張婷婷，柳偉偉,2，高璐,2，李任建,2，付穗業(yè),2，劉曉健，李大琪,3，劉衛(wèi)敏，董卿,2，張建珍

?

飛蝗幾丁質(zhì)酶5-1抗體制備及表達(dá)特性分析

張婷婷1，柳偉偉1,2，高璐1,2，李任建1,2，付穗業(yè)1,2，劉曉健1，李大琪1,3，劉衛(wèi)敏1，董卿1,2，張建珍1

（1山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006；2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；3山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，太原 030031）

【目的】通過(guò)制備飛蝗（）幾丁質(zhì)酶5-1（）的多克隆抗體，建立飛蝗體內(nèi)LmCht5-1蛋白水平檢測(cè)方法，分析LmCht5-1在4齡飛蝗的表達(dá)特性及組織定位?！痉椒ā坎捎肕EGA 軟件對(duì)LmCht5-1和LmCht5-2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，利用Expression網(wǎng)站對(duì)LmCht5-1氨基酸序列進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)分析，獲得LmCht5-1抗原結(jié)構(gòu)區(qū)域；以飛蝗cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增的抗原片段；同時(shí)通過(guò)酶切連接構(gòu)建含有雞血清白蛋白OVA的載體pET32a-OVA；然后通過(guò)酶切連接將插入到pET32a-OVA載體構(gòu)建pET32a-OVA-LmCht5-1；將pET32a-OVA-LmCht5-1轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21（DE3）中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白OVA-LmCht5-1；利用Ni-NTA純化后免疫新西蘭白兔，制備多克隆抗體。通過(guò)ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)；利用Western blot檢測(cè)抗體特異性。提取4齡飛蝗不同日齡表皮，采用Western blot分析LmCht5-1蛋白表達(dá)模式。對(duì)4齡飛蝗注射ds，檢測(cè)蛋白水平LmCht5-1表達(dá)量，并通過(guò)免疫組化方法對(duì)LmCht5-1進(jìn)行定位及功能分析?！窘Y(jié)果】通過(guò)和序列比對(duì)和抗原表位預(yù)測(cè)分析，獲得LmCht5-1的471—533AA可作為抗原區(qū)域；通過(guò)酶切連接分別獲得pET32a-OVA和pET32a-OVA-LmCht5-1。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和純化后獲得重組蛋白OVA-LmCht5-1，分子量為71.34 kD；免疫后制備多克隆抗體OVA-LmCht5-1，ELISA檢測(cè)效價(jià)為1﹕102 400。多克隆抗體OVA-LmCht5-1用于Western blot檢測(cè)時(shí)可特異性識(shí)別LmCht5-1，與LmCht5-2蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。利用Western blot方法檢測(cè)4齡若蟲(chóng)各日齡表皮中LmCht5-1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LmCht5-1蛋白隨發(fā)育日齡其表達(dá)量逐漸增加，在蛻皮當(dāng)天達(dá)到峰值，蛻皮后快速降至最低點(diǎn)。對(duì)飛蝗若蟲(chóng)N4D2注射ds，檢測(cè)到在N4D5時(shí)，的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均被顯著抑制，抑制率分別為70.0%和73.6%。選取注射ds和ds的4齡飛蝗表皮，進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示LmCht5-1定位于表皮細(xì)胞和舊表皮中，其功能失活引起舊表皮中幾丁質(zhì)不降解?！窘Y(jié)論】獲得飛蝗LmCht5-1多克隆抗體可特異性識(shí)別LmCht5-1，可用于Western blot和免疫組化檢測(cè)。明確LmCht5-1在飛蝗4齡若蟲(chóng)蛻皮當(dāng)天表達(dá)最高，定位于表皮細(xì)胞和舊表皮中。ds可減少表皮細(xì)胞和舊表皮中LmCht5-1的表達(dá)，阻礙舊表皮中幾丁質(zhì)的降解。

