李清梅，王淑珍

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009)

蛋白質(zhì)的可逆性翻譯后修飾在真核細(xì)胞生物過程的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，常見的修飾類型包括糖基化、乙?；?、磷酸化、甲基化和泛素化等[1]。蛋白質(zhì)Neddylation修飾的機(jī)制與泛素化相似，神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)蛋白8(neuronal precursor cell-expressed developmentally down-regulated protein 8,NEDD8)在其激活酶NAE(NEDD8 activing enzyme，NAE)、結(jié)合酶E2、連接酶E3催化的多步級聯(lián)酶促反應(yīng)下，共價結(jié)合到底物蛋白質(zhì)上，從而調(diào)節(jié)靶蛋白的生物學(xué)功能[2]。近期研究表明，蛋白質(zhì)Neddylation修飾異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此Neddylation修飾已經(jīng)成為一種新的抗腫瘤治療的靶標(biāo)[3]。小分子抑制劑MLN4924(pevonedistat)是NAE的選擇性抑制劑，能通過抑制NAE的活性阻斷后續(xù)蛋白質(zhì)的Neddylation修飾反應(yīng)，從而抑制多種腫瘤相關(guān)信號通路，在各種臨床前腫瘤動物模型中表現(xiàn)出良好的抑瘤效果，目前已進(jìn)入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗[4]。本文就蛋白質(zhì)Neddylation修飾和其參與腫瘤細(xì)胞周期、凋亡、衰老、自噬、血管生成及免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行簡要介紹。

1 蛋白質(zhì)Neddylation修飾概述

1.1 蛋白質(zhì)Neddylation修飾的基本過程

NEDD8是由81個氨基酸組成且與泛素相似性高達(dá)80%的小蛋白，在真核生物中高度保守[2]。蛋白質(zhì)Neddylation修飾過程主要包括以下4步酶促反應(yīng)(圖1)：(1)NEDD8在其前體加工酶的作用下，被水解為C端暴露Gly76殘基的成熟NEDD8；(2)在NEDD8激活酶NAE的作用下，成熟NEDD8的Gly76與其活性位點的Cys形成一個高能量的硫酯鍵；(3)活化的NEDD8通過轉(zhuǎn)硫醇反應(yīng)被轉(zhuǎn)移到NEDD8結(jié)合酶E2(UBE2M/UBE2F)上；(4)NEDD8連接酶E3將NEDD8從E2酶轉(zhuǎn)移到底物蛋白上，使NEDD8通過共價鍵與底物的Lys殘基結(jié)合完成對特定蛋白的Neddylation修飾[5]。此外，在去NEDD8修飾酶的作用下，NEDD8也可以從底物蛋白上釋放出來重新進(jìn)入循環(huán)，即Deneddylation，以維持蛋白質(zhì)Neddylation修飾的動態(tài)平衡[2]。

圖1蛋白質(zhì)Neddylation修飾過程

SENP8/UCH-L3：NEDD8前體加工酶；UBA3與APPBP1的異二聚體(NAE)：NEDD8激活酶；UBE2M/UBE2F(E2)：NEDD8結(jié)合酶；E3：NEDD8連接酶；COP9/SENP8：去NEDD8修飾酶

1.2 參與蛋白質(zhì)Neddylation修飾的關(guān)鍵酶

參與蛋白質(zhì)Neddylation修飾的關(guān)鍵酶主要包括NEDD8前體加工酶、NEDD8激活酶NAE、NEDD8結(jié)合酶E2和NEDD8連接酶E3以及去NEDD8修飾酶。

1.2.1 NEDD8前體加工酶 NEDD8前體加工酶主要包括泛素羧基末端水解酶L3(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L3，UCH-L3)和NEDD8特異性蛋白酶1(NEDD8-specific protease 1,NEDP1/DEN1/SENP8)兩種。UCH-L3除了可以水解NEDD8外還可以加工泛素，但是SENP8只特異性水解NEDD8[6]。

1.2.2 NEDD8激活酶與結(jié)合酶 NEDD8激活酶NAE是由淀粉樣前體蛋白結(jié)合蛋白1(amyloid precursor protein-binding protein 1,APPBP1)和泛素樣修飾激活酶3(ubiquitin like modifier activating enzyme 3,UBA3)構(gòu)成的異源二聚體[7]。NEDD8結(jié)合酶E2則主要包括泛素結(jié)合酶E2M(ubiquitin conjugating enzyme E2M,UBE2M/UBC12)和泛素結(jié)合酶E2F(ubiquitin conjugating enzyme E2F,UBE2F)兩種。

