韓文明，張慶霞，王順霞，劉金杰，趙 怡

（1. 北京市公安局大興分局刑偵支隊，北京102612 ；2. 北京市公安司法鑒定中心，北京100192）

SureID?PanGlobal人類DNA身份鑒定試劑盒是國產(chǎn)六色熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴增試劑盒，可同時檢測24個常染色體STR基因座、2個Y染色體STR基因座及Amelogenin，其涵蓋了美國FBI推薦的CODIS核心基因座、歐洲的ESS核心基因座及常用商品試劑盒中的PentaE、PentaD、D2S1338、D19S433、D6S1043基因座，同時針對少數(shù)男性個體存在AmelY染色體片段缺失及引物結(jié)合區(qū)突變而導(dǎo)致的性別誤判，該試劑盒增加了Y-indel和DYS391基因座以補充驗證。

現(xiàn)今DNA檢驗結(jié)果作為法庭科學(xué)的重要證據(jù)而可直接服務(wù)于偵查破案，因此世界各國對法醫(yī)DNA技術(shù)的新方法、新產(chǎn)品都有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。隨著國產(chǎn)DNA試劑盒的研發(fā)和生產(chǎn)，公安部及相關(guān)單位專家為保證試劑質(zhì)量及檢案的可靠性，根據(jù)我國DNA檢案的實際情況，參照DNA分析方法科學(xué)工作組的確證指南（Revised Validation Guidelines, 2004）[1]，制定了我國DNA試劑盒的檢測標(biāo)準(zhǔn)GA/T 815-2009《法庭科學(xué)人類熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴增檢測試劑質(zhì)量基本要求》[2]。本研究參照上述標(biāo)準(zhǔn)對SureID?PanGlobal試劑盒檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性、峰均衡性、常見動物的種屬特異性、各種常見檢材的適應(yīng)性與一致性、對酶切降解和混有抑制劑檢材的耐受性、不同批次間試劑的穩(wěn)定性及混合樣本的檢驗等9個方面進(jìn)行檢測，測試其各項技術(shù)性能指標(biāo)，評估其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

AB7500型熒光定量PCR儀、AB9700型PCR擴增儀、AB3130xL/3500xL測序儀、GlobalFilerTMPCR試劑盒（以上儀器及試劑均購自美國ThermoFisher），SureID?PanGlobal人類DNA身份鑒定試劑盒（寧波海爾施基因科技有限公司），DB-100A自動打孔機（達(dá)博），Maxwell自動提取儀（美國Promega公司），Chelex-100，DNA陽性對照樣本9947A及9948（濃度均為10ng/μL），不同類型檢材及人員血卡（均來自于日常檢驗與建庫），常見動物DNA樣本（由中科院動物研究所提供），Alu I DNA內(nèi)切酶，HaeⅢDNA內(nèi)切酶，QIAGEN純化試劑盒，靛藍(lán)，血紅素等。

1.2 實驗操作

本文實驗過程如無特別說明，均按照SureID?PanGlobal試劑盒說明書上推薦的最佳模板量及擴增體系操作。

1.3 樣本的制備及性能指標(biāo)檢測

1.3.1 靈敏度檢測

1.3.2 準(zhǔn)確性檢測

取1.3.1中濃度為1.000 0 ng/μL的9947A和9948各1 μL分別檢驗2次，判斷分型結(jié)果與說明書的描述是否一致；并從血樣庫中隨機抽取369名人員的血卡分別用GlobalFilerTMPCR試劑盒及SureID?Pan-Global試劑盒進(jìn)行檢測，觀察結(jié)果是否一致。

1.3.3 均衡性檢測

取1.3.1中濃度為1.000 0 ng/μL的9947A及9948分別檢驗兩次，分析各個基因座等位基因的峰值，并按以下方法進(jìn)行計算：1）同一基因座等位基因間的均衡性：基因分型為雜合子的，低峰峰值除以高峰峰值。2）同一熒光標(biāo)記下各個基因座間的均衡性：將同一熒光標(biāo)記下各個基因座中純合子峰值除以2，雜合子峰值取平均值，用最小值除以最大值。3）不同熒光標(biāo)記物間的均衡性：分別計算每一種熒光標(biāo)記下所有基因座峰值的平均值，用最小平均峰值除以最大平均峰值。

1.3.4 種屬特異性檢測

將豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、犬、貓、鼠、兔、魚、馬、猴、黑猩猩等常見動物的DNA樣本及大腸桿菌的DNA樣本均定量至1.0 ng/μL，各取1 μL進(jìn)行檢測。

1.3.5 適應(yīng)性檢測

目前，國企海外形象明顯存在“兩個不匹配”：軟實力和硬實力不匹配，美譽度和貢獻(xiàn)度不匹配。在國企海外形象的塑造過程中，作為中國的相關(guān)管理部門，應(yīng)加強統(tǒng)籌協(xié)調(diào)，搭建國有企業(yè)海外形象建設(shè)的支持平臺，提供多方面的指導(dǎo)和服務(wù)。

