劉建奎，魏春華，黃春芳，陳小燕，戴愛玲，楊小燕

龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室 福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖 364000

豬繁殖與呼吸綜合征 (Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV) 引起的一種全球性的豬病毒性傳染病[1-3]。PRRS于1996年在我國大陸首次暴發(fā)，隨后該病迅速蔓延暴發(fā)，成為我國規(guī)?；B(yǎng)豬場主要疫病之一。2006年，在我國南方地區(qū)暴發(fā)的高致病性PRRSV (Highly Pathogenic PRRS Virus，HP-PRRSV)，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[4-5]。2013年國內(nèi)出現(xiàn)了新流行毒株，該毒株與2008年美國分離到的NADC30毒株親緣關(guān)系較近，稱之為NADC30-like PRRSV，隨后迅速蔓延至全國多個省市，給豬場防控PRRS帶來了嚴峻挑戰(zhàn)[6-8]。由于PRRSV存在多種基因型，不同基因型的毒株在抗原性方面有很大的差異，導(dǎo)致現(xiàn)有的疫苗尚不能完全有效地防控所有或大部分PRRSV流行毒株。GP5蛋白為ORF5編碼的一種高度糖基化的蛋白，是PRRSV基因組中變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白。GP5是PRRSV最主要的保護性抗原，含有與病毒中和作用和免疫保護相關(guān)的表位，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體[9-10]。此外，PRRSV侵入機體后，主要產(chǎn)生的是針對GP5蛋白的中和抗體，因此GP5蛋白成為研制新型疫苗的首選蛋白[11-12]。

DNA shuffling技術(shù)是由Stemmer[13]于1994年首先提出的，是一項全新的體外人工進化模式，通過基因在分子水平上的重組，再以定向篩選具有預(yù)期形狀的突變體，獲得同時具有多個親本基因特征的突變基因。如今DNA shuffling技術(shù)在生物工程的領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在對病毒載體的改造方面，Maxygen公司利用DNA shuffling對4種相關(guān)但抗原不同的登革熱毒株改造后，獲得了突變抗原，其產(chǎn)生的抗體能與4種親本毒株發(fā)生免疫反應(yīng)[14]。目前利用DNA shuffling技術(shù)將處于不同進化分支的 PRRSV的某個或某些基因構(gòu)建到 PRRS感染性克隆骨架中，動物實驗證實構(gòu)建的嵌合病毒能對親本毒株產(chǎn)生部分交叉保護[15]。另外 DNA shuffling 還應(yīng)用在對細胞因子、啟動子、目的蛋白等方面的改造[16]，均表現(xiàn)出了不可替代的優(yōu)勢和良好的前景。

本實驗利用DNA shuffling技術(shù)，對處于不同遺傳分支的PRRSV ORF5基因進行重組，獲得重組的 ORF5基因，再將其連接原核表達載體進行原核蛋白表達，以期利用重組 ORF5蛋白免疫動物后能產(chǎn)生針對大部分甚至所有親本PRRSV的中和抗體，為研究新型PRRSV疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株和細胞

2012-2016年由本實驗室分離的處于不同進化分支的4株P(guān)RRSV毒株 (FJ01、FJ03、FJ10和FJZ03)以及Marc-145細胞由龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院保存。

1.2 主要試劑

PrimeSTAR HS DNA Polymerase、DNA marker、T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、IPTG (24 mg/mL) 和 DNA A-Tailing Kit購自大連寶生物公司；DNaseⅠ酶購自Sigma公司；普通瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒、BL21感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司。

1.3 PCR引物

參考VR2332、CH-1a、JXA1和NADC30毒株的序列設(shè)計2對特異性引物P1/P2和P3/P4，分別擴增PRRSV ORF5基因全長和去除信號肽區(qū)域的△ORF5基因 (表 1)，引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

表1 擴增PRRSV ORF5和△ORF5基因的引物序列Table 1 Primers used for construction of ORF5 and △ORF5 of PRRSV

1.4 PRRSV ORF5基因DNA Shuffling

1) 按照RNA提取試劑盒說明書提取4株病毒的RNA，按TaKaRa試劑盒說明書，采用兩步法用引物 (P1/P2) 進行 RT-PCR擴增，1%凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，用DNA純化回收試劑盒回收和純化目的條帶。

2) 將回收純化后的處于不同遺傳分支的ORF5基因用DNaseⅠ酶消化成大小約為50-150 bp的片段，反應(yīng)體系為 25 μL：純化的 DNA 2.0 μL，DNaseⅠ0.1μL，緩沖液 1 μL，ddH2O 4 μL。反應(yīng)程序：16 ℃ 3 min，加入 1 μL Stop solution for DNaseⅠ，終止反應(yīng)。酶切產(chǎn)物置于 3%瓊脂糖凝膠中電泳，用 DNA純化回收試劑盒進行回收目的條帶。