1.2.3 NEDD8連接酶 與泛素化修飾的特異性一樣，Neddylation修飾的特異性主要體現(xiàn)在NEDD8 E3連接酶催化的最后一步酶促反應(yīng)上。目前已知的NEDD8 E3連接酶的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于泛素E3連接酶，包括：環(huán)指蛋白(RING-box protein,RBX)、鼠雙微體2(murine double minute 2,MDM2)、c-CBL(casitas B-lineage lymphoma)、凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis,IAPs)和最近報道的神經(jīng)突觸受體相關(guān)蛋白(rapsyn)等[4,8]。其中，RBX家族的NEDD8 E3連接酶研究的最為清楚，RBX1可與UBE2M聯(lián)合作用催化Cullin-RING泛素連接酶(Cullin RING ligases,CRLs)家族成員Cullin-1，-2，-3，-4A和-4B的Neddylation修飾，而RBX2可與UBE2F聯(lián)合作用催化Cullin-5的Neddylation修飾[9]。

1.2.4 去NEDD8修飾酶 去NEDD8修飾酶主要包括SENP8和組成型光形態(tài)發(fā)生因子9(constitutive photomorphogenesis 9,COP9)信號復(fù)合體。SENP8發(fā)揮Deneddylation功能時傾向于將NEDD8從多聚NEDD8修飾的底物蛋白上移除而保留單NEDD8修飾形式，非Cullin底物蛋白的Deneddylation修飾一般由SENP8負(fù)責(zé)[2,6]。COP9信號復(fù)合體由8個不同的亞基(COP9 signalosome subunit,CSN)組成，其相對分子質(zhì)量從大到小依次稱為CSN1(57 kD)～CSN8(22 kD)，其Deneddylation過程主要由CSN5負(fù)責(zé)[10]。

1.3 發(fā)生Neddylation修飾的底物蛋白質(zhì)

到目前為止，已知發(fā)生Neddylation修飾的底物蛋白質(zhì)大部分都是Cullin家族成員，包括Cullin-1,-2,-3,-4A,-4B和-5。Cullin被Neddylation修飾后可通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控多種半衰期較短的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子的泛素化修飾與降解，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤抑制因子和原癌蛋白等[4]。p53是迄今為止細(xì)胞中最為重要的腫瘤抑制因子之一，MDM2不僅催化其發(fā)生泛素化修飾，也介導(dǎo)了其Neddylation修飾。與泛素化降解不同，p53的Neddylation修飾只會抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性，而不影響其降解[11]。核糖體蛋白L11(ribosome protein L11,RPL11)和核糖體蛋白S14(ribosome protein S14,RPS14)等也可以在MDM2催化下發(fā)生Neddylation修飾，從而調(diào)節(jié)RPL11、RPS14的穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位[12-13]。乳腺癌相關(guān)蛋白3(breast cancer-associated protein 3，BCA3)、β-淀粉樣前體蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(the intracellular domain of amyloid precursor protein,AICD)和環(huán)中間的環(huán)型(RING in between RING，RBR)E3連接酶Parkin等也可以發(fā)生Neddylation修飾，參與調(diào)控各種生理或病理過程[14-16]。此外，除了常規(guī)功能性蛋白質(zhì)之外，作為染色體結(jié)構(gòu)的組蛋白同樣也可以發(fā)生Neddylation修飾，這種表觀遺傳修飾與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4,17]。例如，在HCT116細(xì)胞中，組蛋白2A(histone 2A,H2A)會在E3連接酶RNF168的作用下發(fā)生Neddylation修飾，拮抗H2A的泛素化修飾，從而抑制DNA的損傷修復(fù)[18]。盡管還有很多其他蛋白質(zhì)也可以發(fā)生Neddylation修飾，但是其對應(yīng)的NEDD8 E3連接酶并不清楚，因此，目前文獻(xiàn)報道的NEDD8 E3連接酶及其對應(yīng)的底物的種類并不是很多，總結(jié)如表1所示。

表1 NEDD8 E3連接酶及其對應(yīng)的底物

NEDD8 E3連接酶底 物參考文獻(xiàn)CRLsp21,p27,NF-κB,DEPTOR,HIF1α,RhoA,ATF4[19-31]RBX1Cullin-1,-2,-3,-4A,-4B[9]RBX2Cullin-5[9]RNF111RNF168Histone H4H2AH2B[4];[18]MDM2p53,RPL11,RPS14,HuR[4];[12-13]c-CBLTGF β RII[4]IAPsCaspase7[4]FBXO11p53[4]TFB3Cullin-3,-4[4]RapsynAchR-δ subunit[8]

