許石鐘

河南省濮陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院中藥房(濮陽(yáng) 457000)

作為臨床中一種傳統(tǒng)的破血逐瘀藥，水蛭粉是由水蛭炮制而成。水蛭粉主要含有蛋白質(zhì)。水蛭的唾液中含有水蛭素、肝素、抗血栓素和組織胺樣物質(zhì)[1-2]。水蛭具有較強(qiáng)的生命力及再生能力，其對(duì)炮制工藝有著較高的要求，一旦水蛭未能完全處死，進(jìn)入人體將會(huì)影響到患者的身體健康，甚至威脅到患者的生命安全[3]。我國(guó)《傷寒論》中最早提出采用“暖水洗”、“熬”等方法對(duì)水蛭進(jìn)行炮制，且經(jīng)過(guò)多年的實(shí)踐發(fā)展，滑石粉湯長(zhǎng)期以來(lái)一直是水蛭炮制的有效策略[4]。近年來(lái)，臨床藥學(xué)對(duì)水蛭化學(xué)成分及藥理作用進(jìn)行了深入的探究，并提出了水蛭生用的觀點(diǎn)，該觀點(diǎn)認(rèn)為水蛭生用能夠在一定程度上提升藥物療效，并逐漸被越來(lái)越多學(xué)者接受與認(rèn)可[5]。此次研究選取我院新購(gòu)進(jìn)的水蛭作為研究對(duì)象，探究其炮制后氨基酸及甾體類(lèi)成分變化情況，對(duì)研究結(jié)果予以如下總結(jié)與報(bào)道。

資料與方法

1 氨基酸的成分分析

1.1 儀器與條件:Beckman Coulter System Gold液相色譜儀由美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司提供，YD-L650P100-A20體積標(biāo)記器購(gòu)自深圳市遠(yuǎn)大激光科技有限公司，JC-8000A自動(dòng)采樣器由青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司提供，Honeywell DT6360STC探測(cè)器由深圳市博創(chuàng)時(shí)空通訊技術(shù)有限公司提供，TPC170TC-A902嵌入式主板購(gòu)自深圳市吉方科技有限公司。總流速以0.66ml/min為宜，緩沖液A流速一般為每分鐘0.45ml，緩沖液B流速以0.23ml/min為宜。將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為570nm，柱后反應(yīng)器溫度在130℃左右，柱溫為53℃～75℃之間。

1.2 水蛭樣品:研究所有生水蛭購(gòu)自亳州市御康堂貿(mào)易有限責(zé)任公司，經(jīng)過(guò)鑒定判斷其為寬體金線蛭，制水蛭則是采用滑石粉對(duì)生水蛭燙制而成。

1.3 樣品液的制備及水解:精密稱(chēng)取適量樣品，在其中加入2 ml 6N鹽酸溶液，放置于5 ml試管中，將試管口封閉，放置于烘箱中，將溫度設(shè)置為120℃，進(jìn)行水解處理，以48 h為宜。48 h后將其取出，放置入105℃環(huán)境下進(jìn)行烘干，將溶劑去除，在其中加入5 ml稀釋緩沖液，并反復(fù)搖晃使其混合均勻，經(jīng)過(guò)0.22 u微孔濾膜實(shí)施過(guò)濾處理，此時(shí)可得到樣品溶液，進(jìn)樣為20 μl。

2 甾體類(lèi)化合物的GC-MS分析

2.1 儀器與條件:Fninigan MAT 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀購(gòu)自廣州市碼斯帕科儀器有限公司，HP-1柱規(guī)格為13.0m×0.25mm ID×0.36um，實(shí)施程度升溫，首次升溫為100℃/min，然后保持100℃～190℃/10min，最后升溫為300℃/3min。水蛭樣品同1.1.2。

2.2 樣品溶液制備:精密稱(chēng)取兩種樣品，每種20g，實(shí)施粉碎處理，采用95%乙醇(廣州市江順化工科技有限公司)實(shí)施回流處理，一般提取3次左右，每次2 h。對(duì)提取液實(shí)施合并，經(jīng)過(guò)減壓處理后將溶劑予以回收。采用5%KOH乙醇液(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)對(duì)剩余殘?jiān)枰匀芙?，加熱后進(jìn)行為期3 h的回流處理，并對(duì)溶劑進(jìn)行回收，對(duì)于剩余殘?jiān)稍谄渲屑尤脒m量水，采用乙醚(廣州潔露華生物科技有限公司)實(shí)施反復(fù)萃取，將乙醚液進(jìn)行合并，并對(duì)乙醚實(shí)施回收，采用乙醚對(duì)適量殘?jiān)M(jìn)行溶解處理，可得到樣品溶液，稱(chēng)取適量樣品溶液，將其注入到氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中。

