黃 雨,劉保民,劉戌時(shí),張寅生

(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,江蘇省抗病毒靶向藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210023)

沃拉帕沙[((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-((E)-2-(5-(3-氟苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-1-甲基-3-氧代十二氫萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸乙酯]是默沙東公司首創(chuàng)的蛋白酶激活受體1(PAR-1)拮抗劑，是一種抗血小板制劑，旨在減少血小板聚集傾向，抑制血凝凝塊的形成[1]。2014年5月8日獲FDA批準(zhǔn)，用于心臟病發(fā)作患者或腿部動(dòng)脈栓塞患者，以降低進(jìn)一步心臟病發(fā)作和腦卒中等風(fēng)險(xiǎn)[2]。

近年來，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的化合物已經(jīng)廣泛的運(yùn)用于藥物的臨床研究當(dāng)中[3]，由于氘同位素與其他穩(wěn)定同位素(如13C,15N)相比價(jià)廉易得,故最為常用。為滿足開展沃拉帕沙生物等效性試驗(yàn)時(shí)樣品分析檢測的需要，本研究擬合成穩(wěn)定同位素氘標(biāo)記的沃拉帕沙,沃拉帕沙的高分辨質(zhì)譜顯示M+3仍有明顯出峰(0.68%)，所以需向沃拉帕沙分子中至少引入4個(gè)氘原子以避免原研藥M+3質(zhì)譜峰對氘代化合物主峰的影響。

制備氘代藥物分子有下列3種常用的方法:①以市售的氘代小分子化合物(如氘代甲醇或氘代乙醇)為氘代源,通過一步或多步反應(yīng)制備氘代藥;②用氘代還原試劑(如LiAlD4,NaBD4)為氘代源,還原不飽和鍵來制備氘代藥;③在金屬或酸堿催化下,用氘代水(D2O)直接與藥物分子進(jìn)行氫(H)-氘(D)交換來制備氘代藥(此法最為高效)。當(dāng)然,不同的藥物分子有時(shí)需要設(shè)計(jì)不同的引入氘原子的途徑,本文采用了①和③組合的途徑來制備所需的氘代沃拉帕沙。

1 材 料

1.1 試 劑

除特殊注明外，所有反應(yīng)均在干燥的反應(yīng)瓶中通氮?dú)鈹嚢柽M(jìn)行。采用硅膠GF254薄板(青島海洋化工廠)作薄層色譜分析，柱色譜采用煙臺(tái)康必諾化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的硅膠(200～300目)裝柱。沃拉帕沙(1)和中間體5[((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-(二苯基氨基甲?；?-1-甲基-3-氧代十二氫萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸對硝基苯酯]由正大天晴藥業(yè)集團(tuán)合成研究所提供，其他所有商業(yè)化試劑均為市售化學(xué)純或分析純產(chǎn)品，除特別說明外，未經(jīng)處理直接使用。氘代硫酸(D2SO4,D≥99.5%)和氘代乙醇(C2D5OD,D≥99.5%)購自Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司。

1.2 儀 器

1H NMR和13C NMR在Bruker AM-500型核磁共振儀上測定，以TMS為內(nèi)標(biāo)。高分辨質(zhì)譜采用AB SCIEX Triple TOF 4600高分辨質(zhì)譜儀測定。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用采用Agilent-ABI LC/MS 3200Q-Trap光譜儀測定。熔點(diǎn)采用BUCHI B-545熔點(diǎn)儀測定。

