孫紅波，李 楊，王立敏，董濟(jì)萱，隋曉楠，齊寶坤，王中江，江連洲*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆蛋白作為一種高營(yíng)養(yǎng)高吸收率的全價(jià)植物蛋白，是我國(guó)居民日常膳食中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來(lái)源之一[1-2]，但天然蛋白質(zhì)難以滿足食品加工時(shí)的不同種需求。為拓寬其市場(chǎng)應(yīng)用，人們通過(guò)修飾大豆蛋白的結(jié)構(gòu)，提高蛋白質(zhì)的功能特性和生物活性。目前，蛋白質(zhì)的改性技術(shù)主要集中在物理改性和化學(xué)改性，如何找到一種健康營(yíng)養(yǎng)的天然改性技術(shù)一直是人們研究的重點(diǎn)[3]。事實(shí)上，生物小分子常與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，并影響著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能特性。花青素作為一種多酚類小分子物質(zhì)，是膳食中重要的營(yíng)養(yǎng)成分，有助于預(yù)防心腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)問(wèn)題等疾病，具有較高的蛋白親合力，并能夠改善食品中的風(fēng)味和質(zhì)地[4-5]。

現(xiàn)今部分文獻(xiàn)研究表明蛋白質(zhì)和多酚類物質(zhì)之間可通過(guò)非共價(jià)結(jié)合/共價(jià)交聯(lián)發(fā)生相互作用，其中，對(duì)多酚-蛋白質(zhì)非共價(jià)作用的研究主要集中在：大豆蛋白與槲皮素[6]、乳蛋白與天竺葵素[7]、牛奶蛋白與白藜蘆醇[8]、花青素與牛血紅蛋白[9]等。在共價(jià)相互作用中，多酚通常在堿性溶液中被氧化成醌，隨后與蛋白質(zhì)中巰基或氨基基團(tuán)結(jié)合發(fā)生不可逆的相互作用[10]。Jia Zhenbao等[11]分析了在堿性條件下，表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸經(jīng)共價(jià)修飾乳清分離蛋白，引起了蛋白的構(gòu)象和物化性質(zhì)變化。Prodpran等[12]研究了幾種酚類化合物與肌原纖維蛋白之間在pH值大于10時(shí)產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)，復(fù)合物中所添加的酚類化合物可以增強(qiáng)成膜的機(jī)械性能。

目前，已有文獻(xiàn)對(duì)多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用體系進(jìn)行了部分研究，但未能對(duì)比解析復(fù)合體系中共價(jià)及非共價(jià)作用對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，并且針對(duì)于大豆分離蛋白和花青素復(fù)合體系的研究尚屬不足。因此，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究不同質(zhì)量濃度的花青素（0.05、0.1、0.2 g/100 mL）與大豆分離蛋白（1 g/100 mL）之間通過(guò)非共價(jià)/共價(jià)作用形成的復(fù)合體系，明確對(duì)比非共價(jià)結(jié)合/共價(jià)交聯(lián)對(duì)大豆分離蛋白與花青素復(fù)合物之間的影響，詳細(xì)解析互作體系的結(jié)構(gòu)變化，以期為改性大豆分離蛋白在食品加工中的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白 實(shí)驗(yàn)室自制；葵花油 市購(gòu)；花青素黑米提取物 山西太極唐代科技有限公司；大豆哈爾濱高科技有限公司；花青素-3-葡萄糖苷標(biāo)品 大連美侖生物技術(shù)有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 北京新光化工試劑廠；正己烷、乙酸乙酯、甲醇（均為分析純） 天津北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型分析天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 中國(guó)上海雷磁公司；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；TU-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JJ-1增力電動(dòng)攪拌器 江蘇金城國(guó)勝儀器廠；Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；IRTracer-100傅里葉紅外光譜 日本島津公司；E2695高效液相色譜 沃特世科技（上海）有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳儀 東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

參考Wolf等[13]的制備方法，將新鮮大豆經(jīng)破碎脫脂，與正己烷（1∶3）（g/mL）混合并離心脫油，所得脫脂豆粕以1∶10（g/mL）溶于去離子水中，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值至8.5，經(jīng)45 ℃攪拌2 h，將其懸浮液經(jīng)9 500×g離心30 min，取其上清液用鹽酸（2 mol/L）調(diào)節(jié)溶液pH值至4.5，經(jīng)6 000×g 離心20 min得到蛋白沉淀物，將上述蛋白沉淀物水洗3 次后，經(jīng)6 500×g離心30 min，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性即可，將此蛋白溶液凍干并研磨，即可獲粉末狀的大豆分離蛋白。

