丁 一,鄭靜晨,張仲文

軟骨修復(fù)技術(shù)是當(dāng)今骨科和運動醫(yī)學(xué)的研究熱點。自體軟骨細(xì)胞移植(autologous chondrocyte implantation ，ACI)[1,2]等組織工程技術(shù)的療效較為確切[3]，因而備受矚目。纖維蛋白凝膠型自體軟骨細(xì)胞移植(fibrin matrix-mixed gel-type ACI, G-ACI)是一種新型第三代ACI技術(shù)，凝膠基質(zhì)可支持軟骨細(xì)胞的擴(kuò)增、遷移，構(gòu)成支架成分，其形成透明樣軟骨的成功率高于傳統(tǒng)ACI技術(shù)[4]。G-ACI手術(shù)操作便捷，不受缺損部位、形狀、深度所限[5]。目前，G-ACI在歐洲、韓國等地已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段，短期隨訪療效好[5-7]。本團(tuán)隊首次在國內(nèi)開展了G-ACI手術(shù)，現(xiàn)將手術(shù)技術(shù)和短期隨訪結(jié)果報告與討論如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 根據(jù)國際軟骨修復(fù)協(xié)會( ICRS) 指南，我科選取1例女性48歲右膝骨軟骨損傷患者作為國內(nèi)首例在2016-04-18接受G-ACI手術(shù)的患者。該患者右膝髕股關(guān)節(jié)對吻傷，髕骨軟骨大面積缺損, 股骨內(nèi)髁小部分缺損，均為Outerbridge/ICRS Ⅲ-Ⅳ度?；颊吆炇鹆酥橥鈺R床研究按照赫爾辛基宣言和中國倫理進(jìn)行。

1.2 手術(shù)方法

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備 膝關(guān)節(jié)正側(cè)位X線片，測量下肢力線和Q角；術(shù)前進(jìn)行MRI檢查和KOOS評分。

1.2.2 關(guān)節(jié)鏡下活檢 在硬膜外麻醉下施行患膝關(guān)節(jié)鏡檢查，術(shù)中探查半月板，如有病變，則對其進(jìn)行相應(yīng)治療。采集患膝非負(fù)重區(qū)健康關(guān)節(jié)軟骨約 50 mg，放入培養(yǎng)液，送實驗室(武警總醫(yī)院細(xì)胞實驗室，GMP標(biāo)準(zhǔn))分離培養(yǎng)。軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1.2×107/vial，超過活性80%[5]。軟骨組織收集工作需要在二次手術(shù)前6周完成。

1.2.3 G-ACI手術(shù) 手術(shù)在硬膜外麻醉下進(jìn)行，采用髕旁內(nèi)側(cè)入路顯露膝關(guān)節(jié)，外翻髕骨后可見髕骨和股骨內(nèi)髁的缺損區(qū)域。刮匙刮除剝脫及病變的軟骨至正常組織，深度達(dá)軟骨下骨，修整軟骨缺損創(chuàng)面為近似圓形或橢圓形。為了確保手術(shù)效果，用2.5 mm鉆頭在缺損區(qū)域制作數(shù)個深度5 mm的骨道，將2 ml細(xì)胞混懸液(細(xì)胞活性85%)，與纖維蛋白、凝血酶通過雙聯(lián)注射器注射到缺損部位，5 min后，凝膠硬化[5]，逐層關(guān)閉傷口，佩戴支具鎖至0 °，手術(shù)時間45 min。

1.2.4 術(shù)后康復(fù) 術(shù)后2周內(nèi)不能下垂小腿，2周后進(jìn)行CPM訓(xùn)練，起始角度60°，至8周增至120°，術(shù)后6～8周扶拐下地，術(shù)后8～10周脫拐[6]。

1.2.5 隨訪 在術(shù)后3、6、12個月進(jìn)行KOOS 評分，在術(shù)后1、3、6、12個月時進(jìn)行MRI 檢查。所有 MRI 檢查均在武警總醫(yī)院核磁共振科完成，采用3.0T MRI進(jìn)行T1Vibe和T2Mapping掃描。