2 蛋白質(zhì)Neddylation修飾與腫瘤的生物學(xué)過程

除了Neddylation修飾在腫瘤和正常組織中存在差異外，用NAE的抑制劑MLN4924處理腫瘤細(xì)胞時，會影響腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)過程。目前研究Neddylation修飾涉及的腫瘤生物學(xué)內(nèi)容主要包括：調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、參與細(xì)胞凋亡、衰老、自噬、調(diào)節(jié)血管生成及調(diào)控免疫細(xì)胞，如圖2所示。

2.1 Neddylation修飾與腫瘤細(xì)胞周期

用MLN4924處理不同類型腫瘤細(xì)胞或動物模型，發(fā)現(xiàn)抑制Neddylation修飾會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯，但是阻滯階段并不相同，提示MLN4924誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯存在多種不同機(jī)制[32]。Milhollen等[24]用MLN4924處理彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B lymphoma,DLBCL)細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，在MLN4924誘導(dǎo)下激活的B細(xì)胞樣(activated B-cell-like,ABC)DLBCL會快速增加磷酸化IκB-α的水平，減少p65蛋白的核內(nèi)表達(dá)，通過降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性引起G1期阻滯；但是在生發(fā)中心B細(xì)胞樣(germinal center B-cell-like,GC)DLBCL模型中，MLN4924則通過增加DNA復(fù)制因子Cdt-1的累積，誘導(dǎo)DNA重新復(fù)制造成S期阻滯。最近暨南大學(xué)潘景軒教授課題組發(fā)現(xiàn)，用MLN4924阻滯Neddylation修飾，對攜帶T315I點突變Bcr-Abl融合的慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞和白血病干細(xì)胞具有顯著抑制效果。其研究也顯示MLN4924可誘導(dǎo)多種p53野生型慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系以及CD34+干細(xì)胞中細(xì)胞周期抑制因子p27蛋白表達(dá)水平升高，引起G2/M期阻滯[22]。

圖2蛋白Neddylation修飾與腫瘤的生物學(xué)過程

2.2 Neddylation修飾與腫瘤細(xì)胞凋亡

抑制Neddylation修飾造成DNA重新復(fù)制和NF-κB信號通路失活后，不僅會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，還會導(dǎo)致多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[25]。在慢性淋巴性白血病B細(xì)胞模型中，Godbersen等[26]發(fā)現(xiàn)MLN4924可通過失活NF-κB信號，調(diào)節(jié)Bcl-2家族促凋亡蛋白Bim和Noxa的水平導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在淋巴瘤細(xì)胞中，MLN4924可通過增加促凋亡相關(guān)蛋白(如Bik)和降低抗凋亡蛋白(如XIAP、c-IAP1和c-IAP2)的表達(dá)，激活內(nèi)源性凋亡信號通路[23]。Chen等[31]用MLN4924處理人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，抑制Neddylation修飾會增加CRLs底物激活轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4,ATF4)的穩(wěn)定性，激活轉(zhuǎn)錄因子CHOP，誘導(dǎo)死亡受體5(death receptor 5,DR5)的表達(dá)，從而激活外源性凋亡信號介導(dǎo)的凋亡通路。此外，在急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞(acute lymphoblastic leukemic cells，ALL)模型中，MLN4924還可通過激活eIF2α和mTOR信號通路誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[33]。

2.3 Neddylation修飾與腫瘤細(xì)胞衰老

衰老是一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重要機(jī)制，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老已成為治療腫瘤的策略之一。越來越多研究表明，MLN4924不僅可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，還可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。MLN4924誘導(dǎo)的衰老過程是不可逆的，其機(jī)制與腫瘤抑制因子p21蛋白的持續(xù)累積以及DNA損傷反應(yīng)的持續(xù)激活有關(guān)[19]。例如，Benamar等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤細(xì)胞中抑制Neddylation修飾后，會使CRL4-CDT2-SET8/p21軸泛素化和降解失活，從而誘導(dǎo)DNA重新復(fù)制和細(xì)胞衰老。在CKS1B基因特異性高表達(dá)的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中，MLN4924可以通過增加p21的蛋白穩(wěn)定性誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，干擾p21的表達(dá)后，會使這些細(xì)胞喪失對MLN4924的敏感性[21]。此外，在淋巴瘤細(xì)胞Raji和U937中，MLN4924可顯著上調(diào)衰老標(biāo)志物β-半乳糖苷酶的表達(dá)，增加腫瘤抑制因子p21/p27的蛋白穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞衰老[23]。