2 合成路徑

2.1 以氘代濃硫酸為氘源，對沃拉帕沙進(jìn)行直接氫氘交換

如表1所示，沃拉帕沙(1)與D2SO4在50 ℃下，反應(yīng)16 h后，高分辨質(zhì)譜顯示主要以D3為主，并且存在少量D0。純化后進(jìn)行二次氘代，仍是以D3為主，D4沒有增多的趨勢。LC-MS顯示沒有D0存在。在該條件下，原料降解不明顯。UPLC純度在90%左右；嘗試升高溫度至80 ℃，LC-MS顯示仍是以D3為主，原料降解明顯。結(jié)合核磁和高分辨質(zhì)譜，初步判斷氫-氘交換主要發(fā)生在氟代芳環(huán)的鄰位和對位。在酸性條件下，吡啶環(huán)活性降低，在上述條件下未發(fā)現(xiàn)氫-氘交換現(xiàn)象發(fā)生。

Table1 Hydrogen-deuterium exchange of vorapaxar under concentrated D2SO4conditions

Entryt/hT/°CIsotope abundance of compound 1a/%11650[Ma+3]:100;[M+4]:26.7;[M+2]:17.2;[M+5]:4.9;[M+1]:1.5;[M]:0.3921280[M+3]:100;[M+4]:36.8;[M+2]:15.8;[M+5]:5.3;[M+1]:1.1

Reagents and conditions:Compound1(0.4 mmol),D2SO4(16 mmol);aHRMS (m/z[M+H]+) of compound1

2.2 以沃拉帕沙為起始原料合成[D5]沃拉帕沙(4)

以沃拉帕沙(1)為起始原料(路線1)，在鹽酸和冰醋酸混合體系下高溫水解得到化合物2[4]，收率為98.7%?；衔?在三乙胺存在下與氯甲酸對硝基苯酯縮合得到化合物3，收率為37.9%，此步反應(yīng)收率較低，有可能是實(shí)驗(yàn)過程中使用的氯甲酸對硝基苯酯變質(zhì)所致。化合物3在三乙胺下與購買的氘代乙醇([D6]CD3CD2OD)進(jìn)行酯交換反應(yīng)生成化合物4，收率為82%。高分辨質(zhì)譜顯示氘代化合物4存在著0.25%未標(biāo)記的沃拉帕沙(圖1)。由于本研究是以未標(biāo)記的沃拉帕沙為起始原料，所以其原因有可能是原料3中存在微量未反應(yīng)的沃拉帕沙所致。為了排除這個(gè)因素，本研究以中間體5為原料在三乙胺下與同一批次的氘代乙醇進(jìn)行酯交換反應(yīng)合成化合物6，結(jié)果顯示仍存在0.7%左右的未標(biāo)記乙醇進(jìn)行酯交換的副產(chǎn)物(圖2)。所以初步判斷，市售的氘代乙醇(如[D6]CD3CD2OD)會(huì)含有微量的未標(biāo)記乙醇(CH3CH2OH)，從而導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)物不合格。

Scheme1 Synthetic route of [D5]vorapaxar (4)

Reagents and conditions:(a) HCl/AcOH,118 °C,6 h;(b) 4-Nitrophenyl chloroformate (1.2 eq.),TEA (2 eq.),DCM,r.t.,30 min;(c) Ethanol-d6(50 eq.),TEA (3 eq.),65 °C,1.5 h

Figure1 HRMS (m/z[M+H]+) of compound4

Figure2 Synthesis and HRMS (m/z[M+H]+) of compound6

2.3 以[D5]沃拉帕沙為起始原料合成[D8]沃拉帕沙(7)

為了消除D0的存在，以氘代濃硫酸為氘源，再對化合物4進(jìn)行氫-氘交換(路線2)。50 ℃條件下，氘代濃硫酸中，反應(yīng)16 h后，以56.7%的收率得到化合物7。高分辨質(zhì)譜顯示化合物7主要以D8為主，沒有未標(biāo)記的沃拉帕沙存在(圖3)。HPLC純度為99.47%，滿足內(nèi)標(biāo)化合物的使用需求。結(jié)合氫譜和碳譜，初步判斷氫-氘交換主要發(fā)生在氟代芳環(huán)的鄰位和對位。

