王軍玲，魏配曉，邱緒建,2，翁武銀,2,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.廈門市海洋功能食品重點實驗室，福建 廈門 361021）

鮑魚作為一種營養(yǎng)豐富的單殼類海洋生物，是傳統(tǒng)的名貴食材，是海洋中氨基酸含量最全面，脂肪、膽固醇含量最低的生物之一，其肉味鮮美，鮮而不膩，清而味濃，位居“四大海味”之首，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值，目前在亞洲地區(qū)被廣泛養(yǎng)殖[1-2]。中國作為最大的鮑魚出產(chǎn)國，2015年鮑魚產(chǎn)量已經(jīng)突破了12萬 t[3]。為了進一步闡明鮑魚的藥用價值，有必要了解鮑魚中生理活性物質(zhì)的理化性質(zhì)及其活性，為鮑魚相關(guān)的功能性食品的開發(fā)提供理論參考。

多糖是鮑魚中重要的生理活性物質(zhì)之一。Li Guoyun等[4]從鮑魚中提取了一種具有良好的抗凝血活性的糖胺聚糖，其單糖組成及比例為GlcA∶GalN∶Fuc∶Gal=2.14∶2.37∶2.94∶1。Zhu Beiwei等[5]從鮑魚腹足中提取的中性多糖主要由1-、1,4-、1,6-、1,4,6-連接的葡萄糖以及1-、1,3-、1,6-、1,4,6-連接的半乳糖組成，但從鮑魚性腺中提取的多糖是硫酸基多糖，主要由半乳糖、巖藻糖、鼠李糖組成，且表現(xiàn)出了良好的羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性[6]。Zhu Beiwei等[7]還從鮑魚內(nèi)臟中提取了一種能夠誘導(dǎo)細胞分泌縮膽囊素釋放的硫酸基多糖。由此可以看出，從鮑魚不同部位提取的多糖具有不同的理化性質(zhì)，同時會表現(xiàn)出不同的生物活性。鮑魚肌肉作為鮑魚的主要可食部位，多糖含量達到了鮑魚（干）質(zhì)量的9.23%[1]。但是，目前關(guān)于鮑魚肌肉多糖（abalone muscle polysaccharide，AMP）理化性質(zhì)的研究以及對人體乳腺癌細胞和肝癌細胞的抑制活性還鮮有報道。

皺紋盤鮑是我國所產(chǎn)鮑中個體最大者，為鮑類上品，不僅個大體肥，肉細味鮮，而且營養(yǎng)豐富，被稱為“海味之冠”，是我國沿海鮑科最具經(jīng)濟價值的種類之一[8]。本研究通過蛋白酶酶解結(jié)合乙醇分級沉淀和DEAE-52柱層析分離獲得AMP，對AMP及其分離組分的化學(xué)組成、單糖組成、紫外光譜、紅外光譜、微觀結(jié)構(gòu)等理化性質(zhì)進行測定，還分析了各組分對人體肝癌細胞HepG2和乳腺癌細胞MDA-MB-231的抑制活性，為鮑魚功能性保健食品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮑魚（Haliotis discus hannai Ino）由廈門市東月嶼海洋食品有限公司提供，并于-20 ℃保存；胰酶（4 000 U/g）、膠原酶（300 000 U/g）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜酶（65 000 U/g） 南寧龐博生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（5-methyl-2-phenyl-1,2-dihydropyrazol-3-one，PMP） 美國Sigma公司；DEAE-52陰離子交換樹脂 上海源葉生物科技有限公司；HepG2細胞、MDA-MB-231細胞 云南昆明細胞庫；MTT細胞增殖檢測試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司；100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素 美國Corning公司；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM） 江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司；胎牛血清 以色列BioInd公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-8000A型紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；1200型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國賽默飛世爾科技公司；Avanti J-25離心機 美國Beckman公司；Thermo Scientific Forma 702二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；Series II Water Jaket 酶聯(lián)免疫檢測儀 美國BMG公司；S-4800掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 鮑魚肌肉粗多糖的制備