飛蝗；幾丁質(zhì)酶5-1；抗體制備；表達(dá)分析；Western blot

0 引言

【研究意義】飛蝗（）是重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，其表皮周期性的生成與降解是重要的生物學(xué)現(xiàn)象，研究表皮發(fā)育對(duì)害蟲(chóng)防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】飛蝗表皮富含幾丁質(zhì)，其周期性的降解由幾丁質(zhì)酶等催化完成。幾丁質(zhì)酶5（chitinase5，Cht5）屬于Group I，是第一個(gè)被鑒定的昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因（），由Kramer等[1]于1993年從煙草天蛾（）的蛻皮液中分離得到，之后該基因的直系同源基因在至少15個(gè)昆蟲(chóng)物種中被陸續(xù)分離鑒定[2-5]，被認(rèn)為參與昆蟲(chóng)表皮幾丁質(zhì)的降解[6-7]。Cht5在飛蝗中具有基因復(fù)制現(xiàn)象[8]，飛蝗Cht5包含和兩個(gè)基因，其中含有信號(hào)肽、幾丁質(zhì)結(jié)合域和催化域，與已報(bào)道的昆蟲(chóng)基因直系同源，通過(guò)向5齡若蟲(chóng)注射ds，發(fā)現(xiàn)影響飛蝗5齡若蟲(chóng)到成蟲(chóng)期的蛻皮發(fā)育，造成飛蝗蛻皮困難而死亡；而抑制無(wú)可見(jiàn)異常表型。通過(guò)幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白Knickkopf（Knk）和Cht5蛋白在赤擬谷盜（）表皮的定位分析，發(fā)現(xiàn)Knk蛋白和Cht5蛋白共定位于新合成的表皮，提出Knk蛋白的新功能，即保護(hù)新合成幾丁質(zhì)不被幾丁質(zhì)酶降解[9]。YU等[10]通過(guò)幾丁質(zhì)脫乙?；?（CDA2）在飛蝗表皮的蛋白定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要定位在外表皮（exocuticle）與上表皮（epicuticle）之間，結(jié)合生化和電鏡結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了昆蟲(chóng)CDA2的新功能，即連接外表皮和上表皮，具有支架作用，啟動(dòng)幾丁質(zhì)螺旋結(jié)構(gòu)的形成和有序緊密排列?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】LmCht5-1的抗體缺乏，影響對(duì)其表達(dá)特性及功能的分析。制備高特異性LmCht5-1抗體，有利于解析其功能及與LmCht5-2的功能分化。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)序列比對(duì)和抗原表位預(yù)測(cè)分析，獲得抗原結(jié)構(gòu)區(qū)域，通過(guò)與高免疫原性雞卵清白蛋白偶聯(lián)制備高效多克隆抗體，檢測(cè)抗體效價(jià)與特異性，分析在飛蝗不同發(fā)育日齡的表達(dá)特性及組織定位；解析LmCht5-1蛋白缺失對(duì)表皮幾丁質(zhì)降解的影響。為后續(xù)深入解析功能及其與的功能分化研究提供試驗(yàn)材料和平臺(tái)條件。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016—2017年在山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所完成。

1.1 材料

試蟲(chóng)：試驗(yàn)用飛蝗飼養(yǎng)于山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所昆蟲(chóng)培養(yǎng)室。飼養(yǎng)條件：室溫28—30℃，光照14L﹕10D，相對(duì)濕度15%—25%。挑選大量3齡飛蝗若蟲(chóng)進(jìn)行同步化培養(yǎng)。取4齡各日齡飛蝗的表皮進(jìn)行分析。

主要試劑：載體pET32a和JMB88-OVA為實(shí)驗(yàn)室保存。IPTG、X-Gal購(gòu)于索萊寶公司。蛋白純化Ni-NTA柱和RiboMAXTMExpression RNAi System購(gòu)于Promega公司。Trizol、HiFi cDNA-script、SYBR Green、2×Tag Mix購(gòu)自康為世紀(jì)，其他試劑均為分析純。

1.2 飛蝗LmCht5-1高免疫活性載體構(gòu)建

1.2.2 pET32a-OVA-LmCht5-1構(gòu)建 利用雙酶切方法從JMB88-OVA中酶切獲得OVA片段并插入至pET32a的對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)處，獲得pET32a-OVA載體。設(shè)計(jì)抗原序列的擴(kuò)增引物（表1），酶切位點(diǎn)選用d III和I。以飛蝗表皮cDNA為模板，通過(guò)PCR方法，擴(kuò)增抗原序列。利用d III和I同時(shí)雙酶切和pET32a-OVA，連接獲得pET32a-OVA-LmCht5-1。引物序列為d IIIF：gggATGGATGTCGAC TGCAGCGACG和I R：G AGGCTGTGCTTGGCCATGGAGC。

1.3 pET32a-OVA-LmCht5-1蛋白表達(dá)及純化

1.3.1 pET32a-OVA-LmCht5-1蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將載體pET32a-OVA-LmCht5-1通過(guò)42℃熱激的方法轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)中，在LB+Amp平板中進(jìn)行篩選。挑取單克隆搖菌至OD600為0.6，加0.5 mmol·L-1IPTG于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。12 000 r/min離心1 min收集細(xì)菌沉淀，超聲波破碎后離心，分離上清與沉淀，通過(guò)12% SDS-PAGE電泳確定目的蛋白的表達(dá)部位。

