹鼩滇西亞種(tree shrew,Tupaiabelangerichinensis)由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心提供【SCXK(滇)K2013-0001】，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心普通環(huán)境【SYXK(滇)K2013-0001】，于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心進行實驗。所有操作均符合實驗動物倫理學要求(倫理審批號：DWSP201803034)。

1.1.2試劑及設備

實時熒光定量PCR儀：美國Bio-Rad，型號為CFX-96；高壓滅菌鍋：日本Tomy公司，型號為TOMY-SS-325；恒溫培養(yǎng)箱：美國Forma公司，型號為CO2 T/C；生物安全柜：美國Forma公司，型號為A/B3型(6Ft)；低溫離心機：日本Hitachi公司，型號為CT15RE；QIAamp?Viral RNA Mini Kit (德國Qiagen)；生理鹽水；胃管；采血注射器；Perfect Real Time One step primescript RT-PCR kit (TaKaRa)；樹鼩CD4單克隆抗體(PerCP，小鼠源)；樹鼩CD8單克隆抗體(PerCP，小鼠源)；人CD19單克隆抗體(PerCP，小鼠源)；溶血素(Beckman)。

1.2　方法

1.2.1動物分組

選取離乳40～50 d左右的樹鼩16只，體重60～70 g，尾靜脈采血160 μL，QIAamp?Viral RNA Mini Kit提取試劑盒提取總RNA，將產物進行PCR，隨機選取病毒檢測為陰性的動物12只(雌雄各半)分為三組，4只一組灌胃病毒液。A組：MRV1/TS/2011 106.1TCID 50/mL 0.8 mL/只；B組：MRV1/TS/2011 105.6TCID 50/mL 0.8 mL/只；對照組即C組：等量灌入生理鹽水。

1.2.2病毒樣本擴增培養(yǎng)及毒力檢測

Vero細胞接種于12孔板進行病毒培養(yǎng)后，免疫熒光初步確定收毒條件：感染后36～75 h之間收毒，外源加入阿爾法糜蛋白酶。小方瓶內進行擴毒，收毒，反復凍融三次破碎細胞，4℃，4000 r/min離心30 min，去沉淀。

收取病毒，TCID50檢測病毒毒力：將Vero細胞按接種于96孔板，于37℃孵箱中培養(yǎng)至長成致密單層。PBS清洗后，加入終濃度為10 μg/mL的糜蛋白酶的維持液，倍等比稀釋病毒，101～108共8個稀釋度，每個稀釋度設10個實驗孔，2個對照孔。甩干孔板中的PBS，實驗孔接種稀釋后的病毒液，對照孔加入相應不含病毒的維持液。37℃孵箱中培養(yǎng)，觀察并記錄出現CPE的孔數，計算TCID50。按前期實驗確定的最適攻毒條件調整本次實驗的攻毒劑量。

1.2.3樣本采集處理

病毒感染第1、8、14、21、28天，尾靜脈采集采抗凝血400 μL。

分為三部分，其中150 μL提取核酸后檢測病毒載量，QIAamp?Viral RNA Mini Kit提取試劑盒提取總RNA，將產物進行RT-PCR，檢測的引物見表1。

表1　用于實時定量RT-qPCR的MRV/TS探針及引物序列Tab.1　Primers and probes of RT-qPCR of the MRV/TS

取100 μL血樣利用ELISA檢測IFN-γ表達量：將標準品及樣品加完后，放于濕盒內室溫孵育2 h；棄去酶標包被板中液體，加滿洗液清洗3次，拍干；用稀釋液按1∶1500的比例稀釋酶標抗體，在標準品梯度稀釋孔、對照孔及待測樣品孔中，每孔加入稀釋好的酶標抗體100 μL，空白孔A1除外；濕盒內室溫孵育1 h；加滿洗液清洗3次，拍干；加入顯色液顯色10 min，加終止液1終止反應。在450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A值)。

剩余部分樣品利用紅細胞裂解液裂解紅細胞后流式上機檢測。每份取100 μL單細胞懸液，約1×106個細胞；樣品取一份細胞加入10 μL樹鼩CD4/CD8/CD19單克隆抗體PerCP；空白取一份細胞不加抗體；室溫下避光反應1～2 h；每份加入1 mL PBS，輕柔洗滌細胞一次，2000 r/min離心10 min，棄上清；每份加入300 μL PBS重懸細胞，上機檢測。

