竇為娟 盧穎輝 唐 蓉 周敏林 賀 貝 尹 茹 朱 萍 曾彩虹 劉志紅 鄭春霞

生物樣本庫(kù)為醫(yī)學(xué)研究提供了重要資源，高質(zhì)量的冷凍樣本是進(jìn)行基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等研究的最基本要求。疾病的復(fù)雜病因?qū)W是一個(gè)挑戰(zhàn)，遺傳易感性、生活方式及環(huán)境都可能對(duì)疾病的發(fā)展有影響。隨著醫(yī)學(xué)水平的發(fā)展，一些新基因逐漸被發(fā)現(xiàn)，以及一些已知基因新功能的確定，需要重新對(duì)某類患者進(jìn)行大規(guī)模基因組學(xué)研究，因此要收集成千上萬份的血液或組織樣本，這些樣本可能于生物樣本庫(kù)中已經(jīng)保存了很多年[1-2]。從臨床診斷到基因組學(xué)研究，血液樣本是最常用的提取DNA材料之一，能否從血液樣本中提取到高質(zhì)量的DNA是限制后續(xù)基因組學(xué)研究成功的關(guān)鍵。樣本的質(zhì)量直接影響后續(xù)研究的準(zhǔn)確性和科學(xué)性[3-5]。

血液樣本中DNA通常以全血、血細(xì)胞、白膜層、血單個(gè)核細(xì)胞、血凝塊這五種形式保存，關(guān)于不同形式之間保存效果比較的報(bào)道較少見。有研究指出DNA的保存形式應(yīng)根據(jù)研究需要來選擇[6-7]，然而在實(shí)際操作中，還需要考慮到樣本采集量是否節(jié)約，收集是否便利快捷，樣本能否被充分利用，以及保存空間和成本等因素。10年前我們樣本庫(kù)采用抗凝血分離出血細(xì)胞的形式保存DNA，并將吸取的上層血漿同時(shí)進(jìn)行凍存，這種保存方法使得血液樣本充分利用，并減少患者采血量和中間人為操作環(huán)節(jié)。本研究通過檢測(cè)保存10年以上血細(xì)胞樣本抽提DNA的純度、產(chǎn)量及完整性，明確長(zhǎng)期低溫保存的血細(xì)胞樣本DNA能否用于后續(xù)全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)、外顯子測(cè)序等基因組學(xué)研究。

材料與方法

樣本來源南京總醫(yī)院國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心生物樣本庫(kù)中保存10年以上(11～13年，保存時(shí)間為2004～2006年，于2017年提取DNA)的150份血細(xì)胞樣本。所有樣本均為清晨采集空腹外周靜脈血3 ml于EDTA抗凝管中，靜置30 min后，室溫離心(1 000 r/min，10 min)，吸取上層血漿轉(zhuǎn)移至2 ml凍存管中，以便用于其他研究，再將剩余的血細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移至2 ml凍存管中，并立即凍存于-80℃超低溫冰箱。從血液采集到存入冰箱的時(shí)間≤8 h，保存期間，冰箱溫度設(shè)置為-80℃，溫度維持在-60～-80℃之間，所有用于檢測(cè)DNA的血細(xì)胞樣本均未經(jīng)過凍融。所有患者血液樣本的保存和使用均經(jīng)過南京總醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

檢測(cè)方法

DNA抽提 所有血細(xì)胞樣本均在室溫下解凍，然后用生理鹽水將血細(xì)胞容量補(bǔ)足至3 ml。檢查有無血凝塊。采用PerkinElmer與Hamilton公司聯(lián)合提供的全自動(dòng)核酸提取儀及其配套的DNA提取試劑盒(Chemagic DNA Blood Kit，CMG-1073)。DNA抽提利用磁珠法原理，并遵循保證核酸一級(jí)分子結(jié)構(gòu)的完整性及排除其他分子污染的原則，提取純化DNA。DNA洗脫液為10 mMTris-HCl pH 8.0，體積為800 μl。