1.3.2 蛋白OVA-LmCht5-1和OVA的Ni-NTA純化 將OVA-LmCht5-1菌液接種至400 mL LB培養(yǎng)基中，16℃過(guò)夜誘導(dǎo)。12 000 r/min離心1 min收集細(xì)菌沉淀，超聲波破碎后，12 000 r/min離心1 min收集包涵體。利用50 mmol·L-1Tris-HCl+200 mmol·L-1NaCl+8 mol·L-1尿素溶解包涵體后，使用Ni-NTA系統(tǒng)對(duì)溶解的包涵體蛋白進(jìn)行純化。采用不同濃度咪唑進(jìn)行逐級(jí)洗脫，并收集洗脫液餾分。利用12% SDS-PAGE蛋白膠檢測(cè)蛋白濃度和純度。收集蛋白純度較高的洗脫餾分，采用分子量為30 kD的超濾離心管（Millipore）對(duì)其進(jìn)行超濾濃縮，12 000 r/min離心獲得超濾液。利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。采用同樣條件對(duì)OVA蛋白進(jìn)行表達(dá)與純化。

1.4 OVA-LmCht5-1抗體制備及效價(jià)檢測(cè)

1.4.1 OVA-LmCht5-1抗體制備方法 委托華大公司通過(guò)以下程序免疫新西蘭白兔以制備多克隆抗體，具體方法：取純化后的OVA-LmCht5-1蛋白400 μg，生理鹽水稀釋至500 μL，與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分混勻，制備油包水結(jié)構(gòu)，對(duì)2.0 kg左右的新西蘭白兔的背部進(jìn)行皮下注射，完成初次免疫。14 d與21 d分別進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。在免疫之前通過(guò)耳靜脈取陰性血清用做后期蛋白特異性的檢測(cè)。28 d時(shí)，頸動(dòng)脈取血收集全血，5 000 r/min離心10 min，2次離心后收取血清作為多克隆抗體血清[11]。

1.4.2 OVA-LmCht5-1效價(jià)檢測(cè) 采用ELISA方法測(cè)定所制備抗體的效價(jià)[12]?？乖粸镺VA-LmCht5-1抗原蛋白，終濃度為2 μg·mL-1，一抗為多抗血清，從200倍開(kāi)始用PBS梯度稀釋，設(shè)置PBS為空白對(duì)照（Blank），以PBS稀釋的200倍陰性血清作為陰性對(duì)照（negative）；二抗為稀釋20 000倍的羊抗兔HRG，顯色后加50 μL終止液終止反應(yīng)；雙波長(zhǎng)（450/630 nm）測(cè)吸光值?？贵w效價(jià)為1/2最大OD值所對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)[13]。

1.5 OVA-LmCht5-1抗體特異性檢測(cè)

1.5.1 蛋白水平檢測(cè)OVA-LmCht5-1抗體特異性 取原核表達(dá)蛋白OVA-LmCht5-1和OVA檢測(cè)OVA-LmCht5-1抗體是否識(shí)別OVA；取筆者課題組利用昆蟲(chóng)病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得的真核蛋白[14]--acetylglucosaminidase（eLmNAG）、eukaryotic expression LmCht5-1（eLmCht5-1）和eukaryotic expression Cht5-2（eLmCht5-2），通過(guò)Western blot鑒定OVA-LmCht5-1抗體是否準(zhǔn)確區(qū)分eLmCht5-1和eLmCht5-2；取飛蝗中腸與表皮蛋白樣品用于檢測(cè)OVA-LmCht5-1對(duì)組織樣品檢測(cè)的靈敏度和特異性。以上蛋白樣品濃度調(diào)整為500 ng·μL-1，上樣量均為30 μL，用于后續(xù)Western blot檢測(cè)。

1.5.2 Western blot檢測(cè)LmCht5-1 采用12% SDS-PAGE分離膠蛋白樣品，電泳條件為80 V 30 min，120 V 40 min。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，濕轉(zhuǎn)條件為150 V，45 min。利用含10% BSA的TBS溶液在常溫下封閉1 h。TBST清洗3次，每次5 min。將OVA-LmCht5-1抗體稀釋2 000倍后進(jìn)行孵育，時(shí)間為1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。二抗孵育羊抗兔IgG，時(shí)間為1 h，TBST洗滌5次，每次10 min。利用奧德賽雙紅外熒光捕捉信號(hào)并采集圖像。設(shè)置免疫前陰性血清為陰性對(duì)照，檢測(cè)抗體的特異性。

除了全要素生產(chǎn)率 （ln TFP）之外，本文參考以往研究還提出如下控制變量：企業(yè)規(guī)模 （ln size）、 企業(yè)年齡 （ln age）、資本密集度 （ln capints）、綜合稅率（taxrt）、 是否國(guó)企（equnat）、 有無(wú)外資（forcap）。具體變量定義見(jiàn)表1。