1.3 評估方法 采用Trattnig標(biāo)準(zhǔn)評估MRI軟骨組織修復(fù)情況，包括：(1)缺損部位的填充程度;(2)與周邊軟骨的整合;(3)修復(fù)組織的信號強(qiáng)度;(4)軟骨下骨和骨髓的情況。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 術(shù)前X線片示下肢力線正常，無明顯內(nèi)外翻。術(shù)前MRI示髕骨軟骨損傷軟骨變薄，內(nèi)髁軟骨損傷，未發(fā)現(xiàn)除軟骨損傷之外的疾病。據(jù)術(shù)中測量，患者右膝髕骨軟骨缺損面積1.8 cm×3.0 cm, 股骨內(nèi)髁缺損面積0.5 cm×0.5 cm，Outerbridge/ICRS Ⅲ-Ⅳ度損傷(圖1)。

圖1 關(guān)節(jié)鏡下與二次手術(shù)照片

A，D.活檢術(shù)中關(guān)節(jié)鏡下所見，分別示髕骨大范圍軟骨缺損，橫向、深達(dá)軟骨下骨，股骨內(nèi)髁小范圍軟骨缺損，深達(dá)軟骨下骨；B，E.二次手術(shù)清創(chuàng)后測量髕骨、內(nèi)髁區(qū)域缺損面積；C，F(xiàn).凝膠注射后，用刮匙探及硬度

2.2 MRI檢查

2.2.1 T2Mapping 患者術(shù)后6、12個月和1.5年的T2Mapping MRI顯示，缺損區(qū)域的mapping值逐漸降低(圖2)，由術(shù)前的71降至40。

圖2 G-ACI術(shù)后T2 Mapping MRI 變化

T2Mapping中，成熟的透明軟骨顯示為偏藍(lán)色，新生軟骨信號為綠色，黃色和紅色代表變性或損傷；A.患者在G-ACI術(shù)前的軟骨T2Mapping信號異常；B.G-ACI術(shù)后12個月的Mapping值顯著下降，為不成熟軟骨信號；C.術(shù)后1.5年的軟骨信號區(qū)趨于正常

2.2.2 T1Vibe MRI示患者術(shù)后6個月的T1Vibe MRI顯示髕骨和內(nèi)髁區(qū)域的移植物附著牢固，可見類似新生軟骨的移植物信號，骨髓水腫依然存在；術(shù)后12個月，移植區(qū)域的軟骨層逐漸增厚，軟骨信號稍顯不均，骨髓水腫減輕；至術(shù)后1.5年，髕骨和股骨內(nèi)髁的缺損已被移植的軟骨細(xì)胞填平，軟骨厚度基本恢復(fù)正常水平，骨髓水腫信號消失(圖3)。

圖3 術(shù)前與術(shù)后軟骨缺損處的MRI

Pre O為術(shù)前，Po 6 mon為G-ACI術(shù)后6個月，Po 1為G-ACI術(shù)后12個月，Po 1.5為G-ACI術(shù)后1.5年

2.3 KOOS評分 患者術(shù)前的KOOS評分是51.4(表1)，而術(shù)后6、12個月，1.5年時的KOOS評分各項均呈逐漸增高的趨勢，患者的主觀感受改善最快發(fā)生在術(shù)后6～12個月，此期間各項指標(biāo)增幅最大，至術(shù)后1.5年KOOS評分已達(dá)到79.6分(表1)。在KOOS評分的各項中，改善程度最大的是癥狀方面，程度最小的是日?；顒臃矫妗?/p>