結(jié) 果

1 水蛭經(jīng)過(guò)炮制后氨基酸測(cè)定結(jié)果分析 經(jīng)過(guò)炮制后的水蛭，其氨基酸含量如天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸等成分與炮制前比較明顯降低，氨基酸總量由原來(lái)的73.95%降低到45.04%，差異較大，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2 水蛭經(jīng)過(guò)炮制后甾體類(lèi)化合物GC-MS結(jié)果分析 甾體類(lèi)化合物組成成分也發(fā)生明顯變化，生水蛭中含有大量膽固醇，而經(jīng)過(guò)炮制后，甾體類(lèi)化合物成分未能檢出，膽固醇氧化產(chǎn)物呈現(xiàn)出明顯的增加趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 水蛭經(jīng)過(guò)炮制后氨基酸測(cè)定結(jié)果分析 (%)

表2 水蛭經(jīng)過(guò)炮制后甾體類(lèi)化合物GC-MS結(jié)果分析

討 論

生物學(xué)研究報(bào)道，作為一種雌雄同體類(lèi)動(dòng)物，水蛭通過(guò)異體受精，其生命力極強(qiáng)，但無(wú)再生能力，因此，對(duì)水蛭進(jìn)行炮制時(shí)選擇高溫對(duì)其進(jìn)行炮制[6-8]。動(dòng)物類(lèi)藥材中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)及甾醇等物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)主要組成為氨基酸，其在生物機(jī)體代謝中有著重要的參與作用，因此在動(dòng)物類(lèi)藥材評(píng)價(jià)中往往將氨基酸作為重要質(zhì)量指標(biāo)[9-10]。而所有生物體中都幾乎含有甾體類(lèi)化合物，其作為生物膜的重要組成部分，是激素產(chǎn)生的的基礎(chǔ)，為生理活動(dòng)提供了重要的物質(zhì)能源。甾體化合物中含量最高的為膽固醇，其實(shí)細(xì)胞膜及血漿脂蛋白的重要組成部分[11]。而當(dāng)膽固醇受到氧化其對(duì)生物功能將會(huì)產(chǎn)生一定的損害作用。不僅會(huì)對(duì)心血管系統(tǒng)產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性，造成內(nèi)皮細(xì)胞死亡，而且會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖及內(nèi)皮細(xì)胞柵欄功能起到一定的抑制作用，促使彈性蛋白組成產(chǎn)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白微絲破裂，對(duì)甾體合成產(chǎn)生抑制作用[12-13]。此次研究所選取的水蛭藥材為寬體金線蛭，是我國(guó)臨床中常用的動(dòng)物藥材品種。水蛭中含有水蛭素、蛋白酶抑制劑等多種活性多肽，其成分主要來(lái)源于吸血蛭，而寬體金線蛭則屬于不吸血蛭，目前臨床中尚未針對(duì)寬體金線蛭進(jìn)行研究報(bào)道。對(duì)水蛭的炮制多采用的是滑石粉燙制，其溫度通常在200℃以上，在這種高溫條件下，水蛭藥材的化學(xué)成分無(wú)疑會(huì)產(chǎn)生較大的變化，對(duì)膽固醇氧化產(chǎn)物的生產(chǎn)會(huì)產(chǎn)生一定的不利影響，進(jìn)而導(dǎo)致膽固醇氧化產(chǎn)物呈現(xiàn)出明顯的增加趨勢(shì)。臨床研究報(bào)道，水蛭經(jīng)過(guò)炮制，其位于31KD左右的蛋白質(zhì)含量將會(huì)明顯增加，在22KD左右生水蛭及經(jīng)過(guò)炮制的水蛭蛋白質(zhì)含量均相對(duì)較高[14]。有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)水蛭經(jīng)過(guò)炮制后未有高于45KD的蛋白質(zhì)條帶，這很大程度上是由于在200℃高溫燙制下，水蛭中的水溶性蛋白會(huì)發(fā)生變性[15]，部分會(huì)通過(guò)自身釋放蛋白酶轉(zhuǎn)化為游離的氨基酸物質(zhì)或小分子肽，在提取過(guò)程中，變性蛋白質(zhì)將會(huì)被離心沉淀去除。此次研究中水蛭炮制后氨基酸含量明顯降低，甾體類(lèi)化合物組成成分也發(fā)生明顯變化，且經(jīng)過(guò)高溫炮制，膽固醇氧化產(chǎn)物含量有所增加，提示水蛭炮制會(huì)在一定程度上影響到氨基酸及甾體類(lèi)化合物成分的變化。綜上所述，在高溫炮制作用下，水蛭中的氨基酸含量及甾體類(lèi)化合物成分均會(huì)受到一定的影響，應(yīng)給予高度臨床關(guān)注，確保水蛭藥物的合理應(yīng)用。