1.6 LmCht5-1在飛蝗不同發(fā)育日齡表皮中的表達(dá)特性

選擇4齡第1天（N4D1）至N4D5和N5D1的若蟲(chóng)表皮，檢測(cè)不同發(fā)育日齡飛蝗表皮中蛋白的表達(dá)特性。以上所有樣品均取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)3頭若蟲(chóng)。分離飛蝗背部表皮，加入RIPA+PMSF+DTT混合液后子冰上進(jìn)行勻漿，放置30 min后，離心取上清。采用BCA方法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度為300 ng·μL-1。蛋白檢測(cè)參照1.5.2。利用灰度分析計(jì)算不同日齡表皮中LmCht5-1相對(duì)于-actin的表達(dá)量，觀察LmCht5-1表達(dá)量的變化以及對(duì)表皮發(fā)育的影響。

1.7 dsLmCht5-1的合成、注射與蛋白樣品制備

ds的合成與注射參照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行[15-16]。選取4齡第2天飛蝗若蟲(chóng)進(jìn)行dsRNA注射，同時(shí)注射ds作為對(duì)照組。將dsRNA從飛蝗第2和3腹節(jié)連接處注入體腔，注射量為10 μg/頭，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭若蟲(chóng)。在注射后第5天取樣，分離飛蝗腹部背面表皮，方法參照1.6。

1.8 LmCht5-1在表皮中的組織定位及功能

取1.7中N4D4的表皮進(jìn)行固定。按照標(biāo)準(zhǔn)石蠟切片制備方法制備飛蝗表皮切片[17]。利用OVA- LmCht5-1抗體染色確定LmCht5-1的表達(dá)定位。切片厚度為5 μm，每張載玻片上保留3—5張切片。將表皮石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)，雙氧水處理后，滴加1滴1﹕1 000稀釋的OVA-LmCht5-1抗體，室溫孵育2 h。洗滌后滴加1滴聚合物增強(qiáng)劑，室溫孵育20 min。再次洗滌滴加1滴羊抗兔HRP，室溫孵育30 min。PBS（pH 7.4）沖洗3次，每次5 min。

利用Fluorescent Brightener 28（FB28）染色確定ds干擾對(duì)表皮幾丁質(zhì)的影響。在上述石蠟切片中滴加1滴FB28，室溫孵育10 min，中性樹(shù)膠封固，晾干后熒光顯微鏡下觀察，以確定樣品中幾丁質(zhì)的變化。

2 結(jié)果

2.1 飛蝗LmCht5-1高免疫活性載體構(gòu)建

利用MEGA軟件將和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)的前445AA與序列一致度極高，此區(qū)域無(wú)法作為抗原制備抗體而區(qū)分和。在446AA后，與氨基酸序列一致度上較低（圖1-A），此區(qū)域與其他比對(duì)的相似度較低。利用軟件BepiPred Server 2.0分析發(fā)現(xiàn)，的471—533AA氨基酸序列富含抗原表位，可以作為制備的抗原序列。

利用ClonemanageV7軟件將與抗原序列進(jìn)行虛擬偶聯(lián)后，通過(guò)TMHMM預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白可溶性差。隨后通過(guò)酶切連接將JMB88- OVA中的OVA片段連接至原核表達(dá)載體pET32a中，構(gòu)建pET32a-OVA骨架載體（圖1-B）；然后通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得抗原片段，通過(guò)酶切連接后插入至pET32a-OVA中，獲得可表達(dá)的高特異性抗原表達(dá)載體pET32a-OVA- LmCht5-1（圖1-C）。

2.2 OVA-LmCht5-1蛋白表達(dá)與純化

將構(gòu)建好的pET32a-OVA和pET32a-OVA- LmCht5-1分別轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)，挑取陽(yáng)性克隆在LB+Amp培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。隔日1﹕100接種，37℃培養(yǎng)4 h后，加0.5 mmol·L-1IPTG在16℃過(guò)夜誘導(dǎo)。收集菌液，超聲波破碎后，分別收集上清和沉淀，利用12% SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)OVA蛋白在沉淀中表達(dá)，分子量為64.37 kD，OVA-LmCht5-1重組蛋白也在沉淀中表達(dá)，分子量為71.34 kD（圖2-A）。

