楊伊 張浩楠 李鳳娥 司同國

冷凍消融作為一種介入治療手段，可作為局限性前列腺癌（prostate cancer，PCa）的一線治療手段［1-2］。冷凍消融后，PCa壞死組織所釋放的大量腫瘤相關(guān)抗原及細胞因子等引起樹突狀細胞活化，從而激活效應(yīng)T細胞以發(fā)揮腫瘤免疫反應(yīng)（anti-tumor immune response，ATIR），又稱“冷凍免疫反應(yīng)”［3］。調(diào)節(jié)性T細胞（regulator T cell，Treg）是一個具有免疫抑制功能的T細胞亞群，在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮重要的作用［4-5］。細胞毒性T淋巴細胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）是Treg表面的一種免疫檢查點［6］，CTLA-4不僅可以通過與CD28競爭結(jié)合抗原提呈細胞表面的CD80（B7）阻斷共刺激信號，產(chǎn)生免疫抑制作用，還能夠傳遞抑制性信號，抑制細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的增殖與活化，進而抑制其抗腫瘤作用［6］。本研究旨在通過動物實驗，探究冷凍消融聯(lián)合抗CTLA-4抗體治療對腫瘤引流淋巴結(jié)（tumor draining lymph nodes，TDLNs）中Treg和CTL免疫功能狀態(tài)的改變，及其對小鼠總生存期（overall survival，OS）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 小鼠PCa細胞（RM-1）株由復(fù)旦大學(xué)細胞庫提供。清潔級純種近交系C57BL/6（H-2Db/b）7～9周雄性小鼠100只購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，體質(zhì)量17～23 g，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院SPF動物實驗室。100只小鼠隨機分為空白對照（A）組，冷凍消融治療（B）組，冷凍消融聯(lián)合抗CTLA-4抗體治療（C）組，抗CTLA-4抗體治療（D）組。本實驗遵從動物實驗基本管理條例和動物倫理學(xué)條例。

1.1.2 主要實驗設(shè)備及試劑 氬氦冷凍消融系統(tǒng)購自美國Endocare公司，流式細胞儀購自美國BD公司，PBS緩沖液購自北京中杉公司，F(xiàn)BS胎牛血清購自美國Hyclone公司，紅細胞裂解液購自上海哈靈公司，抗CTLA-4抗體購自美國Bioss公司，F(xiàn)ixation&Permeabilization Buffer購自美國eBioscience公司，抗CD4-PerCP、抗CD8-PE/Cy7、抗FOXP3-Alexa Flour 488、抗CD25-PE流式抗體及相應(yīng)同型對照購自美國Biolegend公司，乳酸脫氫酶（LDH）殺傷實驗試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 PCa小鼠模型建立 收集處于對數(shù)生長期的細胞，使用PBS溶液調(diào)整細胞濃度至1×107/mL，將100 μL RM-1細胞重懸液接種于小鼠右腹股溝皮下，每天觀察腫瘤生長狀態(tài)。

1.2.2 冷凍消融 待腫瘤生長直徑為0.8～1.0 cm時，將小鼠固定在無菌操作臺上，術(shù)區(qū)備皮、消毒、鋪巾，采用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，在瘤旁切開約1.5 mm的切口，將直徑2.0 mm的氬氦刀插入瘤體中心部位。A組未治療。B組行2次冷凍消融治療，每次先啟動氬氣，控制冷凍時間約30 s，冰球完全覆蓋腫瘤，瘤體表面完全覆蓋白色凍霜，中心約-115℃，再啟動氦氣，復(fù)溫至10℃后，撤出氬氦刀，皮膚縫合，肌注慶大霉素（8萬U/d）3天預(yù)防感染。C組方法同B組，并給予抗CTLA-4抗體（50 μg/只）腹腔注射。D組給予抗CTLA-4抗體（50 μg/只）腹腔注射。