3) 無引物擴增：回收產(chǎn)物2.0 μL，5×Primer STAR緩沖液5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，ddH2O補足25 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 4 min ；95 ℃30 s，60 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，51 ℃30 s，48 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃2 min；共30個循環(huán)，72 ℃ 7 min。4 ℃保存。

4) 有引物擴增：無引物擴增后的 DNA產(chǎn)物2.0 μL， 5×Primer STAR 緩 沖 液 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物 (P3/P4)各 0.5 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，ddH2O補足25.0 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min ，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 重組ORF5基因的鑒定

將回收純化后的 PCR產(chǎn)物連接到 pMD19-T載體上，挑選 50個陽性重組質(zhì)粒送往北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。

1.6 重組 PET32-△2ORF5基因的原核表達及純化

根據(jù)測序結(jié)果選取△2ORF5作為目的基因，通過雙酶切 (BamHⅠ和HindⅢ) 將△2ORF5基因連接到 pET32a載體上進行蛋白表達。將pET32a-△2ORF5重組質(zhì)粒的菌液按照 1∶50比例接種至 100 mL LB培養(yǎng)基中，至吸光光度值OD600達到0.5-0.6時，加入1 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)蛋白表達。收集菌體，進行 SDS-PAGE，觀察蛋白的表達情況，按照全式金公司蛋白純化試劑盒進行蛋白純化。

1.7 Western blotting檢測

將純化的重組 pET32a-△2ORF5蛋白與弗氏完全佐劑等比例進行乳化，腹腔注射 SPF BALB/c小鼠，2周后以弗氏不完全佐劑與重組蛋白充分乳化后第二次加強免疫，二免后14 d眼球采血分離血清備用。

將未純化 4株毒株的 (FJ01、FJ03、FJ10和FJZ03) 重組pET32a-ORF5蛋白進行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以鼠抗血清為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體為二抗，在DAB溶液中顯色并觀察結(jié)果。

1.8 病毒抑制試驗

將制備的鼠抗血清滅活后，進行倍比稀釋分別與等體積 200TCID 的 FJ01、FJ03、FJ10、FJZ03 PRRSV混合，參考馬玲等建立的方法測定多克隆抗血清對病毒感染細胞的抑制率[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSV ORF5基因遺傳進化分析

通過設(shè)計的引物P1/P2對4株P(guān)RRSV (FJZ03、FJ01、FJ03和FJ10) 進行ORF5基因擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果顯示擴增后片段與目的片段大小一致，約為750 bp (圖1)。利用MEGA6.0軟件對ORF5序列進行了比對和分析。結(jié)果表明，4株P(guān)RRSV處于不同的進化分支，F(xiàn)J01與VR2332等處于同一進化分支為經(jīng)典毒株。FJZ03與NADC30處于同一進化分支，為新流行的NADC30-like PRRSV，F(xiàn)J03與 JXA1、HuN4等HP-PRRSV處于同一進化分支為 HP-PRRSV。FJ10與HB-1 (sh)/2002是處于HP-PRRSV與經(jīng)典毒株之間的具有中等毒力的毒株 (圖2)。

2.2 PRRSV ORF5基因DNA Shuffling結(jié)果

DNaseⅠ酶將回收純化的處于不同遺傳分支的ORF5 PCR產(chǎn)物酶切成大小約為50–150 bp左右的片段 (圖 3)。以純化回收后的酶切產(chǎn)物為模板，進行無引物 PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳分析 (圖4)。以無引物PCR產(chǎn)物為模板，用引物P3/P4進行有引物PCR擴增，獲得大小為500 bp左右的重組ORF5基因片段 (圖5)。

圖1 PRRSV ORF5基因片段的PCR擴增產(chǎn)物Fig. 1 Amplification of PRRSV ORF5 gene by RT-PCR. M: DL2000 DNA marker；1: PCR product of ORF5 of FJ01; 2: PCR product of ORF5 of FJ03; 3: PCR product of ORF5 of FJZ03; 4: PCR product of ORF5 of FJ10; 5: negative control.

圖2 基于PRRSV ORF5構(gòu)建遺傳進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on the ORF5 genes of the 4 isolates and reference viruses.