按照上述培養(yǎng)條件將pET32a-OVA-LmCht5-1擴(kuò)大培養(yǎng)至400 mL，破碎收集沉淀，用含8 mol·L-1尿素的緩沖液溶解包涵體后，利用Ni-NTA純化進(jìn)行。蛋白上柱前PB中大量OVA-LmCht5-1，而結(jié)合緩沖液BB中蛋白量明顯減少，說(shuō)明Ni柱對(duì)OVA-LmCht5-1有較強(qiáng)的結(jié)合能力。咪唑梯度洗脫后，在50—500 mmol·L-1的餾分中OVA-LmCht5-1量大，且條帶單一，雜蛋白含量少。收集50—500 mmol·L-1咪唑下的餾分，利用30 kD超濾離心管進(jìn)行超濾濃縮。利用BCA測(cè)定總蛋白濃度為400 μg·mL-1，可用于制備多克隆抗體（圖2-B），同時(shí)純化OVA蛋白，通過(guò)Ni-NTA純化發(fā)現(xiàn)，OVA蛋白在100和200 mmol·L-1咪唑濃度下的餾分中條帶單一，收集在100和200 mmol·L-1咪唑濃度下的餾分，利用30 kD超濾離心管進(jìn)行超濾濃縮，用于后續(xù)抗體特異性檢測(cè)與分析（圖2-C）。

A：LmCht5-1與LmCht5-2比對(duì)獲得特異性抗原序列LmCht5-1 specific antigen sequences through alignment with LmCht5-2；B：高免疫原性抗原通用載體pET32a-OVA Common high immunogenicity plasmid pET32a-OVA；C：OVA-LmCht5-1抗原表達(dá)載體Antigen expression plasmid pET32a-OVA

2.3 OVA-LmCht5-1 抗體制備及效價(jià)檢測(cè)

委托華大公司將OVA-LmCht5-1抗原與弗氏完全佐劑混合后注射新西蘭白兔，并進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫。28 d后從頸動(dòng)脈收集兔血液，通過(guò)離心收集到50 mL兔抗OVA-LmCht5-1血清抗體。在96孔酶標(biāo)板中包被抗原蛋白OVA-LmCht5-1，利用ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兔抗OVA-LmCht5-1抗體效價(jià)可達(dá)到1﹕102 400（表1），抗體產(chǎn)生效果良好，可用于后續(xù)Western blot和免疫組化檢測(cè)。

A：OVA和OVA-LmCht5-1原核表達(dá)The expression of OVA and OVA-LmCht5-1；B：抗原蛋白OVA-LmCht5-1純化The purification of OVA-LmCht5-1；C：OVA蛋白純化The purification of OVA。C：對(duì)照Control；S：上清Supernatant；P：沉淀precipitate；M：marker；PB：純化前蛋白Protein before purification；BB：結(jié)合緩沖液Binding buffer

表1 抗體效價(jià)檢測(cè)

Table 1 Detection of antibody titer

2.4 OVA-LmCht5-1 抗體特異性檢測(cè)

采用Western blot方法檢測(cè)OVA-LmCht5-1抗體的特異性。所選抗原蛋白為原核表達(dá)蛋白OVA- LmCht5-1和OVA、真核表達(dá)蛋白NAG、eCht5-1和eCht5-2[14]?？贵wOVA-LmCht5-1與抗原蛋白OVA- LmCht5-1雜交產(chǎn)生條帶為71.34 kD，與OVA雜交顯示條帶為64.37 kD，說(shuō)明抗體OVA-LmCht5-1能有效識(shí)別OVA-LmCht5-1和OVA的原核蛋白?？贵wOVA-LmCht5-1與eLmNAG、eLmCht5-2雜交不顯示任何條帶，而可以在eLmCht5-1中識(shí)別分子量為57.0 kD的蛋白，說(shuō)明該抗體有效識(shí)別LmCht5-1抗原，而不識(shí)別LmCht5-2抗原，實(shí)現(xiàn)對(duì)LmCht5-1和LmCht5-2的區(qū)分。提取飛蝗腸道MT和表皮CT的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OVA-LmCht5-1可識(shí)別樣品中分子量為56.0 kD的蛋白，與預(yù)樣本中LmCht5-1蛋白大小一致，表明OVA-LmCht5-1抗體可用于檢測(cè)飛蝗表皮中LmCht5-1的表達(dá)（圖3-A）。同時(shí)將免疫前陰性血清識(shí)別上述抗原，未有任何條帶產(chǎn)生，說(shuō)明新西蘭白兔自身血清中未含有識(shí)別LmCht5-1和OVA的抗體成分（圖3-B）。

2.5 飛蝗不同發(fā)育日齡表皮中LmCht5-1蛋白表達(dá)