3 合成步驟及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

3.1 ((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-((E)-2-(5-(3-氟[2,4,6-D3]苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-1-甲基-3-氧代十二氫萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸乙酯(1a)

單口瓶中，依次加入沃拉帕沙(1，0.2 g,0.406 mmol)和[D2]濃硫酸(1.625 g,16.24 mmol)，N2保護(hù)下加熱到50 ℃反應(yīng)16 h，反應(yīng)結(jié)束后用碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH至堿性，然后向其中加入乙酸乙酯(50 mL)，萃取分液，水相用乙酸乙酯(50 mL)再次萃取，合并有機(jī)相，分別用水(50 mL)和飽和食鹽水(50 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮后，硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(2∶1)為洗脫劑得到白色粉末狀固體0.073 g，產(chǎn)率36.3%。mp:124～125 ℃；1H NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ:8.89(1H,s,Ar-H),8.12(1H,d,J=10 Hz,Ar-H),7.55～7.53(2H,m, Ar-H,NH),7 .03(1H,d,J=10 Hz,Ar-H),6.72～6.67(1H,m,C==CH),6.60(1H,d,J=15 Hz,C==CH),4.87～4.83(1H,m,CH),3.99～3.94(2H,m,OCH2CH3),3.42(1H,s,CH),2.68～2.65(1H,m,CH),2.38～2.31(2H,m,2×CH),1.80～1.68(4H,m,2×CH2),1.31(3H,d,J=5 Hz,CH3),1.20～1.18(2H,m,CH2,CH),1.16～1.14(5H,m,OCH2CH3,CH2,CH),1.02～0.96(1H,m,CH2),0.89～0.83(1H,m,CH2)。13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:177.92,164.13,162.19,155.92,154.46,147.75,139.58,139.51,138.15,135.63,132.91,131.35,131.29,130.38,121.88,76.56,59.77,49.46,48.60,45.04,41.81,38.34,32.90,31.44,30.43,26.81,22.19,15.16。HRMS(ESI) Calcd.for C29H31D3FN2O4([M+H]+)m/z:496.269 1,Found:496.279 4。

Scheme2 Synthetic route for [D8] vorapaxar (7)

Figure3 HRMS (m/z[M+H]+) of vorapaxar (A) and [D8] vorapaxar (B)

3.2 (3R,3aS,4S,4aR,7R,8aR,9aR)-7-氨基-4-((E)-2-(5-(3-氟苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-3-甲基十二氫萘并[2,3-c]呋喃-1(3H)-酮(2)

150 mL耐壓瓶中，依次加入沃拉帕沙(1，3 g,6.09 mmol)、鹽酸(48.0 g,40 mL,1 317 mmol)和冰醋酸(20.98 g,20 mL,349 mmol)，將混合物加熱到118 ℃反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，向其中緩慢滴加飽和NaHCO3溶液(100 mL)調(diào)節(jié)pH至堿性，加入二氯甲烷(100 mL)萃取分液(乳化嚴(yán)重)，水相用二氯甲烷(60 mL)再次萃取，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥。過濾，濾液濃縮，抽干得到白色粉末狀固體2.22 g，產(chǎn)率98.7%。mp:112～113 ℃；1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:8.69(1H,s,Ar-H),7.74(1H,d,J=5 Hz,Ar-H),7.38～7.34(1H,m,Ar-H),7.29～7.27(1H,m,Ar-H),7.20～7.18(2H,m,Ar-H),7.03～7.00(1H,m,Ar-H),6.55～6.44(2H,m,2×C==CH),4.67(1H,s,CH),2.66～2.61(2H,m,2×CH),2.31～2.26(2H,m,2×CH),1.89～1.86(1H,m,CH2),1.81～1.79(3H,m,CH2,CH2),1.36(3H,d,J=5 Hz,CH3),1.23～1.16(1H,m,CH),1.13～0.99(3H,m,CH2,CH),0.88～0.82(2H,m,CH2)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:177.91,(164.27,162.31),154.13,148.11,(139.87,139.80),136.55,134.89,133.82,130.78,(130.72,130.66),(122.54,122.52),121.55,(115.00,114.83),(113.898,113.71),76.82,50.15,49.07,45.49,43.65,42.22,40.94,38.67,36.45,31.82,30.43,22.11。MS(ESI):m/z421.49[M+H]+。