2.3 序列分析

將回收純化的有引物擴增的PCR產(chǎn)物連接到pMD-19T載體進行連接轉(zhuǎn)化，挑取 50個陽性克隆進行測序。通過DNAstar軟件對測序結(jié)果進行分析，△2ORF5基因包含4株P(guān)RRSV (FJZ03、FJ01、FJ03和FJ10) 的部分ORF5基因片段，最終選取△2ORF5作為目的基因 (圖6和圖7)。

圖3 ORF5基因的DNaseⅠ酶切結(jié)果Fig. 3 Identification of PRRSV ORF5 by DNaseⅠdigestion. M: DL2000 DNA marker; 1–3: product of DNaseⅠdigestion.

圖4 ORF5基因的無引物PCR擴增結(jié)果Fig. 4 Amplification of ORF5 by PCR without primers.M: DL2000 DNA marker; 1–6: amplified ORF5 without primers.

圖5 利用P3/P4引物擴增去除信號肽區(qū)域的△ORF5基因Fig. 5 Amplification of without signal peptide region△ORF5 by PCR using specific primers P3/P4. M:DL2000 DNA marker; 1–6: amplified △ORF5 by PCR using specific primers P3/P4; 7: negative control.

2.4 重組△2ORF5蛋白的純化

將鑒定為陽性的 pET32a-△2ORF5重組菌加入終濃度為 1 mmol/L IPTG進行蛋白的誘導(dǎo)表達，收集菌體，進行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明在預(yù)期位置出現(xiàn)明顯的條帶 (42 kDa)，與預(yù)計大小一致，最佳誘導(dǎo)時間為5 h。重組蛋白經(jīng)蛋白純化系統(tǒng)純化后，通過SDS-PAGE分析，結(jié)果表明純化的蛋白純度較高，純化效果理想 (圖8)。

2.5 多克隆抗體Western blotting分析

四株毒株未純化的重組 pET32a-ORF5蛋白經(jīng) SDS-PAGE和 PVDF膜轉(zhuǎn)印后，與鼠源抗△2ORF5血清作用，再經(jīng)羊抗鼠IgG HRP二抗作用，Western blotting分析，在預(yù)期位置出現(xiàn)明顯的條帶 (42 kDa)，與預(yù)計大小一致，而空質(zhì)粒pET-32a未見目的條帶 (圖 9)，說明表達的蛋白可被鼠源抗△2ORF5血清所識別。

2.6 病毒感染抑制試驗

將△2ORF5多抗血清進行倍比稀釋，檢測不同稀釋度血清 (2-2-2-6) 對4株P(guān)RRSV感染Marc-145細胞的抑制率。結(jié)果表明多抗血清對4株病毒呈現(xiàn)不同程度的抑制作用，當(dāng)多抗血清稀釋度為 2-2時，其對病毒感染細胞的抑制率最大 (>53%)，隨著稀釋度的增加呈現(xiàn)下降的趨勢，當(dāng)稀釋度達2-6時，對病毒沒有抑制作用 (圖10A)。接種4株P(guān)RRSV對照組細胞病變明顯，表明制備的△2ORF5血清具有較好的抗病毒感染活性?？笷J01、FJ03、FJZ03和FJ10的GP5抗血清對4株P(guān)RRSV的抑制試驗表明，多抗血清對同源株病毒有較好的抑制作用，而對其他3個異源毒株的抑制作用較差 (圖 10B–E)。

圖6 △2ORF5與4株親本毒株ORF5基因核苷酸 (A) 和GP5氨基酸 (B) 序列分析Fig. 6 Alignment of the ORF5 nucleotide sequences (A) and GP5 amino acid sequences (B) among the four parental virus strains and the △2ORF5 chimera.

圖7 應(yīng)用DNA shuffling技術(shù)產(chǎn)生的嵌合體△2ORF5核苷酸序列示意圖Fig. 7 A schematic diagram of the chimeric ORF5 nucleotide sequences in △2ORF5 generated by DNA shuffling.

圖8 重組△2ORF5蛋白的純化結(jié)果Fig. 8 Purification of the recombinant △2ORF5 protein. M: low molecular weight protein marker; 1–3:elution of recombinant △2ORF5 protein from Ni-NTA agarose for three times; 4: pET-32a induced 4 h.

圖9 重組蛋白的Western blotting分析結(jié)果Fig. 9 Western blotting analysis of the recombinant protein. M: protein molecular weight marker; 1: pET32a-FJZ03-ORF5; 2: pET32a-FJ01-ORF5; 3: pET32a-FJZ03-ORF5; 4: pET32a-FJZ03-ORF5; 5: pET-32a as control.

圖10 △2ORF5 (A)、FJ01 (B)、FJ03 (C)、FJZ03 (D) 和FJ10 (E) 多抗血清的病毒感染抑制試驗Fig. 10 Inhibition assay of anti-PRRSV infection by polyclonal serum △2ORF5 (A), FJ01 (B), FJ03 (C), FJZ03 (D)and FJ10 (E).