1.3.2 花青素的純化與定量

根據(jù)Sui Xiaonan等[14]的方法對(duì)花青素進(jìn)行純化。首先將黑米提取物溶解在蒸餾水中除雜，將溶液流經(jīng)固相萃取柱使花青素被完全吸附，洗脫吸附柱以去除糖類和其他多酚類化合物（如酚酸和黃酮）等物質(zhì)，將酸化的甲醇溶液洗脫吸附柱得粗花青素溶液。將上述溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶液中的甲醇，即可得到純化的花青素提取物。利用高效液相色譜法測(cè)定花青素的含量[15]，將純化的花青素提取物經(jīng)0.45 μm濾膜通過(guò)C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行高效液相色譜系統(tǒng)分析，流量為1 mL/min，溫度為25 ℃，梯度洗脫程序參考Sadilova等[16]的方法，測(cè)定其花青素含量為25%（為方便計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一使用黑米中含量較多的矢車菊素-3-葡萄糖苷相對(duì)分子質(zhì)量為花青素的相對(duì)分子質(zhì)量近似處理）。

1.3.3 樣品的配制

參考Nagy等[17]的方法稍作修改，將大豆分離蛋白粉末溶于磷酸鹽緩沖液（10 μm，pH 7.4）中配制成質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的大豆分離蛋白溶液[18]，將花青素（0.05、0.1、0.2 g/100 mL）按比例分別溶于此蛋白溶液中，室溫條件下隔氧混合攪拌2 h，由此可得大豆分離蛋白-花青素非共價(jià)復(fù)合物。參考Jia Zhenbao等[11]的方法稍作修改，將大豆分離蛋白粉末溶于磷酸鈉緩沖液（10 μm，pH 7.4）中配制成質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的大豆分離蛋白溶液，將花青素（0.05、0.1 、0.2 g/100 mL）按比例分別溶于此蛋白溶液中，用NaOH溶液（0.5 mol/L）調(diào)節(jié)pH值至9.0，室溫條件下混合攪拌24 h，終止反應(yīng)調(diào)節(jié)pH值至7.4。由此可得大豆分離蛋白-花青素共價(jià)復(fù)合物。其中，未經(jīng)處理的大豆分離蛋白溶液作為空白對(duì)照，各樣品處理?xiàng)l件及編號(hào)見(jiàn)表1。

表1 花青素與大豆分離蛋白復(fù)合物樣品Table1 SPI-anthocyanins complexes

1.3.4 濁度測(cè)定

濁度分析參考Martini等[19]的方法稍作修改，將待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋后（樣品蛋白質(zhì)量濃度在5 mg/mL）倒入石英比色皿中，并利用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，在25 ℃條件下測(cè)量濁度值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次取平均值。

1.3.5 分子質(zhì)量的測(cè)定

使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定樣品的分子質(zhì)量，根據(jù)Laemmli等[20]的方法稍作修改。制備10%分離膠、5%濃縮膠，上樣質(zhì)量濃度1 mg/mL，將樣品與上樣緩沖液在90 ℃條件下混合并加熱5 min，在冷卻后進(jìn)行上樣，其上樣量為10 μL。電泳過(guò)程中維持80 V恒壓直至樣品跑至分離膠時(shí)改為120 V，電泳過(guò)程結(jié)束后用生物染色劑（考馬斯亮藍(lán)R-250）對(duì)凝膠進(jìn)行染色隨后洗脫，采用市售彩虹Marker作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.6 結(jié)合度的測(cè)定

確定復(fù)合物中花青素結(jié)合度及每毫克蛋白綁定花青素的含量。根據(jù)Rodríguez等[21]的方法稍作修改，首先制備花青素-3-葡萄糖苷的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所有樣品分別經(jīng)截留分子質(zhì)量為3 kDa的透析袋在4 ℃條件下進(jìn)行透析12 h，取其透析液適當(dāng)稀釋，以獲得其濃度值在制備的校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，用高效液相色譜法在波長(zhǎng)520 nm處測(cè)量樣品花青素吸光度并計(jì)算其含量，復(fù)合物中花青素結(jié)合度及花青素/蛋白百分比按公式（1）、（2）計(jì)算：

式中：R花青素為復(fù)合物中花青素綁定蛋白結(jié)合率/%；M總花青素為總花青素質(zhì)量/mg；M透析為透析液外未被綁定的游離花青素質(zhì)量/mg；R花青素/蛋白為每毫克大豆分離蛋白結(jié)合花青素的百分比/%；M蛋白為大豆分離蛋白質(zhì)量/mg。