3.3 ((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-((E)-2-(5-(3-氟苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-1-甲基-3-氧代十二氫萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸對硝基苯酯(3)

三口瓶中加入化合物2(0.5 g,1.189 mmol)，二氯甲烷(17 mL)和三乙胺(0.241 g,0.331 mL,2.378 mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下將混合物降溫至0 ℃。向其中加入氯甲酸對硝基苯酯(0.288 g,1.427 mmol)，然后升至室溫反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液濃縮，硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(2∶1)為洗脫劑得到白色粉末狀固體0.314g，產(chǎn)率37.9%。mp:145～146 ℃；1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:8.70(1H,s,Ar-H),8.16(2H,d,J=5 Hz,Ar-H),7.76(1H,d,J=5 Hz,Ar-H),7.39～7.35(1H,m,Ar-H),7.29(1H,d,J=5 Hz,Ar-H),7.24～7.19(4H,m,Ar-H),7.04～7.01(1H,m,Ar-H),6.57～6.47(2H,m,2×C==CH),5.02(1H,d,J=10 Hz,CH),4.69～4.66(1H,m,NH),3.56～3.54(1H,m,CH),2.65～2.64(1H,m,CH),2.34～2.30(2H,m,2×CH),2.07～2.05(2H,m,CH2),1.92～1.87(2H,m,CH2),1.38(3H,d,J=5 Hz,CH3),1.21～1.09(4H,m,CH2,2×CH),1.02～0.89(2H,m,CH2)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:177.72,(164.25,162.30),155.89,153.85,152.25,148.07,144.75,(139.74,139.68),135.94,135.03,133.99,130.97,(130.75,130.69),125.10,(122.54,122.51),121.93,121.86,(115.07,114.91),(113.88,113.71),76.81,50.17,48.85,45.24,41.99,40.71,39.78,38.46,32.89,31.57,30.17,22.11。MS(ESI):m/z586.59[M+H]+。

3.4 ((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-((E)-2-(5-(3-氟苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-1-甲基-3-氧代十二氫萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸[D5]乙酯(4)

單口瓶中，依次加入化合物3(0.14 g,0.239 mmol)和[D6]乙醇(0.624 g,0.7 mL,11.98 mmol)，將其置于60 ℃油浴中，然后向其中加入三乙胺(0.073 g,0.100 mL,0.717 mmol)，混合物在60 ℃下攪拌反應(yīng)1.5 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液濃縮，硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(1∶1)為洗脫劑得到白色粉末狀固體0.17 g，產(chǎn)率82%。mp:125～126 ℃；1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:8.70(1H,d,J=2.5 Hz,Ar-H),7.75～7.73(1H,m,Ar-H),7.39～7.34(1H,m,Ar-H),7.28(1H,d,J=8 Hz,Ar-H),7.21～7.17(2H,m,Ar-H),7.04～7.00(1H,m,Ar-H),6.56～6.51(1H,m,C==CH),6.47(1H,d,J=15.5 Hz,C==CH),4.69～4.63(1H,m,CH),4.46(1H,br.s,NH),3.46(1H,br.s,CH),2.66～2.61(1H,m,CH),2.33～2.27(2H,m,2×CH),1.99～1.94(2H,m,CH2),1.89～1.81(2H,m,CH2),1.36(3H,d,J=6.0 Hz,CH3),1.19～1.18(2H,m,CH2,CH),1.07～1.00(2H,m,CH2,CH),0.93～0.85(2H,m,CH2)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:177.72,(164.25,162.29),155.87,153.98,148.11,(139.84,139.78),136.15,134.90,133.85,130.88,(130.71,130.65),(122.53,122.50),121.73,(115.00,114.83),(113.87,113.69),76.75,49.52,48.94,45.29,42.03,40.78,40.22,38.53,33.23,31.60,30.21,22.10。HRMS(ESI) Calcd.for C29H29D5FN2O4([M+H]+)m/z:498.281 6,Found:498.281 5。