DNA純度及產(chǎn)量測(cè)定 取1 μl DNA樣品，采用微量紫外分光光度儀Nanodrop2000(Thermo Scientific)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)A260/A280、A260/A230及DNA濃度，再根據(jù)濃度和溶解體積計(jì)算出所得DNA產(chǎn)量。通常1.7≤A260/A280≤1.9，并且A260/A230≥2.0被認(rèn)為是反映DNA純度的理想標(biāo)準(zhǔn)。DNA產(chǎn)量≥10 μg則足以用于基因組學(xué)研究。A260/A230用來反映影響DNA純度的其他污染物，若比值<2.0則說明可能存在鹽離子等雜質(zhì)的殘留。

DNA完整性測(cè)定 取200 ng DNA樣品上樣，L2000 DNA marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)，80 V恒定電壓電泳30 min，0.8%溴化乙啶染色，SIM凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相并保存。泳道口中如果存在較亮的條帶，提示有蛋白污染。DNA 電泳條帶最前面如果有較小的條帶，提示存在 RNA 污染。條帶彌散、拖尾，提示DNA有降解。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有樣本DNA測(cè)得的A260/A280、A260/A230及總量均以均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS 23.0對(duì)樣本來源患者采集樣本時(shí)的白細(xì)胞數(shù)量及樣本DNA產(chǎn)量間采用雙變量相關(guān)分析,pearson相關(guān)系數(shù)>0.7表示強(qiáng)相關(guān)，0.4～0.7中度相關(guān)，<0.4表示弱相關(guān)。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果sig(雙側(cè))P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有意義，兩者相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；sig(雙側(cè))P>0.0.5表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著，兩者相關(guān)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該相關(guān)可能是由于抽樣誤差等其他因素所致。

結(jié) 果

所有血細(xì)胞樣本提取DNA的A260/A280均數(shù)是1.84，該值在1.7～1.9范圍內(nèi)，表明所提取的DNA純度高；所有樣本DNA的A260/A230均數(shù)是2.27，該值>2.0，表明所提取的DNA污染較少；所有樣本DNA產(chǎn)量均數(shù)是187.57 μg，該值>10 μg，表明所提取的DNA量足以用于基因組學(xué)研究(表1)。150份樣本凝膠電泳均可見DNA條帶比較集中，未見彌散分布，分子量均≥20 kb(圖1)。

表1 血細(xì)胞樣本抽提DNA的情況

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性A:1～18為DNA 1.7≤A260/A280≤1.9且A260/A230≥2.0的代表性樣本凝膠條帶；B：1～4為DNA產(chǎn)量≥10μg，A260/A280<1.7或A260/ A 280>1.9，A260/A230≥2.0的所有凝膠條帶；5～11為DNA產(chǎn)量≥10μg，A260/A280<1.7或A260/ A 280>1.9，A260/A230<2.0的所有凝膠條帶；12為DNA產(chǎn)量<10μg，1.7≤A260/A280≤1.9，A260/A230≥2.0的凝膠條帶；13為DNA產(chǎn)量<10μg，1.7≤A260/A280≤1.9，A260/A230<2.0的凝膠條帶;14為DNA產(chǎn)量<10μg，A260/ A 280>1.9，A260/A230≥2.0的凝膠條帶；15～18為DNA產(chǎn)量<10μg，A260/A280<1.7或A260/A 280>1.9，A260/A230<2.0的凝膠條帶;M：DNA marker

150份血細(xì)胞樣本抽提的DNA中，134份1.7≤A260/A280≤1.9，占89.3%；120份A260/A230≥2.0，占80%；115份1.7≤A260/A280≤1.9且A260/A230≥2.0，占76.7%；19份1.7≤A260/A280≤1.9且A260/A230<2.0，占12.7%；2份A260/A280<1.7且A260/A230≥2.0，占1.3%；3份A260/A280>1.9且A260/A230≥2.0，占2%；6份A260/A280<1.7且A260/A230<2.0，占4%；5份A260/A280>1.9且A260/A230<2.0，占3.3%(圖2)。

圖2 150份血細(xì)胞樣本抽提DNA的純度分析

143份DNA產(chǎn)量≥10 μg，占95.3%。1.7≤A260/A280≤1.9且DNA產(chǎn)量≥10μg的血細(xì)胞樣本有132份，占88%。1.7≤A260/A280≤1.9、A260/A230≥2.0且DNA產(chǎn)量≥10μg的血細(xì)胞樣本有114份，占76%。