1.3.7 熒光光譜分析

將樣品適當(dāng)稀釋，分別置于石英比色皿中，使用F-4500熒光光譜儀測(cè)定樣品的熒光光譜。其中，掃描發(fā)射波長(zhǎng)在300～500 nm之間，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析

紅外光譜測(cè)試采用KBr壓片法，稱取樣品1 mg，加入溴化鉀100 mg，壓片后在室溫記錄紅外光譜。設(shè)定掃描波數(shù)譜段范圍450～4 000 cm-1，分辨率設(shè)定為4 cm-1，掃描64 次，譜圖利用Peakfit Version軟件進(jìn)行處理。利用積分面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)組分的相對(duì)含量[22]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

實(shí)驗(yàn)中每組數(shù)據(jù)平均重復(fù)3 次，利用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖。利用SPSS V17.0軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析及相關(guān)性分析，其中P值小于0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 濁度分析

圖1 大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物的濁度Fig.1 Turbidity of SPI-anthocyanins complexes

濁度可以直觀地反映溶液中蛋白質(zhì)-花青素復(fù)合液中顆粒的分散狀態(tài)，同時(shí)可表達(dá)復(fù)合物的聚集狀態(tài)以及粒徑大小[23]，由圖1可知，非共價(jià)結(jié)合/共價(jià)交聯(lián)作用對(duì)大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物濁度的影響。隨花青素比例的增加，樣品1～6較空白樣品其濁度值都發(fā)生不同程度的增大，這可能是由于大豆分離蛋白經(jīng)非共價(jià)結(jié)合/共價(jià)交聯(lián)機(jī)制與花青素發(fā)生相互作用，改變蛋白部分結(jié)構(gòu)，使得粒徑發(fā)生不同程度的增大，蛋白質(zhì)分子上含有固定連接多酚分子的位點(diǎn)數(shù)，隨著多酚濃度的增加，當(dāng)兩者結(jié)合部位的數(shù)目趨于相等時(shí)，則可形成大量的復(fù)合物，濁度增大[24-25]。大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物中樣品4～6（pH 9.0、24 h；20∶1、10∶1、5∶1，m/m）的濁度值低于樣品1～3（pH 7.4、2 h；20∶1、10∶1、5∶1，m/m），這一結(jié)果與Wang Xiaoyang等[26]實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同，由于在堿性條件下，花青素被氧化成醌類物質(zhì)進(jìn)而與蛋白質(zhì)相互作用導(dǎo)致共價(jià)鍵的形成，從而改善復(fù)合物粒徑大小，降低溶液中與光線發(fā)生的漫反射。由此共價(jià)作用所形成的濁度值低于非共價(jià)作用所形成的濁度值。

2.2 結(jié)合度分析

圖2 大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物中結(jié)合分析圖Fig.2 Binding capacity of SPI-anthocyanins complexes

復(fù)合物經(jīng)透析后可以獲得未與蛋白質(zhì)相互作用的游離花青素，通過(guò)測(cè)定游離花青素的含量，進(jìn)而計(jì)算出花青素結(jié)合程度與花青素/大豆分離蛋白的百分比。通過(guò)圖2得知，經(jīng)共價(jià)交聯(lián)處理的樣品4～6（pH 9.0、24 h；20∶1、10∶1、5∶1，m/m）的結(jié)合度在90%～95%之間。相比之下，非共價(jià)結(jié)合處理的樣品1～3（pH 7.4、2 h；20∶1、10∶1、5∶1，m/m）結(jié)合度較小為64%～76%（圖2A）。非共價(jià)鍵主要包括范德華力、氫鍵、疏水作用力等，其鍵能弱于共價(jià)鍵，并且非共價(jià)作用是一種可逆的相互作用[17]，這可能導(dǎo)致復(fù)合物的非共價(jià)結(jié)合程度低于共價(jià)交聯(lián)程度。但無(wú)論共價(jià)/非共價(jià)作用，每毫克蛋白質(zhì)所綁定的花青素含量都隨花青素質(zhì)量濃度的增加而上升（圖2B），這一結(jié)果與Rodríguez等[21]的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象相吻合。值得注意的是樣品4（pH 9.0、24 h；20∶1，m/m）中的花青素/大豆分離蛋白百分比比樣品1（pH 7.4，2 h；20∶1，m/m）高出40.17%，樣品5（pH 9.0，24 h；10∶1，m/m）比樣品2（pH 7.4、2 h；10∶1，m/m）高出30.84%，結(jié)果表明隨著花青素質(zhì)量濃度的增加，共價(jià)鍵在所有復(fù)合物中具有比非共價(jià)鍵更強(qiáng)的親和性，更有效地形成大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物。此外，花青素與蛋白的結(jié)合能力與其相互作用模式等其他性質(zhì)有關(guān)[17]。