提取飛蝗N4D1—N5D1中發(fā)育每天的飛蝗表皮蛋白，利用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LmCht5-1隨著飛蝗日齡增加而表達(dá)量逐漸升高，在飛蝗蛻皮當(dāng)天表達(dá)量達(dá)到最高。而在飛蝗蛻皮后的N5D1表達(dá)量快速降低，恢復(fù)到N4D1的起始水平（圖4）。

2.6 注射dsLmCht5-1對(duì)飛蝗LmCht5-1轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達(dá)的影響

在飛蝗N4D2注射ds和ds，在N4D5時(shí)提取飛蝗總RNA和表皮蛋白。RT-qPCR檢測(cè)顯示的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)降低70%（圖5-A），蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)量減少73.6%，說(shuō)明ds有效抑制在mRNA和蛋白水平的表達(dá)；同時(shí)說(shuō)明OVA-LmCht5-1可特異性地識(shí)別飛蝗體內(nèi)的LmCht5-1（圖5-B）。

A：OVA-LmCht5-1抗血清與不同蛋白雜交OVA-LmCht5-1 antibody hybridation with different kinds of antigen protein；B：陰性血清與不同蛋白雜交Negative antibody serum hybridation with different kinds of antigen protein。OVA-LmCht5-1：原核蛋白OVA-LmCht5-1 Prokaryotic expression protein OVA-LmCht5-1；OVA：原核蛋白OVA Prokaryotic expression protein OVA；eLmCht5-1：昆蟲(chóng)真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)LmCht5-1 Insect eukaryotic expression protein LmCht5-1；eLmCht5-2：昆蟲(chóng)真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)LmCht5-2 Insect eukaryotic expression protein LmCht5-2；eLmNAG：昆蟲(chóng)真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)LmNAG Insect eukaryotic expression protein LmNAG；MT：飛蝗中腸組織Midgut tissue of L. migratoria；CT：飛蝗表皮組織Cuticle tissue of L. migratoria

圖4 飛蝗不同發(fā)育日齡表皮中LmCht5-1蛋白表達(dá)

A：RNAi后mRNA水平檢測(cè)LmCht5-1表達(dá)mRNA level detection of LmCht5-1 by RT-qPCR；B：RNAi后蛋白水平檢測(cè)LmCht5-1表達(dá)Protein level detection of LmCht5-1 by Western blot

2.7 OVA-LmCht5-1檢測(cè)表皮中LmCht5-1定位及功能

取注射后發(fā)育至N4D4的飛蝗ds和ds的表皮樣品，制備石蠟切片，利用OVA-LmCht5-1抗體對(duì)其進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。OVA-LmCht5-1在注射ds的表皮樣本中無(wú)可見(jiàn)的信號(hào)，但OVA- LmCht5-1在注射ds的飛蝗表皮樣本中，可檢測(cè)到表達(dá)的強(qiáng)烈信號(hào)（圖6）。LmCht5-1蛋白在表皮細(xì)胞質(zhì)和舊表皮中表達(dá)。ds組在N4D4時(shí)，舊表皮結(jié)構(gòu)破壞，而同時(shí)期的ds組中表皮結(jié)構(gòu)完整，表明LmCht5-1蛋白的作用方式為降解表皮中的幾丁質(zhì)。

Cht5-1：幾丁質(zhì)酶5-1 Chitinase 5-1；Epi：表皮細(xì)胞Epidermis cell；OC：舊表皮Old cuticle

3 討論

抗體制備是昆蟲(chóng)基因功能研究的重要手段，然因昆蟲(chóng)蛋白序列未知、功能域結(jié)構(gòu)復(fù)雜、家族基因數(shù)量龐大而造成抗體制備困難[18]。筆者課題組曾通過(guò)多肽免疫制備幾丁質(zhì)合成酶和幾丁質(zhì)酶抗體，但均未獲得高效價(jià)的抗體，分析其原因?yàn)閹锥≠|(zhì)酶蛋白免疫原性差。一般來(lái)說(shuō)，提高抗原的免疫原性，是抗體制備成功的關(guān)鍵。雞卵清白蛋白OVA由386個(gè)氨基酸而組成，常作為蛋白添加劑用于提高生物藥或疫苗等的穩(wěn)定性，同時(shí)OVA也可以通過(guò)半抗原偶聯(lián)而作為載體蛋白用于抗體制備[19-20]。在本研究中首先通過(guò)序列比對(duì)和抗原決定簇分析，獲取特異性的抗原序列。將與特異性抗原序列進(jìn)行偶聯(lián)，通過(guò)原核表達(dá)與純化獲得大量的OVA-LmCht5-1抗原蛋白，用于制備多克隆抗體。