表1 術(shù)前與術(shù)后不同時期的KOOS評分對比

3 討 論

G-ACI屬于新研制的第三代ACI技術(shù)，以纖維蛋白和凝血酶反應(yīng)形成的凝膠聚合物為基質(zhì)，在軟骨損傷部位以注射填充的方式進(jìn)行自體軟骨細(xì)胞移植。纖維蛋白凝膠的生物相容性和生物降解性很好，無毒副作用，近些年來逐漸成為各種軟骨再生技術(shù)中的熱門載體[9]。與MACI等常規(guī)第三代ACI技術(shù)相比，省去了修剪膜片、貼合等復(fù)雜步驟，增強(qiáng)了移植物的附著，因此手術(shù)暴露更小，可微創(chuàng)操作。纖維蛋白原和凝血酶的比例決定了凝膠的凝固時間[10]，本例凝膠凝固時間為5 min。G-ACI技術(shù)中的纖維蛋白凝膠亦構(gòu)成了負(fù)載移植細(xì)胞的3D支架，可支持軟骨細(xì)胞的擴(kuò)增、遷移[6,11]。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在纖維蛋白凝膠中培養(yǎng)72 h的細(xì)胞活力在90%以上，且依然保持軟骨細(xì)胞的表型，其在凝膠支架中均勻分布[6]。通常認(rèn)為，移植后的軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力與細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，更高的細(xì)胞數(shù)將獲得更優(yōu)質(zhì)的軟骨，G-ACI技術(shù)可移植1.2×107的細(xì)胞，因此理論上講G-ACI比MACI具有更好的療效。動物實驗中，G-ACI形成透明樣軟骨的成功率高于傳統(tǒng)ACI技術(shù)[4]，因此G-ACI具有良好的應(yīng)用前景。近年來，G-ACI技術(shù)在歐洲、韓國等地已逐步在臨床中應(yīng)用于膝、踝關(guān)節(jié)全層軟骨損傷的治療中，短期隨訪取得了理想的療效[5-7]。韓國一項臨床研究對30位股骨內(nèi)髁軟骨深層缺損的病例進(jìn)行G-ACI手術(shù)，平均年齡35歲(15～55歲)，軟骨損傷的面積平均為5.8 cm2，術(shù)后12個月關(guān)節(jié)鏡復(fù)查見軟骨修復(fù)理想，大多恢復(fù)至Outerbridge/ICRS Ⅱ級，術(shù)后2年的MRI顯示缺損區(qū)被新生軟骨填充[11]。據(jù)荷蘭科學(xué)家報道，對膝關(guān)節(jié)軟骨平均缺損面積為9 cm2，平均年齡35歲患者的19例患者進(jìn)行G-ACI手術(shù)后的兩年隨訪結(jié)果顯示患者的主觀改善效果良好[7]。本次選擇的病例符合既往報道G-ACI適用的范圍，因此推測術(shù)后隨訪和臨床療效可預(yù)期取得滿意的結(jié)果。

3.0 MRI可清晰的顯示移植的軟骨細(xì)胞的再生和修復(fù)情況[8]。國際軟骨修復(fù)學(xué)會影像組認(rèn)為，MRI可獲得質(zhì)量較好的軟骨影像，F(xiàn)S 3D vibe T1W 是一種用來觀察軟骨的特殊序列，通過增加關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的對比，使軟骨顯示更清晰，有利于觀察和精確評價關(guān)節(jié)軟骨微小病變，對軟骨損傷具有較高診斷價值[12]。本研究中采用FS 3D vibe T1W序列來評價軟骨修復(fù)情況，術(shù)后T1Vibe MRI演變清晰的顯示了軟骨再生和修復(fù)的動態(tài)過程。通常在ACI術(shù)后的早期，新生的軟骨細(xì)胞不能完全填充缺損區(qū)[12]，我們在術(shù)后6個月僅能在缺損區(qū)觀察到不均勻的新生軟骨信號。至術(shù)后12個月，移植的軟骨細(xì)胞已基本填滿缺損區(qū)，軟骨厚度幾乎恢復(fù)到正常水平，提示新生軟骨的形成，同時骨髓水腫減輕，這與本團(tuán)隊之前的研究結(jié)果相一致[12,13]，新生的軟骨信號不均，在適宜的體內(nèi)環(huán)境中，這些軟骨組織將進(jìn)一步成熟并改建，最終形成成熟的透明樣軟骨。術(shù)后1.5年，軟骨厚度已經(jīng)達(dá)到正常水平，信號趨于均勻，骨髓水腫消失，提示相對成熟的軟骨再生。