2.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

圖3 大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物的電泳圖譜圖Fig.3 SDS-PAGE prof i les of SPI-anthocyanins complexes

大豆分離蛋白受離心力場(chǎng)作用，根據(jù)沉降系數(shù)的差異分為4 種不同的蛋白質(zhì)沉淀物2S、7S、11S和15S[27]，其中7S（β-伴大豆球蛋白）和11S（大豆球蛋白）是大豆分離蛋白中的主要蛋白質(zhì)，根據(jù)蛋白亞基分子質(zhì)量的不同在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖中產(chǎn)生不同條帶分布，由此表達(dá)蛋白亞基的遷移能力[28]。如圖3所示，與未經(jīng)處理的蛋白相比，復(fù)合物中蛋白條帶寬度都有所下降，并且在樣品4～6（pH 9.0、24 h；20∶1、10∶1、5∶1，m/m）中分離膠上端出現(xiàn)了新的條帶，平均分子質(zhì)量約為180 kDa，此外分離膠頂部有黑色條帶印記，這種現(xiàn)象說(shuō)明有新的衍生物生成[29]。這可能是由于7S與11S蛋白被花青素經(jīng)共價(jià)交聯(lián)被部分綁定，從而形成較大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)復(fù)合物。這與Jia Zhenbao等[11]實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同。樣品1～3（pH 7.4、2 h；20∶1、10∶1、5∶1，m/m）中沒(méi)有新的條帶出現(xiàn)，僅降低了7S、11S蛋白含量，這意味著在pH 7.4、2 h處理?xiàng)l件下未生成共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，未改變蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.4 熒光光譜分析

熒光光譜可有效反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化[30]，常用于了解蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)復(fù)合的結(jié)合特性。由圖4可知，花青素加入后，蛋白最大吸收峰的熒光強(qiáng)度值均低于未處理的空白蛋白熒光強(qiáng)度，并且熒光強(qiáng)度隨花青素質(zhì)量濃度的增加而逐漸降低，這說(shuō)明花青素與大豆分離蛋白發(fā)生了相互作用。樣品1～6的λmax均發(fā)生紅移，表明復(fù)合物中大豆分離蛋白發(fā)生解折疊，并且蛋白經(jīng)花青素結(jié)合后其主要發(fā)色基團(tuán)Trp暴露于較為親水環(huán)境中，由此導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化[31-32]。復(fù)合樣品4～6（pH 9.0、24 h；20∶1、10∶1、5∶1，m/m）的熒光猝滅效果較樣品1～3（pH 7.4、2 h；20∶1、10∶1、5∶1，m/m）明顯，其結(jié)果表明共價(jià)交聯(lián)作用強(qiáng)度大于非共價(jià)結(jié)合作用，這可能是花青素與蛋白經(jīng)不可逆的共價(jià)作用大大降低了色氨酸含量，色氨酸含有自由氨基（—NH2），氨基與多酚類物質(zhì)上的C發(fā)生共價(jià)交聯(lián)生成C—N共價(jià)鍵。并且蛋白可能由于與花青素緊密結(jié)合使得部分發(fā)色基團(tuán)被掩蓋，降低蛋白熒光強(qiáng)度[11]。

圖4 大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物熒光光譜圖Fig.4 Emission fl uorescence spectra of SPI-anthocyanins complexes

2.5 紅外光譜分析

圖5 大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物傅里葉紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of SPI-anthocyanins complexes

傅里葉紅外光譜是一種用來(lái)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表征的光譜技術(shù)[33]。如圖5所示，蛋白質(zhì)酰胺I帶吸收峰的變化反映了蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化（1 700～1 600 cm-1）。根據(jù)己有研究表明，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與各子峰間的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：波數(shù)1 646～1 664 cm-1處對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)為α-螺旋；波數(shù)1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1處對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)為β-折疊；波數(shù)1 664～1 681 cm-1處對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)為β-轉(zhuǎn)角；波數(shù)1 637～1 645 cm-1處對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則卷曲[34]。

圖6 大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物中蛋白酰胺I帶的擬合圖譜Fig.6 Second-derivative FTIR spectra in the amide I region and Gaussian curve fi tting for soybean protein isolate in soybean protein isolates-anthocyanins complexes

采用Gauss面積法擬合，將復(fù)合樣品中大豆分離蛋白的酰胺I帶紅外譜圖進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)，可得大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物中蛋白酰胺I帶的擬合圖譜，見(jiàn)圖6；可計(jì)算得出蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的種類與含量[35]，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物中蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table2 Secondary structure contents of proteins in SPI-anthocyanins complexes