1.3　數據處理

數據得出后以平均值±標準誤記錄，作圖。組間差異性用t-test軟件 分 析，P< 0.05表示差異有顯著性，P< 0.01表示差異極顯著。IFN-γ測定后，以標準品濃度為橫坐標，A值為縱坐標，計算出標準品的Logistic曲線擬合(四參數)回歸方程式，根據樣品的A值代入方程式計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

2　結果

2.1　病毒載量隨感染時間變化

血漿中兩組病毒載量均在感染后第14天有高表達，其中A組(感染MRV1/TS/2011的動物)相較于B組(感染MRV3/TS/2013的動物)表達量較高，最高可達7.05×104copies/mg，其余時間均檢測到微量表達；B組在第14天呈8.59×103copies/mg高表達后，第21天仍有較高表達，第28天表達量急劇減少。對照組無病毒RNA表達，與對照組比較，兩個病毒感染組在第14天差異有顯著性(P<0.05)，詳見圖1。

注：與對照組比較 *P< 0.05，差異有顯著性。圖1　MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2013感染樹鼩后血漿中的病毒載量Note. *P< 0.05 means there was a significant difference.Fig.1　Expression of virus in the tree shrews infected with MRV1/TS/2011 and MRV3/TS/2013

2.2　免疫細胞數量及IFN-γ表達量隨感染時間變化

經兩株病毒感染后，CD4+、CD8+及CD19+細胞陽性率表達呈現波動變化，CD4+及CD19+細胞量均在第14天達峰值；對照組CD4+細胞陽性率基本表達在20%～30%之間，對照組CD19+細胞陽性率基本在4%～8%之間；其中，CD4+細胞在感染后第1、14、21天均有較高的表達，A組CD4+細胞在感染第1天顯著高于對照組；其余時間細胞量低于對照組；CD19+在第21、28天表達量低于對照組，第28天感染后細胞陽性率與對照組相比差異有顯著性。與對照組相比，經MRV3/TS/2013感染的CD19+細胞在第8天和第14天細胞陽性率顯著升高；而經MRV1/TS/2011感染后CD19+細胞變化不如MRV3/TS/2013明顯。兩株病毒感染后CD8+細胞量在21天達峰值；在感染第14天、第28天時，與對照組相比，經兩株病毒感染后CD8+細胞量顯著減少。對照組CD8+細胞表達基本維持在1%～3%之間。如圖2。

對照組CD4+/CD8+在感染后也呈波動變化，變化范圍在5～14之間，在第21天時有最小值；MRV1/TS/2011感染后，在第1、8、14天，CD4+/CD8+顯著高于對照組；而在MRV3/TS/2013感染后，第14、28天，CD4+/CD8+顯著高于對照組。詳見表2。對照組IFN-γ表達量在7～12之間，經MRV1/TS/2011及MRV3/TS/2013感染后，IFN-γ表達量均在第21天與對照組相比差異有顯著性，達最大值，詳見圖3。

3　討論

適應性免疫是機體抵御外界病原侵染的一條重要途徑，由淋巴細胞增殖分化為表達不同CD分子的效應細胞[15]，完成細胞免疫及體液免疫兩種應對。生物研究和臨床上常通過對CD分子的監(jiān)測來反映機體免疫功能或判斷病程。CD4+細胞增加被認為是細胞免疫增強的表現[16]；IFN-γ誘導并參與細胞免疫，CD8+表達于CTL表面，兩者表達量增加常意味著機體細胞免疫功能增強，B表面的CD19+增加則相反，表明機體體液免疫功能增強。而適應性免疫的研究不僅在疾病的機理研究中有重要作用[17-18]，也能為后續(xù)治療提供思路；如，溶瘤病毒治療的一條重要思路就是發(fā)宿主的免疫應答[19]，目前，在缺乏適應性免疫應答的兩種小鼠模型中研究表明，借助引發(fā)免疫反應來實現呼腸孤病毒的抗腫瘤效應具有可行性和有效性[20]。故呼腸孤病毒引起機體適應性免疫反應的研究十分必要，且因樹鼩與其他哺乳類實驗動物，如小鼠，在免疫系統(tǒng)和神經系統(tǒng)中相比親緣關系更接近于人[21]，故本研究在未來臨床治療中存在重要的潛在價值。