DNA產(chǎn)量≥10 μg的143份血細(xì)胞樣本純度分析見圖3。

圖3 143份DNA產(chǎn)量≥10 μg樣本純度分析

DNA產(chǎn)量<10 μg的7份血細(xì)胞樣本中，最低產(chǎn)量為5.2 μg。具體樣本純度分析見圖4。

患者白細(xì)胞數(shù)量與DNA產(chǎn)量相關(guān)分析，顯示白細(xì)胞數(shù)量與DNA產(chǎn)量間無相關(guān)性(P>0.05)。

圖4 7份DNA產(chǎn)量<10 μg樣本純度分析

討 論

關(guān)于血液樣本經(jīng)過長(zhǎng)期低溫保存后抽提的DNA是否能滿足研究需要，目前報(bào)道并不多見。國(guó)際上對(duì)于不同來源樣本抽提的DNA目前并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來衡量，是否可用于后續(xù)研究取決于該研究對(duì)DNA產(chǎn)量、純度和完整性的要求。事實(shí)上，如果DNA產(chǎn)量≥10 μg，A260/A280在1.7～1.9之間，A260/A230≥2.0，凝膠電泳沒有降解條帶，則認(rèn)為可滿足任何分子或基因組檢測(cè)。

早在十年前，國(guó)內(nèi)就有單位將不同種類的血液以不同方式保存起來，用于今后相關(guān)DNA的研究。2000年有報(bào)道表明保存在-20℃的全血中提取的DNA質(zhì)量及產(chǎn)量均較高，且保持著高度完整性[8]。Visvikis等[9]報(bào)道短期(1年內(nèi))和長(zhǎng)期(5～6年)保存在-70℃和-80℃的全血提取DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量幾乎無明顯下降。近年也有少數(shù)關(guān)于血液樣本長(zhǎng)期低溫保存對(duì)DNA質(zhì)量及產(chǎn)量影響的研究，如Richardson等[10]通過對(duì)4℃保存11～922d的全血樣本進(jìn)行DNA提取，發(fā)現(xiàn)隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，所得到DNA的產(chǎn)量會(huì)有所減少；也有報(bào)道表明-75℃保存3個(gè)月會(huì)后提取的全血基因組 DNA產(chǎn)量降低，而質(zhì)量無明顯變化[11]。最近有研究關(guān)于保存溫度對(duì)DNA質(zhì)量影響的報(bào)道，該研究通過將全血樣本(n=6)在4℃、-20℃和-80℃分別保存20年后，提取DNA，檢測(cè)DNA的質(zhì)量，并與新鮮全血樣本提取的DNA質(zhì)量進(jìn)行比較，得出需要將樣本保存在-20℃以下以防止DNA降解的結(jié)論[12]。Chen等[13]通過對(duì)-30℃保存了2～19年的全血樣本進(jìn)行DNA提取，檢測(cè)DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫保存19年的全血樣本仍保持著高質(zhì)量與高產(chǎn)量。

本研究將-80℃保存10年以上的血細(xì)胞樣本磁珠法提取DNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所得DNA的A260/A280在1.7～1.9之間占89.3%；A260/A230≥2.0，占80%，且瓊脂糖凝膠電泳條帶均在15kb以上，沒有降解條帶出現(xiàn)，說明所獲得DNA的質(zhì)量較高。DNA平均產(chǎn)量在187.57 μg，大于10μg者占95.3%，足以用于后續(xù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析、外顯子捕獲測(cè)序、甲基化DNA測(cè)序等。目前本中心已有研究者使用樣本庫(kù)保存10年以上的血細(xì)胞樣本提取的DNA進(jìn)行糖尿病腎病GWAS研究(文章待發(fā)表)。尤其是A260/A280在1.7～1.9之間、A260/A230在2.0以上及DNA產(chǎn)量>10 μg的樣本份數(shù)所占比例較高，達(dá)到76%，說明這種以血細(xì)胞形式長(zhǎng)期低溫保存的樣本可使DNA獲得較高的保存效果。影響樣本DNA的質(zhì)量及使用可行性的因素有很多，例如樣本類型、采集時(shí)間、采集容器及保存方法等。一些保護(hù)性措施在樣本的采集、處理及保存過程中也有被使用的[14]。我中心采集和保存中的幾點(diǎn)注意事項(xiàng)有助于提高DNA的保存效果：如發(fā)現(xiàn)有明顯血凝塊的標(biāo)本(血凝塊會(huì)導(dǎo)致提取的DNA純度和濃度均降低)則重新留取血標(biāo)本[15]；吸取上層血漿后剩余的血細(xì)胞直接倒入凍存管中，而不采用移液槍或滴管吸取的方式，盡量減少中間人為操作環(huán)節(jié)；盡量縮短從標(biāo)本采集到放入冰箱的時(shí)間；-80 ℃保存，保存期間無凍融。