將鮑魚肌肉與水按照1∶2（g/mL）混合后搗碎，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心20 min后收集上清液。在獲得的上清液中同時加入上清液體積0.5 g/100 mL的胰酶和膠原酶，在pH 8.5、50 ℃條件下酶解4 h，然后將酶解液的pH值調(diào)整至6.0，加入上清液體積0.5 g/100 mL的木瓜酶，在50 ℃繼續(xù)酶解6 h。酶解液利用沸水浴滅活15 min，將離心（10 000 r/min，10 min）獲得的上清液用體積分數(shù)40%的乙醇溶液進行沉淀，4 ℃靜置12 h后5 000 r/min離心20 min，將上清液中乙醇體積分數(shù)調(diào)整至80%，4 ℃靜置12 h后5 000 r/min離心20 min，收集沉淀。沉淀用蒸餾水溶解后加入1 g/100 mL的活性炭進行吸附脫色，40 ℃水浴鍋中靜置1 h后，10 000 r/min離心10 min去活性炭。獲得的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后得到鮑魚肌肉粗多糖。采用稱質(zhì)量法測定AMP得率，計算公式如式（1）所示：

1.3.2 粗多糖的分離純化

AMP參照Li Shichao等[9]的方法利用DEAE-52陰離子交換柱進一步分離純化。柱層析的條件：柱規(guī)格為400 mm×16 mm，上樣質(zhì)量濃度為15 mg/mL，上樣體積為3 mL，流速為0.5 mL/min，流動相為0、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液，每管收集3 mL。采用苯酚-硫酸法于490 nm波長處隔管檢測溶液的吸光度，收集各組分峰，經(jīng)透析濃縮和乙醇沉淀，冷凍干燥后得鮑魚肌肉粗多糖的各純化組分。

1.3.3 化學(xué)組成分析

多糖的總糖含量用苯酚-硫酸法進行測定，以D-葡萄糖作為標準品[10]；蛋白含量用Lowry法進行測定，以牛血清蛋白為標準品[11]；糖醛酸含量用間羥基聯(lián)苯法進行測定，以D-葡萄糖醛酸為標準品[12]；硫酸基含量用氯化鋇-明膠比濁法進行測定，以K2SO4為標準品[13]。

1.3.4 紫外光譜分析

將鮑魚肌肉粗多糖及其純化組分分別用蒸餾水溶解，使其終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，以蒸餾水為空白對照，在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描，確定各多糖組分的特征吸收峰。

1.3.5 FTIR分析

取少量粉末樣品置于Thermo Nicolet iS50 FTIR儀上進行掃描，掃描的波長范圍為4 000～400 cm-1，光譜分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32 次。

1.3.6 單糖組成分析

單糖組成分析采用柱前衍生-高效液相色譜法[14]。將2 mg樣品置于具塞試管中，加入1 mL三氟乙酸溶液（2 mol/L）后在氮氣的保護下于110 ℃油浴鍋中水解6 h。水解液加入5 mL甲醇，在55 ℃旋干，重復(fù)3 次，最后用500 μL蒸餾水洗出。取100 μL標準品混合液或樣品水解液加入100 μL 0.3 mol/L的NaOH溶液和120 μL的0.5 mol/L的PMP溶液，混勻后在70 ℃水浴鍋中避光衍生1 h，室溫加入100 μL的0.3 mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)。衍生后的溶液中加入500 μL的氯仿萃取3 次，水相過0.22 μm的濾膜后取20 μL進行高效液相色譜分析。色譜條件：色譜柱為Atlantis?dC18column（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為25 ℃，流動相為pH 6.7的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L）-乙腈（83∶17，V/V），流速為0.5 mL/min，檢測波長為245 nm，單糖標準品為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖。

1.3.7 碘液顯色分析

AMP-1的碘液顯色分析按照宋根萍等[15]的方法進行，并稍作修改。將0.05 g淀粉和AMP-1分別溶于10 mL蒸餾水中，滴入數(shù)滴碘滴定液，混勻后觀察溶液的顏色變化。

1.3.8 SEM觀察

各多糖組分的表面形態(tài)采用SEM進行觀察。測定前，利用裝有硅膠的干燥器對各多糖組分抽真空干燥1 周以上，使其充分干燥。將干燥后的多糖樣品分別固定在樣品臺上，表面鍍金后利用SEM進行觀察，電子束的加速電壓為5 kV。

1.3.9 AMP及其分離組分對人類腫瘤細胞系抑制率的影響

HepG2細胞和MDA-MB-231細胞用含有10%胎牛血清、1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。HepG2細胞和MDA-MB-231細胞存活率參考Oh等[16]報道的方法進行測定。細胞以5×104/孔密度接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，培養(yǎng)液中加入不同濃度的多糖各組分繼續(xù)孵育48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，最后采用MTT法檢測細胞活性，每組樣品測定3 個平行，細胞存活率按式（2）計算：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 17.0軟件（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）對所得數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析，顯著性檢驗方法為Duncan多重檢驗，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的分離