3 討論

PRRS是危害豬群的主要疾病，主要的預(yù)防措施是使用疫苗接種。目前使用的疫苗主要包括弱毒活疫苗和滅活疫苗，這兩種疫苗均對該疾病有一定預(yù)防作用。弱毒疫苗具有免疫力強、免疫保護期長、保護率高、免疫劑量小、在動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫抗體產(chǎn)生速度快等優(yōu)點。但是其在安全性方面依然存在一定問題，接種弱毒活疫苗后可能會經(jīng)胎盤感染胎兒，并且存在弱毒疫苗返強風(fēng)險[18-20]。因此弱毒活疫苗可用于存在PRRS的豬群中使用而不建議在未發(fā)生PRRS的豬群中使用。而滅活疫苗的使用則相對安全許多，其在使用中不存在安全性問題，但是滅活疫苗在滅活過程中會造成抗原表位缺失或抗原減弱，且抗體產(chǎn)生較慢，需要大劑量、重復(fù)接種。大部分疫苗只對同一進化分支的毒株具有一定的保護力，對于不同遺傳分支或親緣關(guān)系較遠的毒株可能不具有保護作用。目前國內(nèi)豬場PRRSV呈現(xiàn)復(fù)雜多樣性，新毒株不斷出現(xiàn)，尤其HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV給豬場帶來嚴重的經(jīng)濟損失。研究表明目前市場上的幾種弱毒疫苗不能對新出現(xiàn)的NADC30-like PRRSV產(chǎn)生免疫保護作用[21]。因此有必要開發(fā)新的基因工程疫苗，使其能夠有效、快速地在豬體內(nèi)產(chǎn)生抗體并能產(chǎn)生廣泛的免疫保護作用。

國內(nèi)外學(xué)者利用 DNA shuffling技術(shù)定向篩選出具有多個親本基因特征的突變基因，并將其構(gòu)建到不同毒株或疫苗株的骨架中，動物實驗證實利用DNA shuffling技術(shù)構(gòu)建的PRRSV嵌合病毒可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對異源毒株的交叉中和抗體[22-26]，說明DNA shuffling技術(shù)在開發(fā)有效的針對異源毒株保護的PRRSV疫苗方面具有廣闊的前景。ORF5基因編碼的GP5蛋白作為PRRSV主要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性，是研發(fā)PRRSV基因疫苗的重要候選蛋白。本研究利用 DNA shuffling技術(shù)，將多個處于不同遺傳分支的PRRSV ORF5基因進行基因改造，首先利用PCR技術(shù)擴增不同PRRSV ORF5基因，將其等量混合后利用DNaseⅠ酶將其酶切成多個 50-150 bp隨機的小片段，在無引物的條件下，進行PCR循環(huán)，各個片段互為模板和引物進行 DNA鏈的延長，逐漸重聚成新的全長基因，再使用基因兩側(cè)的引物擴增去掉信號肽的 ORF5基因，成功獲得了與預(yù)期片段相符的ORF5基因片段。通過測序進行序列篩選，獲得同時包含4株毒株 (FJZ03、FJ01、FJ03和FJ10) ORF5部分基因的重組△2ORF5基因。Western blotting和病毒感染抑制試驗結(jié)果表明重組蛋白多抗血清對親本 PRRSV具有較好的生物學(xué)活性，能夠與處于不同進化分支的親本毒株發(fā)生反應(yīng)，不僅可用于不同亞群的 PRRSV檢測，還為進一步研究新型PRRSV疫苗奠定基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1]Neumann EJ, Kliebenstein JB, Johnson CD, et al.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States. J Am Vet Med Assoc,2005, 227(3): 385–392.

[2]Zhou L, Yang HC. Porcine reproductive and respiratory syndrome in China. Virus Res, 2010, 154(1/2): 31–37.

[3]Prieto C, Castro JM. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in the boar: a review. Theriogenology, 2005, 63(1): 1–16.

[4]Tian KG, Yu XL, Zhao TZ, et al. Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark. PLoS ONE, 2007, 2(6): e526.

[5]Tong GZ, Zhou YJ, Hao XF, et al. Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, China.Emerg Infect Dis, 2007, 13(9): 1434–1436.

[6]Wei CH, Liu JK, Dai AL, et al. Molecular characterization of NADC30-like PRRSV isolate FJLY01 from Fujian. J Northwest A & F Univ: Nat Sci Ed, 2017, 45(3): 51–60, 67 (in Chinese).魏春華, 劉建奎, 戴愛玲, 等. 福建 NADC30-like PRRSV FJLY01株的全基因組分子特征分析. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2017, 45(3): 51–60, 67.