由圖5、6可知，復(fù)合物中的蛋白紅外光譜吸收強(qiáng)度有明顯變化，花青素的加入導(dǎo)致酰胺I帶吸收峰的強(qiáng)度降低，與空白蛋白，樣品1（pH 7.4、2 h；20∶1，m/m）、4（pH 9.0、24 h；20∶1，m/m）的酰胺I帶分別從1 624.78 cm-1藍(lán)移至1 630.97 cm-1和1 634.74 cm-1，波長(zhǎng)向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)，振動(dòng)能量增高。這表明添加花青素后蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的改變。復(fù)合物之間的相互作用可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化[36]。表2中，樣品1（pH 7.4、2 h；20∶1，m/m）與樣品4（pH 9.0、24 h；20∶1，m/m）的β-折疊相對(duì)含量分別降低到36.84%和18.01%，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量分別增加到31.95%和40.16%，無(wú)規(guī)則卷曲相對(duì)含量分別增加到22.40%和26.53%。這表明α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)逐漸向β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變，Hasni等[37]認(rèn)為蛋白質(zhì)的構(gòu)象可被多酚改變，主要是由于α-螺旋、β-折疊與β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲之間的含量轉(zhuǎn)換，此外，在堿性條件下大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物中β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量明顯提升，這進(jìn)一步表明對(duì)于復(fù)合物中的蛋白質(zhì)，共價(jià)交聯(lián)作用較非共價(jià)結(jié)合作用具有較強(qiáng)的解折疊能力，使得部分蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析與結(jié)合度測(cè)定方法探究了大豆分離蛋白-花青素復(fù)合體系中分子質(zhì)量分布及花青素對(duì)蛋白的綁定狀態(tài)，利用濁度測(cè)定手段分析了復(fù)合體系中顆粒的分散狀態(tài)，再通過(guò)熒光光譜及紅外光譜測(cè)定方法從微觀上解析了復(fù)合體系中蛋白結(jié)構(gòu)變化。由此研究得出以下結(jié)論：

結(jié)合度測(cè)定、凝膠電泳分析等實(shí)驗(yàn)表明，在電泳圖譜中樣品4～6（20∶1、10∶1、5∶1，m/m）在pH 9.0、24 h處理?xiàng)l件下有大分子衍生物生成，由此說(shuō)明在此條件下形成共價(jià)交聯(lián)；每毫克蛋白質(zhì)所綁定的花青素含量都隨花青素質(zhì)量濃度的增加而增大，且共價(jià)鍵在所有復(fù)合物中具有比非共價(jià)鍵更強(qiáng)的親和特性。

隨花青素的加入，大豆分離蛋白經(jīng)非共價(jià)結(jié)合/共價(jià)交聯(lián)機(jī)制與花青素發(fā)生相互作用，蛋白部分結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，復(fù)合體系中粒徑發(fā)生不同程度的增大。在pH 7.4、2 h和pH 9.0、24 h處理?xiàng)l件下，樣品濁度值均高于空白蛋白樣品，且樣品4～6（20∶1、10∶1、5∶1，m/m）的濁度值低于樣品1～3（20∶1、10∶1、5∶1，m/m），這可能是共價(jià)聚合可改善復(fù)合物粒徑大小從而降低復(fù)合物光漫反射。

熒光光譜圖中表明隨著花青素含量的增大，復(fù)合物溶液的熒光強(qiáng)度明顯降低。蛋白質(zhì)與花青素之間的相互作用不斷增強(qiáng)，使得發(fā)色基團(tuán)被不斷猝滅，其中不可逆的共價(jià)作用猝滅能力強(qiáng)于非共價(jià)作用；在pH 7.4、2 h和pH 9.0、24 h 處理?xiàng)l件下，低花青素比例（20∶1，m/m）大豆分離蛋白-花青素復(fù)合物的紅外吸收光譜強(qiáng)度與空白蛋白樣相比均發(fā)生明顯變化，這表明復(fù)合物中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且樣品4在pH 9.0、24 h處理?xiàng)l件下β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量高于樣品1（pH 7.4、2 h），由此推測(cè)共價(jià)交聯(lián)機(jī)制中蛋白多肽鏈的解折疊能力較強(qiáng)。

以上結(jié)果為大豆分離蛋白-花青素復(fù)合體系中的非共價(jià)/共價(jià)作用對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響提供了部分參考，為多酚類物質(zhì)與植物蛋白復(fù)合產(chǎn)品等食品加工過(guò)程的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

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