經(jīng)蛋白酶酶解結(jié)合乙醇分級沉淀的方法從鮑魚肌肉中提取的AMP得率為0.9%（以干質(zhì)量計算），粗多糖的總糖質(zhì)量分數(shù)達到了83.9%。由圖1可以看出，經(jīng)DEAE-52陰離子交換柱層析分離后，用 0、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液洗脫后分別得到了AMP-1、AMP-2、AMP-3三個多糖組分，進一步提高NaCl濃度至1.0 mol/L時沒有多糖被洗脫下來，收集的3 個多糖組分對應(yīng)的得率分別為63.0%、8.6%和6.1%。AMP-1、AMP-2和AMP-3均為白色的粉末。

圖1 AMP的DEAE-52柱層析梯度洗脫曲線Fig.1 Stepwise elution curve of AMP on DEAE-52 cellulose column

2.2 化學(xué)組成分析結(jié)果

由表1可以看出，AMP總糖質(zhì)量分數(shù)達到了83.9%，明顯高于張月紅等[1]利用熱水提取法從鮑魚肌肉中提取的多糖（74.9%）；本研究提取的AMP中蛋白質(zhì)量分數(shù)僅為3.6%，表明蛋白酶解結(jié)合乙醇分級沉淀法提取多糖時可以除去大部分蛋白；AMP中僅含有少量的糖醛酸和硫酸基，表明AMP主要由中性多糖組成。

AMP經(jīng)DEAE-52柱層析分離后，隨著NaCl濃度的增加，所得組分中的多糖含量逐漸降低，而硫酸基和糖醛酸的含量卻逐漸增加（表1）。這是由于DEAE-52是陰離子交換柱，樣品中帶負電的離子不容易被洗脫下來的緣故。表1還表明，分離得到的AMP-1中的蛋白、硫酸基、糖醛酸含量均很低，是一種中性多糖，而AMP-2和AMP-3可能是糖蛋白，并含有一定量的糖醛酸和硫酸基。

表1 AMP及其分離組分的化學(xué)組成Table1 Chemical composition of AMP and its fractions%

2.3 單糖組成分析結(jié)果

由圖2可以看出，各單糖標準品經(jīng)PMP衍生化后可以很好地分離。鮑魚肌肉粗多糖主要由葡萄糖組成，其含量達到92.6%。然而，目前報道的AMP其單糖組成都比較復(fù)雜。Li Guoyun等[4]利用木瓜蛋白酶酶解結(jié)合十六烷基吡啶鎓溶液和乙醇沉淀的方法從青島的鮑魚腹足中提取的糖胺聚糖主要由葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、半乳糖和巖藻糖組成，而Zhu Beiwei等[5]利用木瓜蛋白酶酶解結(jié)合乙醇沉淀的方法從大連的鮑魚腹足中提取的中性多糖主要由葡萄糖和半乳糖組成。這些結(jié)果均不同于本實驗提取的AMP，這可能與鮑魚的產(chǎn)地、飼養(yǎng)條件以及多糖的提取方法有關(guān)?；瘜W(xué)組成（表1）及單糖組成（圖2）的結(jié)果表明AMP是一種的新型AMP。

粗多糖AMP經(jīng)DEAE-52柱層析分離后，AMP-1中的葡萄糖含量進一步增加，達到了99.3%，表明AMP-1是一種葡聚糖。這與Li Xia等[17]從扁玉螺中提取的多糖（98.3%）以及Qiao Deliang等[18]從三角帆蚌中提取的多糖（97.9%）類似，這可能與肌肉中的多糖主要以糖原的形式存在有關(guān)。與AMP-1相比，AMP-2和AMP-3的單糖組成比較復(fù)雜，AMP-2主要由葡萄糖、半乳糖和氨基葡萄糖組成，其對應(yīng)的比例依次為61.2∶14.3∶9.1，達到了總糖含量的84.6%。AMP-3主要由葡萄糖、半乳糖和氨基半乳糖組成，對應(yīng)的比例依次為33.4∶20.1∶10.7，達到了總糖含量的64.2%。Li Guoyun等[4]從鮑魚腹足中提取的多糖同樣含有較高含量的半乳糖和氨基半乳糖，其單糖組成及物質(zhì)的量比例依次為葡萄糖醛酸∶氨基半乳糖∶巖藻糖∶半乳糖=2.14∶2.37∶2.94∶1，但這與本實驗所提取的多糖的單糖組成仍然存在很大的差異，這可能與多糖的提取方法以及鮑魚的來源不同有關(guān)[19]。