[7]Zhou L, Wang ZC, Ding YP, et al. NADC30-like strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus,China. Emerg Infect Dis, 2015, 21(12): 2256–2257.

[8]Liu JK, Zhou X, Zhai JQ, et al. Genetic diversity and evolutionary characteristics of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus in southeastern China from 2009 to 2014. Arch Virol, 2017,162(9): 2603–2615.

[9]Dea S, Gagnon CA, Mardassi H, et al. Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus:comparison of the North American and European isolates. Arch Virol, 2000, 145(4): 659–688.

[10]Wissink EH, Kroese MV, van Wijk HA, et al. Envelope protein requirements for the assembly of infectious virions of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol, 2005, 79(19): 12495–12506.

[11]Bastos RG, Dellagostin OA, Barletta RG, et al.Construction and immunogenicity of recombinantMycobacterium bovisBCG expressing GP5 and M protein of porcine reproductive respiratory syndrome virus. Vaccine, 2002, 21(1/2): 21–29.

[12]Vashisht K, Goldberg TL, Husmann RJ, et al.Identification of immunodominant T-cell epitopes present in glycoprotein 5 of the North American genotype of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vaccine, 2008, 26(36): 4747–4753.

[13]Stemmer WP. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly:in vitrorecombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(22):10747–10751.

[14]Cohen J. ‘Breeding’ antigens for new vaccines. Science,2001, 293(5528): 236–238.

[15]Vu HLX, Pattnaik AK, Osorio FA. Strategies to broaden the cross-protective efficacy of vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet Microbiol, 2017, 206: 29–34.

[16]Zhang Y, Wang HN, Huang Y, et al. DNA shuffling and its application on genetically engineering vaccines.Biotechnology, 2007, 17(3): 85–88 (in Chinese).張毅, 王紅寧, 黃勇, 等. DNA shuffling技術(shù)及其在基因工程疫苗中的應(yīng)用. 生物技術(shù), 2007, 17(3):85–88.

[17]Ma L, Li GX, Hong Q, et al. Preparation of polyclonal antiserum against recombinant NSP2 protein of PRRSV HH08 strain and study on biological functions of the polyclonal antiserum. Chin Vet Sci, 2013, 43(4):377–383 (in Chinese).馬玲, 李廣興, 洪琴, 等. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒HH08株 NSP2蛋白多克隆抗體的制備及其生物學(xué)功能的研究. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2013, 43(4): 377–383.

[18]Nielsen HS, Oleksiewicz MB, Forsberg R, et al.Reversion of a live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine investigated by parallel mutations. J Gen Virol, 2001, 82(6): 1263–1272.

[19]Jiang YF, Xia TQ, Zhou YJ, et al. Characterization of three porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates from a single swine farm bearing strong homology to a vaccine strain. Vet Microbiol, 2015,179(3/4): 242–249.

[20]Botner A, Strandbygaard B, Sorensen KJ, et al.Appearance of acute PRRS-like symptoms in sow herds after vaccination with a modified live PRRS vaccine.Vet Rec, 1997, 141(19): 497–499.

[21]Bai XF, Wang YZ, Xu X, et al. Commercial vaccines provide limited protection to NADC30-like PRRSV Infection. Vaccine, 2016, 34(46): 5540–5545.

[22]Ni YY, Opriessnig T, Zhou L, et al. Attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by molecular breeding of virus envelope genes from genetically divergent strains. J Virol, 2013, 87(1):304–313.

[23]Zhou L, Ni YY, Pi?eyro P, et al. Broadening the heterologous cross-neutralizing antibody inducing ability of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by breeding the GP4 or M genes. PLoS ONE, 2013,8(6): e66645.

[24]Tian DB, Cao DJ, Lynn Heffron C, et al. Enhancing heterologous protection in pigs vaccinated with chimeric porcine reproductive and respiratory syndrome virus containing the full-length sequences of shuffled structural genes of multiple heterologous strains.Vaccine, 2017, 35(18): 2427–2434.

[25]Tian DB, Ni YY, Zhou L, et al. Chimeric porcine reproductive and respiratory syndrome virus containing shuffled multiple envelope genes confers cross-protection in pigs. Virology, 2015, 485: 402–413.

[26]Zhou L, Ni YY, Pi?eyro P, et al. DNA shuffling of the GP3 genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) produces a chimeric virus with an improved cross-neutralizing ability against a heterologous PRRSV strain. Virology, 2012, 434(1):96–109.