本研究中制備的OVA-LmCht5-1多克隆抗體利用ELISA進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)可達(dá)到1﹕102 400，足以滿足抗體使用需求。在抗體特異性方面，抗體OVA-LmCht5-1能有效識(shí)別體外真核表達(dá)的eLmCht5-1，識(shí)別分子量為57.0 kD的蛋白，而在eLmNAG和eLmCht5-2蛋白泳道中不產(chǎn)生雜交條帶，充分說(shuō)明所制備抗體識(shí)別的特異性。此外，抗體OVA-LmCht5-1可以有效識(shí)別飛蝗表皮與中腸中的LmCht5-1蛋白。免疫前血清不能與蛋白OVA-LmCht5-1、OVA、NAG、eLmCht5-1、eLmCht5-2、飛蝗表皮和飛蝗中腸蛋白產(chǎn)生可見(jiàn)的雜交條帶，進(jìn)一步表明，兔血清OVA-LmCht5-1是針對(duì)LmCht5-1的特異性抗體。OVA-LmCht5-1在ds注射組檢測(cè)到表達(dá)量極低的雜交條帶，而在對(duì)照組得到表達(dá)量較高的雜交條帶，不僅說(shuō)明ds直接影響LmCht5-1在蛋白水平的表達(dá)，而且進(jìn)一步證實(shí)抗體OVA-LmCht5-1特異性結(jié)合飛蝗表皮LmCht5-1蛋白。

4齡不同日齡的Western blot結(jié)果表明，LmCht5-1主要在第4和第5天表達(dá)，筆者課題組在mRNA水平研究表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)其在蛻皮前一天高表達(dá)[2]，而蛋白檢測(cè)則發(fā)現(xiàn)在蛻皮當(dāng)天高表達(dá)，推測(cè)與mRNA和蛋白在表達(dá)上的時(shí)間差異有關(guān)。在蛻皮當(dāng)天高表達(dá)，與其行使幾丁質(zhì)降解、協(xié)助表皮蛻去的生理學(xué)功能相符合。進(jìn)一步采用免疫組化技術(shù)鑒定LmCht5-1在飛蝗表皮組織中的表達(dá)位置和相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)OVA- LmCht5-1抗體可特異性識(shí)別組織切片中LmCht5-1，主要在表皮細(xì)胞和舊表皮中表達(dá)，這與桑卷葉蛾和赤擬谷盜的研究結(jié)果一致[9,21]。而利用免疫前陰性血清對(duì)上述切片進(jìn)行染色，未發(fā)現(xiàn)任何可見(jiàn)的信號(hào)，說(shuō)明免疫前血清中不含有對(duì)表皮組織切片進(jìn)行非特異結(jié)合的成分，進(jìn)一步鑒定了OVA-LmCht5-1抗體的特異性。

飛蝗的表皮富含幾丁質(zhì)，因此針對(duì)幾丁質(zhì)的代謝途徑進(jìn)行調(diào)控是防治害蟲(chóng)的重要手段。昆蟲(chóng)表皮發(fā)育關(guān)鍵基因功能的解析，有助于尋找新的靶標(biāo)基因作為害蟲(chóng)防治的靶點(diǎn)。筆者課題組已經(jīng)利用RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)合成酶[16,22-27]和幾丁質(zhì)酶[8,15,28]的缺失會(huì)引起飛蝗表皮形成與降解發(fā)生障礙而導(dǎo)致飛蝗死亡。飛蝗幾丁質(zhì)酶5是催化飛蝗表皮降解的關(guān)鍵酶，且存在基因擴(kuò)增現(xiàn)象，有2個(gè)亞型（和）[2]，與已報(bào)道的昆蟲(chóng)基因直系同源，通過(guò)向5齡若蟲(chóng)注射ds發(fā)現(xiàn)影響飛蝗5齡若蟲(chóng)到成蟲(chóng)期的蛻皮發(fā)育，造成飛蝗蛻皮困難而死亡；而-2是僅在飛蝗中發(fā)現(xiàn)的亞型，其若蟲(chóng)期干擾后未發(fā)現(xiàn)明顯的表型變化。利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)LmCht5-1和LmCht5-2進(jìn)行體外酶活性測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，LmCht5-1主要降解寡聚幾丁質(zhì)，而LmCht5-2主要負(fù)責(zé)降解多聚幾丁質(zhì)，二者的功能存在分化[29]。在飛蝗的胚胎發(fā)育過(guò)程中，和具有明顯的表達(dá)差異[8]，推測(cè)可能在飛蝗漿膜表皮降解和預(yù)若蟲(chóng)表皮降解中發(fā)揮不同功能。進(jìn)一步利用OVA-LmCht5-1抗體對(duì)蛋白進(jìn)行時(shí)空表達(dá)定位，將有助于解析和在飛蝗胚胎發(fā)育及其他發(fā)育階段的功能分化。