圖2 AMP及其分離組分的單糖組成Fig.2 Monosaccharide composition of AMP and its fractions

2.4 碘液顯色分析

單糖組成的測定結(jié)果表明AMP-1是一種葡聚糖，所以通過碘液顯色反應(yīng)來判斷其是否具有普通淀粉的性質(zhì)，結(jié)果如圖3所示。AMP-1與碘液反應(yīng)沒有出現(xiàn)藍色顯色反應(yīng)，逐漸增加碘液用量也未出現(xiàn)藍色，但在同樣實驗條件下淀粉呈現(xiàn)明顯的藍色，表明AMP-1不是常見的淀粉[15]，由此證明AMP-1是一種非淀粉的葡聚糖。

圖3 AMP-1的碘液顯色圖片F(xiàn)ig.3 Iodine staining picture of AMP-1

2.5 紫外光譜結(jié)果分析

圖4 AMP及其分離組分的紫外掃描圖譜Fig.4 UV spectra of AMP and its isolated fractions

由圖4可以看出，AMP及其分離組分在190～200 nm范圍內(nèi)均出現(xiàn)了多糖的特征吸收峰，但是在相同的質(zhì)量濃度下，隨著多糖樣品中蛋白含量的增加（表1），樣品在190～200 nm范圍內(nèi)的紫外吸收逐漸增強，且最大吸收波長會發(fā)生紅移，這是因為200 nm附近不僅是糖的特征吸收，也可能是肽鍵的特征吸收，而且在195 nm附近蛋白的紫外吸收強于多糖[20-22]。除此之外，AMP-2和AMP-3在280 nm附近都出現(xiàn)了明顯的吸收峰，這有可能是酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸與多糖之間的共價結(jié)合導(dǎo)致的。

2.6 FTIR結(jié)果分析

如圖5所示，AMP在3 355 cm-1處的強吸收峰是O—H的伸縮振動峰，2 938 cm-1和1 416 cm-1處的吸收峰分別是C—H的伸縮振動峰和變角振動峰[9]，1 026～1 135 cm-1范圍內(nèi)的強吸收峰是C—O—C和C—O—H的伸縮振動峰，這幾組峰是多糖的特征吸收峰。1 668 cm-1處的吸收峰屬于C＝O的伸縮振動峰，而1 731 cm-1處的吸收峰屬于羧基的特征吸收峰，由圖5A可以看出，AMP中在1 731 cm-1處僅有一個很弱的吸收峰，表明AMP中僅含有少量的糖醛酸。與AMP相比，AMP-1在1 731 cm-1附近沒有出現(xiàn)吸收峰，而AMP-2和AMP-3在此處都具有明顯的吸收峰，這與表1中糖醛酸含量的測定結(jié)果一致。另外，與AMP相比，AMP-2和AMP-3在3 600～3 200 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的吸收峰發(fā)生了明顯的藍移，這可能是因為AMP-2和AMP-3中含有較高的蛋白質(zhì)和氨基糖，N—H的伸縮振動峰也在這個范圍內(nèi)，但N—H的伸縮振動峰低于O—H的伸縮振動峰導(dǎo)致的[23]。AMP-2和AMP-3分別在1 546 cm-1和1 544 cm-1波數(shù)處出現(xiàn)了明顯的N—H的變角振動吸收峰。AMP-3在1 223 cm-1處的吸收峰是＞S＝O的伸縮振動峰，由于其他組分中硫酸基含量較低，所以只有AMP-3在此處出現(xiàn)了明顯的吸收峰。值得注意的是，AMP和AMP-1分別在842 cm-1和853 cm-1處有一個明顯的吸收峰，表明AMP-1是一種α構(gòu)型的吡喃糖[24-25]，而AMP-1是AMP的主要組分，所以AMP在此處也出現(xiàn)了α-糖苷鍵的吸收峰。