3.5 ((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-(二苯基氨基甲?；?-1-甲基-3-氧代十二氫萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸[D5]乙酯(6)

單口瓶中，依次加入中間體5(0.2 g,0.343 mmol)和[D6]乙醇(0.894 g,1 mL,17.15 mmol)，將其置于60 ℃油浴中，然后向其中加入三乙胺(0.104 g,0.143 mL,1.03 mmol)，混合物在60 ℃下攪拌反應(yīng)1.5 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液濃縮，硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(1∶1)為洗脫劑得到白色粉末狀固體0.11 g，產(chǎn)率60%。mp:195～196 ℃；HRMS(ESI) Calcd.for C29H30D5N2O5([M+H]+)m/z:496.286 0,Found:498.285 7。

3.6 ((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-((E)-2-(5-(3-氟[2,4,6-D3]苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-1-甲基-3-氧代十二氫萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸[D5]乙酯(7)

單口瓶中，依次加入化合物4(0.3 g,0.603 mmol)和[D2]濃硫酸(2.413 g,24.11 mmol)，N2保護(hù)下加熱到50 ℃反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后用碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH至堿性，然后向其中加入乙酸乙酯(50 mL)，萃取分液，水相用乙酸乙酯(50 mL)再次萃取，合并有機(jī)相，分別用水(50 mL)和飽和食鹽水(50 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮后，硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(2∶1)為洗脫劑得到白色粉末狀固體0.172 g，產(chǎn)率56.7%。mp:126～127℃；1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:8.79(1H,d,J=2 Hz,Ar-H),7.84～7.82(1H,m,Ar-H),7.45(1H,d,J=5.5 Hz,Ar-H),7.27(1H,d,J=8 Hz,Ar-H),6.61～6.54(2H,m,2×C==CH),4.75～4.73(1H,m,CH),4.50(1H,br.s,NH),3.52(1H,br.s,CH),2.72～2.70(1H,m,CH),2.41～2.37(2H,m,2×CH),2.08～2.03(2H,m,CH2),1.98～1.96(1H,m,CH2),1.94～1.90(1H,m,CH2),1.45(3H,d,J=5.5 Hz,CH3),1.29～1.25(2H,m,CH2,CH),1.16～1.12(2H,m,CH2,CH),0.99～0.94(2H,m,CH2)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:177.73,(164.21,162.25),155.88,153.99,148.12,(139.68,139.61),136.16,134.90,133.80,130.89,(130.50,130.43),121.75,76.76,49.51,48.94,45.30,42.04,40.78,40.22,38.53,33.24,31.60,30.21,22.10。HRMS(ESI) Calcd.for C29H26D8FN2O4([M+H]+)m/z:501.300 5,Found:501.306 3[M+H]+。

4 小 結(jié)

本研究以未標(biāo)記的沃拉帕沙為起始原料及氘代乙醇和氘代濃硫酸為氘源，經(jīng)過水解、縮合、酯交換和氫氘交換4步反應(yīng)高效地合成以D8為主的氘代沃拉帕沙。所有中間體和終產(chǎn)物均經(jīng)過核磁和高分辨質(zhì)譜確證，所制備氘代化合物[D8]沃拉帕沙滿足內(nèi)標(biāo)化合物的使用要求。值得注意的是市售的氘代乙醇(如[D6]CD3CD2OD)會(huì)含有微量的未標(biāo)記乙醇,從而導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)物不合格或給制備帶來麻煩。

參 考 文 獻(xiàn)

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