注：a圖為CD4+細胞陽性率隨天數變化情況；b圖為CD8+細胞陽性率隨天數變化情況；c圖為CD19+細胞陽性率隨天數變化情況；與對照組比較 *P< 0.05，差異有顯著性，**P< 0.01，差異有極顯著性。圖2　MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2013感染樹鼩后血漿中CD4+/CD8+/CD19+ 表達情況Note. Figure a shows CD4+ cells changed with the time after infection. Figure b shows CD8+ cells changed with the time after infection; Figure c shows CD19+ cells changed with the times after infection. *P< 0.05 means there was a significant difference, and **P< 0.01means there was a extremely significant difference.Fig.2　Expression of CD4+/ CD8+/CD19+ cells in the tree shrews infected with MRV1/TS/2011 and MRV3/TS/2013

組別Groups第1天Day 1第8天Day 8第14天Day 14第21天Day 21第28天Day 28實驗組A:MRV1/TS/201111.07327.042174.8764.95514.0761實驗組B:MRV3/TS/20136.4481.12966.9724.50819.546對照組Control8.61612.28613.4235.68313.154

注：與對照組比較 *P< 0.05，差異有顯著性；第21天時，MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2013感染組與對照組相比差異均有顯著性。圖3　MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2013感染樹鼩后血漿中IFN-γ表達量情況Note. *P< 0.05 means there is a significant difference; animals infected by MRV1/TS/2011and MRV3/TS/2013 both have significant difference on the 21’th day, compared with the normal group.Fig.3　IFN-γ expression in the tree shrew infected with MRV1/TS/2011 and MRV3/TS/2013

目前關于呼腸孤病毒引起機體免疫反應的研究十分有限，主要以和產業(yè)養(yǎng)殖相關的草魚和番鴨作為研究對象。草魚呼腸孤病毒感染是草魚出血癥的主要病因，草魚可以通過魚鰓上調12種抗病毒免疫相關基因表達來應對病毒感染[8]。與哺乳動物不同，草魚雖有脾、腎、胸腺等免疫器官，但主要的免疫細胞為IgM陽性細胞、IgZ陽性細胞和PAS陽性細胞[22]，經病毒感染后三類主要免疫細胞的變化情況暫未見報道。姚金水等[23]先后證實番鴨呼腸孤病毒可誘導感染細胞凋亡，特別是免疫細胞凋亡從而引起免疫抑制，同時還能能引起嚴重的法氏囊損傷。而本文結果顯示，CD4+、CD8+、CD19+三類細胞僅在感染后期明顯低于正常組，未觀察到明顯的免疫抑制現象。李爽等[24]研究表明鴨源呼腸孤病毒感染雛鴨后CD8+細胞陽性率也呈波動變化，在第5 天達到峰值；而第14 天，實驗組CD8+細胞陽性率明顯低于對照組；同樣，王全溪等[25]在雛番鴨上的研究也表明試驗組脾臟在攻毒后第 5 天，漿細胞數量比對照組少，差異有顯著性(P< 0.01)，之后細胞數量有所回升，提示鴨源呼腸孤病毒可能直接對免疫器官進行損傷，使外周血 CD3+、 CD8+T 細胞陽性率降低， 導致機體細胞免疫和體液免疫水平下降，誘導機體產生免疫抑制；而本文研究表明MRV1/TS/2011及MRV3/TS/2013載量在感染第14 天達峰值，這一結果與前期實驗所得相符[10]；而CD4+及CD19+細胞數量也在感染后第14天達峰值，其中經MRV1/TS/2011感染后第1天CD4+就有較高表達且數值與正常組相比有顯著性差異，且相較于其他兩種被檢測細胞，感染過程中，CD4+細胞陽性率一直較高；可推測在病毒感染前期，機體主要產生CD4+細胞，在整個應對感染的過程中，CD4+細胞一直發(fā)揮主要作用；在第14天病毒高表達時，CD19+細胞數量顯著增加，共同參與機體免疫反應。關于哺乳動物源呼腸孤病毒的研究目前主要集中與其分子和感染特性，關于其引起機體的免疫反應尚未見報道。為了解樹鼩源呼腸孤病毒感染正常個體后到被機體自然清除的過程，本文主要選用動物離乳40～50 d的樹鼩，此發(fā)育階段的樹鼩個體免疫功能已近完善，且樹鼩免疫系統(tǒng)發(fā)育在進化上要優(yōu)于番鴨、草魚，故不同于這兩者的研究結果，在樹鼩上未發(fā)現明顯的免疫抑制現象，動物免疫器官及動物個體也未表現明顯的感染病癥。結合已有報道，以及本文CD4+細胞和CD19+經兩株病毒感染后表現出的敏感性不同，一方面驗證了前期實驗中呼腸孤病毒能被正常機體清除的結論，另一方面提示我們不同來源的呼腸孤病毒對宿主感染的機制各不相同，不同型別的呼腸孤病毒也會針對性引起的機體不同的免疫反應。初步推測MRV1/TS/2011感染前期主要激起機體體液免疫；MRV3/TS/2013可能主要影響機體細胞免疫，體液免疫只在病毒表達量顯著升高及感染后期發(fā)揮作用。與呼腸孤病毒現有的研究對象相比，本文選用近人靈長類動物樹鼩作為對象，實驗結果為哺乳動物呼腸孤病毒感染及刺激機體免疫應對的機制研究提供了補充資料。