取已知分型的血痕、肌肉、骨骼、唾液斑、精斑、脫落細(xì)胞及帶毛囊的毛發(fā)各兩份，分別按GA/T 383-2014[3]中的磁珠法及Chelex法提取DNA，以AB7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行定量，使其終濃度均為1.0 ng/μL，各取1 μL進(jìn)行平行檢測。

1.3.6 一致性檢測

取1.3.5中終濃度為1.0 ng/μL的不同類型的提取產(chǎn)物各兩份，由兩人分別用不同AB9700型PCR擴增儀擴增，以AB3130xL和AB3500xL測序儀分別檢測，觀察結(jié)果的一致性。

1.3.7 穩(wěn)定性檢測

將兩個批次的SureID?PanGlobal試劑盒中各組分置于-20 ℃和室溫下反復(fù)凍融10次，檢測陽性對照樣本9947A及9948，觀察結(jié)果是否穩(wěn)定。

1.3.8 耐受性檢測

酶降解樣本的檢測[4]，取1.3.1中濃度為1.000 0 ng/μL 的 9947A 17 μL 與 1 μL Alu I DNA 內(nèi)切酶、3μL酶切緩沖液、2 μL BSA混合，37 ℃恒溫水浴1 h以上，再與HaeⅢ DNA內(nèi)切酶1 μL、酶切緩沖液2 μL混合，37 ℃恒溫水浴60 min。酶切反應(yīng)后，用Qiagen試劑盒純化，濃縮至2 μL，取1 μL進(jìn)行檢測。

混有抑制劑的樣本檢測[5]，取1.3.1中濃度為1.000 0 ng/μL 的 9947A 10 μL 與 240 mmol/L 的靛藍(lán)1 μL混合，取1 μL進(jìn)行檢測；取1.3.1中濃度為1.0000 ng/μL 9947A 5份，分別加入血紅素，使其終濃度分別為5、10、20、40、80 μmol/L，各取 1 μL 進(jìn)行檢測。

1.3.9 混合樣本檢測

將1.3.1中濃度均為1.000 ng/μL的9947A和9948按照 19:1、9:1、4:1、7:3、3:2、1:1、2:3、3:7、1:4、1:9、1:19的比例混合，各取1 μL進(jìn)行平行檢測。

2 結(jié)果與討論

SureID?PanGlobal試劑盒的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物包括中國人群中常見等位基因，各個等位基因分型結(jié)果在規(guī)定范圍內(nèi)與說明書描述完全一致，圖譜清晰。所有等位基因峰高均大于200RFU；每個基因座相鄰兩個等位基因峰高的比例大于50%，各等位基因峰高均衡性大于20%；同一基因座的兩個相鄰等位基因間片段差在預(yù)期范圍內(nèi)，相鄰兩個基因座間無等位基因重疊；在等位基因范圍內(nèi)出現(xiàn)的非等位基因均低于相鄰等位基因峰高的20%。分子量標(biāo)準(zhǔn)條帶清晰明確，片段位置及數(shù)量與說明書描述完全一致，與重復(fù)檢驗的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物間標(biāo)準(zhǔn)偏離＜±0.2bp，每個片段的峰高＞200RFU（圖1）。

2.1 準(zhǔn)確性檢測

SureID?PanGlobal試劑盒對369名隨機個體血樣的檢測結(jié)果與GlobalFilerTMPCR試劑盒的檢測結(jié)果在相同基因座分型完全一致。陽性對照樣本9947A和9948分型正確，未出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象，等位基因的堿基數(shù)與Ladder偏差＜±0.5bp，部分基因座出現(xiàn)的Stutter峰均在主峰的10%以下（圖2）。表明SureID?PanGlobal試劑盒能夠準(zhǔn)確判定基因型。

2.2 靈敏度檢測

按照SureID?PanGlobal試劑盒說明書上推薦的擴增反應(yīng)體系，分別對 1.0000、0.5000、0.2500、0.1250、0.0625 ng的9947A及9948進(jìn)行擴增并檢測，結(jié)果0.0625 ng的9947A及9948出現(xiàn)2個大片段STR基因座等位基因丟失現(xiàn)象，且峰的均衡性降低；0.1250 ng以上的9947A及9948均能檢出全部STR基因座分型。表明該試劑盒靈敏度較高，能夠?qū)ξ⒘繖z材進(jìn)行檢驗。

圖1 SureID? PanGlobal試劑盒內(nèi)標(biāo)檢測圖譜Fig.1 The spectrum of internal standards detected by the SureID? PanGlobal kit

圖2 SureID? PanGlobal檢測9947A（左）和9948（右）圖譜Fig.2 The prof i les of 9947A (left) and 9948 (right) positive controls tested with SureID? PanGlobal kit

2.3 均衡性檢測

實驗數(shù)據(jù)按照1.3.3方法計算，結(jié)果如下：各個基因座的等位基因均衡性≥77.03%，同一熒光標(biāo)記下各基因座間的均衡性≥62.37%，不同熒光標(biāo)記間均衡性≥66.00%。峰值均衡表明該試劑盒能夠檢測出樣品的所有等位基因。