[1] 童 凱，李昭玲，閆 燊,等. 川牛膝酒炙和鹽炙前后HPLC化學(xué)指紋圖譜及其主要藥效成分量變化研究[J]. 中草藥，2016，47(4):580-584.

[2] 單 宇，張伽妹，丁月珠,等. 水提取法和仿生提取法研究水蛭不同炮制品的體外抗凝活性[J]. 中國(guó)中藥雜志，2016，41(10):1843-1848.

[3] Jorge J C F. Influence of Chemical Composition on the Mechanical Properties of High Strength Steel Weld Metals for Application in Mooring Components[J]. International Journal of Engineering & Technical Research，2016，4(2):71-76.

[4] 王 朝，蔣莉莉，施莉莉,等. 水蛭配合西藥治療糖尿病腎病及對(duì)尿微量白蛋白和內(nèi)皮功能的影響[J]. 陜西中醫(yī)，2014，35(10):1306-1308.

[5] 史小蓮，劉俊田，李西寬,等. 水蛭免加熱提取物抗凝血作用及其機(jī)制研究[J]. 山東中醫(yī)雜志，2013，22(11):687-690.

[6] Berti C，Celli A，Marchese P，etal. Environmentally Friendly Copolyesters Containing 1,4‐Cyclohexane Dicarboxylate Units，1‐Relationships Between Chemical Structure and Thermal Properties[J]. Macromolecular Chemistry & Physics，2013，211(14):1559-1571.

[7] 黃學(xué)敏，馬浩亮，馬 驍. 水蛭豬苓降壓丸治療高血壓病及對(duì)左心室功能的影響[J]. 陜西中醫(yī)，2013，34(10):1306-1307.

[8] Zheng W J，Wan X C，Bao G H. Brick dark tea: a review of the manufacture，chemical constituents and bioconversion of the major chemical components during fermentation[J]. Phytochemistry Reviews，2015，14(3):499-523.

[9] Smanalieva J，Salieva K，Borkoev B，etal. Investigation of changes in chemical composition and rheological properties of Kyrgyz rice cultivars (Ozgon rice) depending on long-termstack-storage after harvesting[J]. LWT - Food Science and Technology，2015，63(1):626-632.

[10] 孫立麗，任曉亮，張慧杰,等. 基于超高效液相色譜指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合的何首烏炮制研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2017，21(5):164-165.

[11] 劉蓬蓬，徐 珊，張 凡,等. 黃柏炮制前后生物堿和檸檬苦素類(lèi)成分的變化研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2015，28(1):18-23.

[12] 潘凌云，徐 敏，王 億,等. UPLC-ESI-MS/MS法分析藤黃炮制前后化學(xué)成分的變化[J]. 中成藥，2016，38(5):1098-1103.

[13] Barker P A，Hurrell E R，Leng M J，etal. Carbon cycling within an East African lake revealed by the carbon isotope composition of diatom silica: a 25-ka record from Lake Challa，Mt. Kilimanjaro[J]. Quaternary Science Reviews，2013，66(436):55-63.

[14] 馬麗虹，李可建. 單味水蛭制劑治療缺血性中風(fēng)急性期臨床療效的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J]. 山東中醫(yī)雜志，2010，21(9):593-594.

[15] 孟祥龍，馬俊楠，張朔生,等. 熟地黃炮制(九蒸九曬)過(guò)程中藥效化學(xué)成分量變化及炮制輔料對(duì)其影響研究[J]. 中草藥，2016，47(5):752-759.