1.2.3 標本采集 各組分別于治療前及治療后7、14、21天四個時間點，取各組5只小鼠，測量腫瘤大小并采集標本。高濃度CO2處死小鼠，瘤旁皮膚消毒并切開，手術(shù)鉗行鈍性分離，于股動靜脈鞘上方解剖分離TDLNs標本，配合PBS沖洗液于濾網(wǎng)內(nèi)研磨均勻，加入紅細胞裂解液混勻，使用10%FBS培養(yǎng)液配置單細胞懸液。生存起點定義為小鼠接受治療的時間點，生存終點定義為小鼠治療后的自然死亡時間。記錄各組最后5只小鼠OS。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測 取100 μL TDLNs細胞懸液加入流式管，分別在實驗組的標本管中，以抗CD4-PerCP、抗CD8-PE/Cy7流式抗體標記CTL，以抗CD4-PerCP、抗CD25-PE流式抗體分選Treg后使用Fixation&Permeabilization Buffer固定破膜處理30 min，以抗FOXP3-Alexa Flour 488流式抗體標記Treg；同時分別設(shè)置相應(yīng)的同型對照管。分別使用PBS配制200 μL細胞重懸液，上機進行檢測。

1.2.5 LDH細胞殺傷檢測 取TDLNs細胞懸液中分離出CD8+T細胞作為效應(yīng)細胞，RM-1細胞作為靶細胞。效應(yīng)細胞與靶細胞按效靶比20：1混合，LDH法檢測細胞殺傷活性。同時設(shè)本底組、自然釋放組、最大釋放組、機體校正組，計算殺傷率。殺傷率（%）=（實驗組吸光度-效應(yīng)細胞自然釋放組吸光度-靶細胞自然釋放組吸光度）/（最大釋放組吸光度-靶細胞自然釋放組吸光度）×100%。1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，繪圖采用GraphPad Prism 6軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，各時間點組間比較采用ANOVA方差分析、兩樣本的比較采用t檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同治療方法對TDLNs中Treg比例的影響

治療后14天與A組FOXP3+Treg比例相比，B、C組均下降（均P＜0.05）；與D組FOXP3+Treg比例相比，B、C組均下降（均P＜0.05）。治療后21天B、C組中FOXP3+Treg比例恢復(fù)至治療前（表1，圖1）。

表1 流式細胞術(shù)檢測TDLNs中的Treg比例（n=25）

圖1 治療后14天各組FOXP3+Treg比例變化

2.2 不同治療方法對TDLNs中CTL比例的影響

治療后14天與A組CD8+CTL比例相比，B、C、D組均增加（P＜0.05、P＜0.001、P＜0.05）；C組CD8+CTL比例較B、D組顯著增加（均P＜0.001）。治療后21天C、D組CD8+CTL比例均較A組增加（均P＜0.05）；C、D組CD8+CTL比例均較B組增加（均P＜0.05）。見表2，圖2。

2.3 不同治療方法對CTL殺傷活性的影響

治療后7天C組CTL殺傷活性較A、B、D組升高（均P＜0.05）。治療后14天與A組CTL殺傷活性相比，B、C、D組均升高（P＜0.05、P＜0.001、P＜0.05）；C組CTL殺傷活性較B、D組升高（均P＜0.05）。治療后21天與A組CTL殺傷活性相比，C、D組均升高（均P＜0.001）。見表3。

表2 流式細胞術(shù)檢測TDLNs中CD8+CTL比例（n=25）

圖2 治療后14天各組CD8+CTL比例變化

表3 TDLNs中CTL對RM-1細胞的殺傷活性（n=25）

2.4 不同治療方法對腫瘤大小及小鼠OS的影響

與A組腫瘤體積相比，B、C、D組均縮?。≒＜0.05、P＜0.001、P＜0.05）；B組與D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。C組腫瘤體積較B、D組均顯著縮?。ň鵓＜0.05）。冷凍消融治療或抗CTLA-4抗體治療后腫瘤體積縮小，聯(lián)合治療后腫瘤體積縮小更顯著（表4）。