2.4 種屬特異性檢測

通過對豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、犬、貓、鼠、兔、魚、馬、猴、黑猩猩及大腸桿菌的DNA樣本進(jìn)行檢測，未檢出特異性分型。說明SureID?PanGlobal試劑盒具備種屬特異性，可區(qū)分人與非人。

2.5 適應(yīng)性檢測

已知分型的血痕、肌肉、骨骼、唾液斑、精斑、脫落細(xì)胞及帶毛囊的毛發(fā)等檢材均獲得完整、正確的DNA分型結(jié)果。說明SureID?PanGlobal試劑盒對各類案件中常見檢材具有很好的適應(yīng)性。

2.6 穩(wěn)定性檢測

兩個批次的SureID?PanGlobal試劑盒中各組分反復(fù)凍融2、4、6、8、10次后，9947A及9948的檢驗結(jié)果均無明顯變化，未出現(xiàn)信號大于50RFU的隨機偽峰。說明該試劑盒具有較強的抗凍融能力，檢測結(jié)果穩(wěn)定。

2.7 一致性檢測

在不同的人員、設(shè)備條件下，對同一樣本進(jìn)行重復(fù)性檢驗，其分型結(jié)果一致；對已知分型的同一批樣本檢驗時，SureID?PanGlobal分型結(jié)果與已知分型結(jié)果一致。

2.8 耐受性檢測

SureID?PanGlobal試劑盒對內(nèi)切酶處理的降解樣本可以檢測到250 bp以內(nèi)的基因座分型，大片段基因座存在等位基因丟失現(xiàn)象（圖3左）；對影響PCR的抑制劑如靛藍(lán)和血紅素，靛藍(lán)＜240 mmol/L、血紅素＜40 μmol/L均得到完整的分型結(jié)果（圖3右及圖4）。說明該試劑盒對不同條件下的檢材具有一定的耐受性。

圖3 左圖為經(jīng)內(nèi)切酶消化的9947A，右圖為被血紅素抑制的9947AFig.3 The spectrums of 9947A either digested by endonuclease (the left part of this picture) or inhibited by heme (the right part of this picture)

圖4 左圖為血紅素＜40 μmmol/L的9947A，右圖為靛藍(lán)＜240 mmol/L的9947AFig.4 The spectrums of 9947A inhibited with either the heme (＜40μmol/L) (the left part of this picture) or the indigo (＜240mmol/L) (the right part of this picture)

2.9 混合樣本檢測

不同比例的混合樣本檢驗結(jié)果顯示：9947A與9948 的混合比例為 19?1、9?1、1?9、1?19 時，出現(xiàn)部分基因座等位基因丟失現(xiàn)象；混合比例為4?1、7?3、3?2、1?1、2?3、3?7、1?4 時，可以準(zhǔn)確得到混合樣本的全部等位基因分型，且混合分型中主要與次要成分峰高呈現(xiàn)的遞增及遞減趨勢與混合比例基本相符（圖5）。通過對兩個樣本不同混合比例的檢測，證明SureID?PanGlobal試劑盒能夠檢驗混合樣本。

圖5 SureID? PanGlobal檢測混合樣本的分型結(jié)果（9947A?9948=4?1）Fig.5 The genotyping of the pooled sample (9947A:9948=4:1) tested with SureID? PanGlobal kit

3 結(jié)論

通過對SureID?PanGlobal試劑盒9個方面的測試，其檢驗結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，檢測的靈敏度、種屬特異性及峰值的均衡性均較高，試劑的抗凍融能力也較好，對不同類型檢材及提取方法都有很好的適應(yīng)性及一致性，對酶切降解樣本及混有抑制劑的樣本具有一定的耐受性，對混合樣本具有較高的檢測分析能力，能夠?qū)?:1比例混合的樣本正確分型。SureID?PanGlobal試劑盒的上述性能指標(biāo)符合《法庭科學(xué)人類熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴增檢測試劑質(zhì)量基本要求》，達(dá)到了目前常用STR檢測試劑盒技術(shù)水平[6-8]，可用于個體識別、親權(quán)鑒定及遺傳學(xué)分析，適合法庭科學(xué)檢案與建庫。

［1］ Scientific Woking Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM). Revised validation guidelines［J/OL］. Forensic Science Communications, 2004,6(3). https://archives.fbi.gov/archives/about-us/lab/forensic-science-communications/fsc/july2004/standards/2004_03_standards02.htm

［2］ 全國刑事技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會.法庭科學(xué)人類熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴增檢測試劑質(zhì)量基本要求GA/T 815-2009 ［S］. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

［3］ 全國刑事技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會.法庭科學(xué)DNA實驗室檢驗規(guī)GA/T 383-2014 ［S］. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

［4］ TUCKER V C, HOPWOOD A J, SPRECHER C J, et al. Developmental validation of the PowerPlex ESI 16 and PowerPlex ESI 17 systems: STR multiplexes for the new European standard［J］. Forensic Science International Genetics, 2011, 5(5):436-448.

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［6］ 姜成濤，葉健，趙興春，等. DNATyperTM 15試劑盒的確證實驗［J］. 中國法醫(yī)學(xué)雜志，2008, 23(2): 73-76．

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