圖5 AMP及其分離組分的傅里葉紅外圖譜Fig.5 FT-IR spectra of AMP and its isolated fractions

2.7 SEM觀察結(jié)果分析

圖 6 AMP及其分離組分的SEM圖Fig.6 SEM spectra of AMP and its isolated fractions

如圖6所示，在放大500 倍時，AMP和AMP-1呈現(xiàn)類似于片狀的結(jié)構(gòu)，且AMP-1更加緊密、光滑，這個片狀結(jié)構(gòu)類似于Xie Jianhua等[26]從青錢柳葉中提取的多糖，而AMP-2和AMP-3呈現(xiàn)不規(guī)則的團塊狀。在放大20 000 倍時，與AMP相比，AMP-1的表面更加簡潔和光滑，而AMP-2和AMP-3中可以觀察到不同規(guī)格的球型顆粒狀。據(jù)文獻報道，多糖經(jīng)硫酸化以后會出現(xiàn)多相卷積結(jié)構(gòu)，而單糖組成、分子間的相互作用力等都會影響到多糖的表面形態(tài)[26-28]，所以AMP-2和AMP-3的球狀結(jié)構(gòu)可能與多糖分子中含有的硫酸基、復(fù)雜的單糖組成以及多糖分子間的相互作用力有關(guān)。

2.8 AMP及其分離組分對人類腫瘤細胞系抑制率的影響

圖7顯示了AMP及其純化組分對人體肝癌細胞HepG2和乳腺癌細胞MDA-MB-231抑制率的影響。由圖7a可以看出，當樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，AMP對MDA-MB-231細胞的抑制率為16.9%，低于程婷婷等[29]從鮑魚臟器中提取的多糖在800 μg/mL時對HeLa細胞（18.54%）的抑制率，但高于多糖在800 μg/mL時對K562細胞（11.6%）的抑制率。而AMP-1、AMP-2、AMP-3在1 mg/mL時對MDA-MB-231細胞的抑制率分別為25.9%、0.7%、-8.5%。隨著培養(yǎng)液中多糖質(zhì)量濃度的增加，AMP和AMP-1對MDA-MB-231細胞的抑制率成上升趨勢，當多糖質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，抑制率分別達到了66.5%和71.6%。但是，AMP-2和AMP-3在1～4 mg/mL范圍內(nèi)對MDA-MB-231細胞均沒有表現(xiàn)出抑制活性，甚至對細胞生長有輕微的促進作用，AMP-2和AMP-3在8 mg/mL時對細胞的抑制率分別為25.8%和29.2%。He Rongjun等[30]從Edwardsia sipunculoides中提取的多糖對Du145癌細胞也表現(xiàn)出了低濃度促進，高濃度抑制的現(xiàn)象。各組分之間不同的抗腫瘤活性可能與測定的多糖、蛋白的含量以及單糖組成有關(guān)。

圖7 AMP及其分離組分對人體乳腺癌細胞MDA-MB-231（a）和肝癌細胞HepG2（b）抑制率的影響Fig.7 Inhibitory effects of AMP and its isolated fractions on human breast cancer MDA-MB-231 cells (a) and human liver cancer HepG2 cells (b)

由圖7b可以看出，隨著培養(yǎng)液中樣品質(zhì)量濃度的增加，AMP和AMP-1對HepG2細胞的抑制率呈上升趨勢，當樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，抑制率分別達到了72.6%和72.5%。但是，在1～8 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，AMP-2對HepG2細胞均未表現(xiàn)出明顯的抑制活性，且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加對細胞的促進作用呈上升趨勢，AMP-3對細胞的抑制率也沒有顯著影響。Wu Yiqian等[19]的研究也發(fā)現(xiàn)，鮑魚多糖的不同組分對HepG2細胞具有不同的作用，這可能與多糖組分的單糖組成有關(guān)。

AMP-1對兩種癌細胞都具有良好的抑制效果，根據(jù)化學(xué)組成、單糖組成、紫外光譜以及紅外光譜的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，AMP-1的生物活性可能與多糖的純度、單糖組成、糖苷鍵的構(gòu)型等有關(guān)，但是它的結(jié)構(gòu)特征對腫瘤細胞的抑制機制還有待進一步的研究。

3 結(jié) 論

鮑魚肌肉粗多糖主要由中性糖組成。AMP-1是一種葡聚糖，其構(gòu)型為α-吡喃糖，AMP-2和AMP-3含有較高的蛋白和少量的酸性基團，可能是糖蛋白。AMP和AMP-1對人體肝癌細胞HepG2和乳腺癌細胞MDA-MB-231均表現(xiàn)出了良好的抑制活性，這個結(jié)果表明AMP可以為抗腫瘤相關(guān)的功能性食品的開發(fā)提供一種新的選擇。

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