此外，有研究報(bào)道提取方法會(huì)影響DNA提取的產(chǎn)量和純度，尤其是庫(kù)存血[16-17]。有研究者通過對(duì)6種不同DNA提取方法效果的比較，表明不同實(shí)驗(yàn)室之間DNA提取方法之間存在很多變量，提取方法的不同，所得到的DNA產(chǎn)量和純度也會(huì)有所不同[18]。我中心的所有樣本均采用全自動(dòng)核酸提取儀磁珠法提取DNA，這種方法與傳統(tǒng)的鹽析法、苯酚抽提法、固相吸附法相比較，不需要多次離心，實(shí)現(xiàn)了提取與純化一體化，利用儀器自動(dòng)化操作，減少了人為因素的干擾，具有高效、快速、自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)，可以滿足大批量樣本提取DNA的需求[19-20]。商品化DNA提取試劑盒說明書中提到平均可從每毫升全血中提取40 μg DNA，本研究中3ml血細(xì)胞中提取DNA平均產(chǎn)量為187.57 μg，因此提取的DNA產(chǎn)量符合要求。

其中，也有極少部分樣本DNA的A260/A280超出1.7～1.9范圍，A260/A230低于2.0，或DNA產(chǎn)量小于10 μg。究其原因，可能與血液中有較多微小血凝塊、血量不足3ml及操作中的誤差等有關(guān)。此外，患者的年齡也可能影響所獲得的白細(xì)胞數(shù)量[21-22]，從而影響DNA的產(chǎn)量，通常隨著患者年齡增長(zhǎng)，白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量會(huì)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)[23]，然而本研究中并沒有觀察到白細(xì)胞對(duì)DNA產(chǎn)量有影響。由于本研究納入的150例腎臟疾病患者白細(xì)胞低的僅有7例，而且最低值也超過3 000/μl，白細(xì)胞高的僅有6例，最高值不超過13 000/μl，其余患者白細(xì)胞值均在正常范圍內(nèi)，因此，尚不能完全確定白細(xì)胞數(shù)量與DNA產(chǎn)量之間的關(guān)系，關(guān)于這一問題的解決需要后續(xù)更大樣本量的研究。

本研究未能獲得這些樣本新鮮時(shí)提取DNA的質(zhì)量、產(chǎn)量和完整性情況，因而也無法明確純度不高和(或)產(chǎn)量低的樣本是在采集、處理過程中或是在保存過程中、還是在提取DNA過程中的不當(dāng)因素所導(dǎo)致的。另外，本研究是從保存的血細(xì)胞樣本提取DNA檢測(cè)質(zhì)量、產(chǎn)量和完整性，并沒有與其他保存形式如：全血或白膜層細(xì)胞，作比較以明確DNA以哪種保存形式所獲得的長(zhǎng)期低溫保存效果最好。這些均需要進(jìn)一步的前瞻性研究。

小結(jié)：血細(xì)胞-80℃低溫保存10年以上經(jīng)磁珠法提取所得到的DNA仍保持著較高的純度、產(chǎn)量和完整性。該研究提示了血細(xì)胞樣本以這樣的保存方式及提取方法，可使DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量達(dá)到較高水平，為其他研究者利用樣本庫(kù)中保存了10年以上的樣本用于后續(xù)分子研究、基因組學(xué)研究提供參考。

1 Yu R,Dan Y,Xiang X,et al.Stability of Chronic Hepatitis-Related Parameters in Serum Samples After Long-Term Storage.Biopreserv Biobank,2017,15(3):211-219.