2.4 Neddylation修飾與腫瘤細(xì)胞自噬

自噬作為一種雙功能的細(xì)胞信號途徑，既可以在藥物作用時作為一個促凋亡信號發(fā)揮作用，也可以作為促生存的信號引起腫瘤細(xì)胞耐藥[34]。研究發(fā)現(xiàn)MLN4924可以降低磷酸化mTOR的蛋白水平，通過抑制mTOR活性引起細(xì)胞自噬。Zhao等[29]在研究中發(fā)現(xiàn)，MLN4924可通過調(diào)節(jié)HIF1-REDD1-TSC1-mTORC1-DEPTOR信號軸誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞系(例如，人宮頸癌HeLa細(xì)胞、乳腺癌SK-BR3和MDA-MB-231細(xì)胞)發(fā)生時間和劑量依賴性的細(xì)胞自噬。深入分析發(fā)現(xiàn)抑制Neddylation修飾后，引起CRLs的底物低氧誘導(dǎo)因子HIF1α和mTOR的抑制因子DEPTOR的水平升高，從而抑制mTOR活性[29]。此外，MLN4924還可通過提高活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平引發(fā)自噬[35]。

2.5 Neddylation修飾與腫瘤血管生成

惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展依賴于新生血管增殖與形成，新生血管可為不斷增殖的腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)，抑制新生血管生成策略在臨床上已表現(xiàn)出了顯著的抗腫瘤效果。研究表明，Neddylation修飾不僅對內(nèi)皮細(xì)胞的正常生理功能(例如，屏障功能和血管內(nèi)皮通透性)的調(diào)節(jié)非常重要[36]，也參與了腫瘤新生血管的生成[30]。Yao等[30]用MLN4924處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)發(fā)現(xiàn)，抑制Neddylation修飾后很快會引起Rho GTP酶家族成員RhoA的累積，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成活性，隨后會造成其他腫瘤抑制性CRLs蛋白底物的累積，引發(fā)DNA損傷反應(yīng)、細(xì)胞周期阻滯和凋亡。之后，他們在大鼠主動脈環(huán)實驗、雞胚絨毛尿囊膜實驗和基質(zhì)膠栓等經(jīng)典的血管生成實驗?zāi)Ｐ椭幸沧C明了MLN4924的有效性[30]。Jin等[27]發(fā)現(xiàn)抑制Neddylation修飾可破壞腫瘤干細(xì)胞特征，干擾NF-κB介導(dǎo)的VEGF-C的旁分泌，抑制新生血管生成，從而有效抑制葡萄膜惡性黑色素瘤的肝臟轉(zhuǎn)移。

2.6 Neddylation修飾與免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)

腫瘤微環(huán)境中存在多種類型的免疫細(xì)胞，它們在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著極為重要的作用[37]。研究表明，Neddylation修飾可以通過調(diào)節(jié)CRLs的底物(如NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子)的活性影響巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞的功能，參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的形成和重塑[28]。Chang等[38]課題組用MLN4924處理脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的巨噬細(xì)胞樣THP-1細(xì)胞，或用siRNA干擾巨噬細(xì)胞中NEDD8或UBC12的表達(dá)后，顯著降低了TNF-α和IL-6等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，證明Neddylation修飾對于LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的分泌是必需的。Asare等[39]的最新研究結(jié)果表明，MLN4924處理LPS刺激的巨噬細(xì)胞會使其從促炎的M1型向抗炎的M2型極化。同樣，MLN4924也能降低LPS誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，還能使未成熟的樹突狀細(xì)胞發(fā)生壞死性死亡[40-41]。此外，用MLN4924處理或敲除UBC12也都能降低效應(yīng)T細(xì)胞的激活、增殖和細(xì)胞因子的釋放[42-43]。

3 結(jié) 語

Neddylation修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，它不僅可以造成多種Cullin家族的底物蛋白泛素化降解，還可通過修飾其他非Cullin家族的底物蛋白，廣泛參與多種信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。越來越多研究結(jié)果證明Neddylation修飾與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，參與調(diào)控腫瘤的細(xì)胞周期、凋亡、衰老、自噬、血管生成以及免疫細(xì)胞等多種過程。因此，進(jìn)一步對Neddylation修飾中未知NEDD8 E3連接酶、蛋白底物及其調(diào)控各種細(xì)胞生物學(xué)過程機(jī)制的研究將對腫瘤治療具有十分重要的臨床意義及應(yīng)用前景。

參 考 文 獻(xiàn)

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