4 結(jié)論

偶聯(lián)與抗原序列可獲得高免疫原性的原核蛋白OVA-LmCht5-1；通過(guò)該抗原所制備的LmCht5-1多克隆抗體可特異性識(shí)別飛蝗體內(nèi)，可用于Western blot和免疫組化檢測(cè)。蛋白LmCht5-1在飛蝗4齡蛻皮當(dāng)天表達(dá)量最高，定位于表皮細(xì)胞和舊表皮中。ds可抑制LmCht5-1蛋白表達(dá)，減少表皮細(xì)胞和舊表皮中LmCht5-1的表達(dá)，阻礙舊表皮中幾丁質(zhì)的降解。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

The antibody preparation and expression analysis of Chitinase 5-1 in

ZHANG TingTing1, LIU WeiWei1,2, GAO Lu1,2, LI RenJian1,2, FU SuiYe1,2, LIU XiaoJian1, LI DaQi1,3, LIU WeiMin1, DONG Qing1,2, ZHANG JianZhen1

(1Institute of applied biology, Shanxi University, Taiyuan 030006;2College of life science, Shanxi University, Taiyuan 030006;3Institute of plant protection, Shanxi academy of agricultural sciences, Taiyuan 030031)

【Objective】The objective to this study is to prepare polyclonal antibody ofchitinase5-1 (LmCht5-1), establish method for detection ofprotein, understand the expression pattern of LmCht5-1 protein in the 4thinstar nymph and finally confirm its location and function.【Method】LmCht5-1 antigen structure area, which was selected by sequence alignment betweenandwith MEGA software and antigen epitope prediction analysis with the website of Expression, was amplified using cDNA ofas the template. The LmCht5-1 antigen sequence was cloned into expression vector pET32a-OVA, which contains ovalbumin to improve immunogenicity, to generate the antigen expression recombinant plasmid pET32a-OVA-LmCht5-1. pET32a-OVA-LmCht5-1 was then transformed intostrain BL21 (DE3). The IPTG induced OVA-LmCht5-1 was purified through Ni-NTA system and used as the antigen to generate polyclone antibody by rabbit immunization. The titer and specificity of OVA-LmCht5-1 were detected by ELISA and Western blot analysis, respectively. Then the expression pattern of LmCht5-1 in cuticle of the 4th instar nymph was analyzed in parallel by Western blot. Finally, the intracellular localization and function of LmCht5-1 in the 4thinstar nymph cuticle were detected by immunohistochemical analysis after the dsinjection. 【Result】The 5′ fragment (471-533AA) of LmCht5-1, which was selected as the antigen area with the sequence alignment between LmCht5-1 and LmCht5-2 and the epitope prediction analysis, was inserted into pET32a-OVA to obtain recombinant plasmid pET32a-OVA-LmCht5-1. The 71.34 kD recombinant protein OVA-LmCht5-1 was expressed, purified and immunized with rabbit to generate polyclone antibody. The titer of anti-serum of OVA-LmCht5-1 was 1﹕102 400 by ELISA detection. Antibody OVA-LmCht5-1 could accurately distinguish the LmCht5-1 but not LmCht5-2 in Western blot analysis. Further, it was found that the protein expression level of LmCht5-1 increasedgradually with the age in the 4th instar nymph ofand reached to the highest at the same day of molting, while it declined to the lowest after molting.Injection dsinto the 4th instar nymph led to the expression of LmCht5-1 significantly declined to 70.0% in mRNA level and 73.6% in protein level. The immunohistochemical analysis with the epidermis ofafter dsinjection, showed that LmCht5-1 was located in old cuticle and epidermis cell. Finally, it was found that the inhibition of protein expression of LmCht5-1 led to the chitin degradation blocking in old cuticle. 【Conclusion】High titer and specificity ofantibodies, which could be used for Western blot and immunohistochemistry analysis were obtained. The protein expression of LmCht5-1 reached to the highest level at the day of molting in 4th instar nymph. LmCht5-1 was located in the epidermis cell and old cuticle in the 4th instar nymph. Moreover, the injection of dstocould inhibit the protein expression of LmCht5-1 in epidermis cells and old cuticle, and finally caused the chitin degradation deficiency in old cuticle.

; LmCht5-1; polyclonal antibody preparation; expression pattern analysis; Western blot

2018-01-15；

2018-02-26

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（31501905）、中國(guó)博士后科學(xué)基金（2016M591722）、山西省科技廳青年基金（201601D021120）

張婷婷，E-mail：zhangyanqiu3520@sxu.edu.cn。

張婷婷。通信作者張建珍，E-mail：zjz@sxu.edu.cn