2 Carpi FM,Di PF,Vincenzetti S,et al.Human DNA extraction methods:patents and applications.Recent Pat DNA Gene Seq,2011,5(1):1-7.

3 Le PC,K?bel M,de Ladurantaye M,et al.Specimen quality evaluation in Canadian biobanks participating in the COEUR repository.Biopreserv Biobank,2013,11(2):83-93.

4 Betsou F,Barnes R,Burke T,et al.Human biospecimen research:experimental protocol and quality control tools.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2009,18(4):1017-1025.

5 Shabihkhani M,Lucey GM,Wei B,et al.The procurement,storage,and quality assurance of frozen blood and tissuebiospecimens in pathology,biorepository,and biobanksettings.Clin Biochem,2014,47(4-5):258-266.

6 Steinberg K,Beck J,Nickerson D,et al.DNA banking for epidemiologic studies:a review of current practices.Epidemiology,2002,13(3):246-254.

7 韓喜榮,胡永華.血液標(biāo)本類型及保存方式對(duì)DNA產(chǎn)量、質(zhì)量的影響.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2002,12(5):540-542.

8 Alrokayan SAH,Wang L,Wang SS,et al.Effect of storage temperature on thequality and quantity of DNA extracted from blood.J Biol Sci,2000,3(3):392-394.

9 Visvikis S,Schlenck A,Maurice M.DNA extraction and stability for epidemiological studies.Clin Chem Lab Med,1998,36(8):551-555.

10 Richardson AJ,Narendran N,Guymer RH,et al.Blood storage at 4 degrees C-factors involved in DNA yield and quality.J Lab Clin Med,2006,147(6):290-294.

11 呂曉巖,楊志崗.保存條件對(duì)提取全血基因組DNA質(zhì)量的影響.中國(guó)醫(yī)藥指南,2016,14(10):28-29.

12 Hara M,Nakanishi H,Yoneyama K,et al.Effects of storage conditions on forensic examinations of blood samples and bloodstains stored for 20 years.Leg Med (Tokyo),2016,18:81-84.

13 Chen WC,Kerr R,May A,et al.The Integrity and Yield of Genomic DNA Isolated from Whole Blood Following Long-Term Storage at -30°C.Biopreserv Biobank,2018,16(2):106-113.

14 Chacon-Cortes D1,Haupt LM,Lea RA,Griffiths LR.Comparison of genomic DNA extraction techniques from whole blood samples:a time,cost and quality evaluation study.Mol Biol Rep,2012,39(5):5961-5966.

15 李王霞,劉光箭,陸華新,等.標(biāo)本因素對(duì)全自動(dòng)磁珠法全血DNA提取的影響.中國(guó)輸血雜志,2014,27(1):29-31.

16 Kalousová M,Levová K,Kuběna AA,et al.Comparison of DNA isolation using salting-out procedure and automated isolation (MagNA system).Prep Biochem Biotechnol,2017,47(7):703-708.

17 Mathay C,Hamot G,Henry E,et al.Method Validation for Extraction of Nucleic Acids from Peripheral Whole Blood.Biopreserv Biobank,2016,14(6):520-529.

18 Dilhari A,Sampath A,Gunasekara C,et al.Evaluation of the impact of six different DNA extraction methods for the representation of the microbial community associated with human chronic wound infections using a gel-based DNA profiling method.AMB Express,2017,7(1):179.

19 張振,楊文濤,陳炯,等.人外周血基因組DNA提取的影響因素及方案選擇.河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,34(4):310-315.

20 張帥,徐銳,張強(qiáng),等.改良鹽析法提取全血基因組DNA的影響因素研究.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(35):42-46.

21 Bulla A,De witt B,Ammerlaan W,et al.Blood DNA yield but not integrity or methylation is impacted after long-term storage.Biopreserv Biobank,2016,14(1):29-38.

22 Mychaleckyj JC,Farber EA,Chmielewski J,et al.Buffy coat specimens remain viable as a DNA source for highly multiplexed genome-wide genetic tests after long term storage.J Transl Med,2011,9:91.

23 Erkeller-Yuksel FM,Deneys V,Yuksel B,et al.Age-related changes in human blood lymphocyte subpopulations.J Pediatr,1992,120(2 Pt 1):216-222.