T2Mapping 即軟骨弛豫時間圖[14]，通過測量軟骨T弛豫時間(T2Mapping 值)，量化各種生理和病理情況下的軟骨信號改變，間接反映軟骨基質(zhì)含水量、膠原纖維方向和含量、蛋白聚糖含量的改變。目前，T2Mapping已廣泛用于ACI術(shù)后，評價新生軟骨的生化性質(zhì)和軟骨成分與結(jié)構(gòu)的修復(fù)情況[14]，T2Mapping中，成熟的透明軟骨含水量少，Mapping值低，顯示為藍(lán)色，損傷或變性時，Ⅱ型膠原發(fā)生退變，纖維的形態(tài)和排列方式改變，對水的通透性增加，同時膠原網(wǎng)架的斷裂使蛋白多糖分散展開，暴露出更多的陰離子, 進(jìn)一步增加了含水量，導(dǎo)致Mapping值增高，表現(xiàn)為黃色或橙紅色。2例在術(shù)后，T2Mapping 值均較之前顯著降低，藍(lán)色部分增多、橙紅色部分減少，提示G-ACI術(shù)后軟骨組織的修復(fù)和改建。由于不同年齡、不同負(fù)重部位的Mapping值不同，內(nèi)髁負(fù)重區(qū)的值要低于髕骨軟骨，青年人關(guān)節(jié)軟骨的Mapping值低于中老年人。因此，本例中采用自身前后對照的方法來評價T2Mapping值的變化?；颊咝g(shù)前的T2Mapping顯示其軟骨損傷較嚴(yán)重，但在術(shù)后12個月時其Mapping比之前降低了近30%，同時患者主觀KOOS評分也較術(shù)前明顯提高，提示這一階段已經(jīng)開始了軟骨再生和修復(fù)過程。術(shù)后1.5年時的Mapping值進(jìn)一步下降，但仍不屬于正常值范圍，分析其原因可能有以下兩點:(1)患者為中老年，軟骨細(xì)胞活力略低于青年個體，因此軟骨修復(fù)比較慢；(2)女性患者在ACI術(shù)后的主觀評分和MRI表現(xiàn)要明顯低于男性，尤其是有髕骨軟骨損傷的女性患者，其具有更低的主觀評分和MRI表現(xiàn)[15]。

KOOS 評分是一項主觀評分。在患者術(shù)后的1.5年之內(nèi)，其KOOS 評分的各項總體呈升高趨勢，患者較為明顯的主觀改善發(fā)生在術(shù)后6～12個月期間，此時各項指標(biāo)分值的增幅最快，其中改善程度最大的是癥狀方面，且患者自述疼痛癥狀好轉(zhuǎn)明顯，改善程度最小的是日常活動方面，可能是患者主訴的伸膝無力限制活動水平。術(shù)后1.5年時所有指標(biāo)進(jìn)一步改善，但日?；顒臃矫娴母纳埔廊槐绕渌猪椀?，這可能與文獻(xiàn)報道的女性患者ACI術(shù)后主觀評分較低有關(guān)[15]。在荷蘭G-ACI術(shù)后隨訪兩年的研究中也發(fā)現(xiàn)了日常活動方面改善也不明顯的現(xiàn)象[7]。分析其原因可能與軟骨損傷后的恐懼性心理有關(guān)，患者由于害怕再次受傷而不愿主動運動，這提示術(shù)后針對患者的心理特點進(jìn)行心理輔導(dǎo)將可能會促進(jìn)康復(fù)進(jìn)程。

綜上所述，G-ACI是一種新型第三代ACI技術(shù)，其操作簡便快捷，不受缺損部位、形狀、深度所限。利用G-ACI技術(shù)治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的短期療效理想，安全性佳，術(shù)后MRI可見軟骨再生和修復(fù)，同時患者的主觀評分顯著提高。因此，利用G-ACI技術(shù)治療軟骨損傷具有在國內(nèi)臨床應(yīng)用的優(yōu)勢和前景。

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