不同時間服用纈沙坦氫氯噻嗪對非杓型高血壓患者血壓晨峰和內皮功能的影響………………… 張倩輝 王立立 張志梅 等（4）462

實驗中采用的CD19+抗體為小鼠源抗人抗體，可通過交叉反應識別樹鼩CD19+細胞[26]，可能存在非特異性識別的情況，對B細胞數量的確立可能存在一定誤差；且實驗使用單染流式計數，所得結果僅能初步反應感染后個體免疫細胞的變化趨勢，為確定T輔助細胞、B淋巴細胞等在感染過程中發(fā)揮的具體作用，則后續(xù)實驗中還需加入CD3+細胞染色，由雙染特異的圈定具體細胞亞群，反應其準確的變化情況?，F有的IL-4試劑盒對樹鼩檢測的靈敏性不高，故實驗中未加入該指標，僅用IFN-γ輔助判斷細胞與體液免疫；本次各類CD分子及IFN-γ檢測中，對照組結果都有較大的個體的差異，故CD4+/CD8+比值僅作為參考體液免疫和細胞免疫主導作用的一個輔助指標，需要進一步擴大樣本才能得出一個正常比值范圍，作為判斷指標。本研究實驗組僅選用4只動物，是從小樣本得出的相應免疫細胞基本變化趨勢，實驗過程中發(fā)現，樹鼩個體間免疫功能差異較大，后期實驗還應擴大實驗樣本，同時在實驗設計中加入陰性對照組(培養(yǎng)病毒使用的維持液灌胃)、陽性對照組，增加實驗嚴謹性，避免偶然誤差，得出普適變化規(guī)律。

本文通過檢測兩株最近從樹鼩糞便分離得到的病毒MRV1/TS/2011及MRV3/TS/2013，感染正常樹鼩后幾類淋巴細胞表面CD分子及干擾素隨感染時間的變化情況，初步揭示了樹鼩呼腸孤病毒引起宿主免疫變化的規(guī)律，即：呼腸孤病毒感染樹鼩后，主要刺激機體產生CD4+細胞，在病毒表達量達高峰期時，CD19+細胞顯著增加，可能體液免疫發(fā)揮作用；而在病毒感染后期，CD8+細胞可能通過細胞免疫參與抗病毒反應，IFN-γ可由Th1類細胞和CD8+細胞分泌，在病毒感染后期參與細胞免疫；CD4+可能對1型呼腸孤病毒更敏感，而CD19+可能對3型呼腸孤病毒更敏感。對兩株病毒的感染規(guī)律研究有一定補充，同時可為呼腸孤病毒在機體內避開機體免疫發(fā)揮溶瘤作用提供一定的思路，可拓展呼腸孤病毒發(fā)揮溶瘤效應的分子機制，也為樹鼩的病毒防范提供了理論基礎。