A、B、C、D組OS分別為（25.60±1.52）天、（34.20±6.98）天、（43.60±2.88）天、（31.00±4.64）天。與A組小鼠OS相比，B、C組均延長（P＜0.05、P＜0.001）。C組小鼠OS較B、D組顯著延長（P＜0.05、P＜0.001）。冷凍消融治療使小鼠OS延長，聯(lián)合治療效果更加顯著（圖3）。

表4 各組腫瘤大小變化（n=25）

圖3 各組小鼠總體生存曲線

3 討論

近年來，我國PCa發(fā)病率呈上升趨勢，占男性惡性腫瘤的第6位［7］。對于早期PCa，冷凍消融治療的效果可以達到外科根治術(shù)水準［8］，同時也可作為中晚期PCa的補救治療［9-10］，但單純冷凍消融不能完全控制腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，其引發(fā)的“冷凍免疫反應(yīng)”有可能作為突破治療瓶頸的關(guān)鍵點。Treg是對ATIR產(chǎn)生負性調(diào)控作用的一個重要因素，CTL則是ATIR中產(chǎn)生腫瘤殺傷效應(yīng)的一個重要因素。抗CTLA-4抗體可以阻斷Treg表面的CTLA-4與CD80結(jié)合，從而增強CTL功能并增強ATIR［11］。距離PCa原發(fā)病灶最近的TDLNs是機體中重要的免疫監(jiān)視場所，因其含有大量的免疫細胞，最先產(chǎn)生ATIR；在腫瘤進展的過程中，TDLNs逐漸產(chǎn)生免疫耐受甚至免疫抑制，故其成為PCa轉(zhuǎn)移的第一個組織，因此，TDLNs在PCa的發(fā)展中具有重要的監(jiān)測價值。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比冷凍消融對下調(diào)Treg比例及上調(diào)CTL比例有一定作用，在降低Treg負性調(diào)節(jié)作用和增強CTL殺傷活性的同時加強ATIR，腫瘤體積顯著縮小，荷瘤小鼠OS延長。值得注意的是，單純抗CTLA-4抗體治療雖未明顯引起Treg比例變化，荷瘤小鼠OS也無明顯變化，但卻上調(diào)了CTL比例，至治療后21天仍保持逐漸增長的趨勢，此時CTL殺傷活性持續(xù)增強，腫瘤體積顯著縮小，ATIR持續(xù)時間較長，提示抗CTLA-4抗體影響CTL效應(yīng)，但與Treg數(shù)量無關(guān)，可能與阻斷Treg負性調(diào)節(jié)信號，增加正性共刺激信號的分子功能有關(guān)。本研究還顯示，聯(lián)合治療對下調(diào)Treg比例及上調(diào)CTL比例的效果顯著，且持續(xù)治療21天后，此時CTL殺傷活性持續(xù)增強，ATIR明顯加強，與單純冷凍消融或抗CTLA-4抗體治療相比，腫瘤體積縮小更加顯著，荷瘤小鼠OS得到明顯延長。

Waitz等［12］發(fā)現(xiàn)，對小鼠左側(cè)PCa移植瘤行冷凍消融后，在右側(cè)種植PCa移植瘤，并給予抗CTLA-4抗體治療后腫瘤微環(huán)境和脾臟中CD8+T細胞數(shù)量顯著增加，腫瘤內(nèi)效應(yīng)T細胞與Treg數(shù)量之比提高，機體提高了對第二個腫瘤的抵抗性，小鼠OS延長。Benzon等［13］在同一小鼠腹部兩側(cè)分別種植一大一小兩個PCa移植瘤，在注射抗CTLA-4抗體2天后，對大種植瘤進行冷凍消融治療。該研究中的單純抗CTLA-4抗體治療組既未減緩腫瘤生長也未延長小鼠OS，與單純冷凍消融組相比，聯(lián)合治療組的小種植瘤生長推遲了14.7天，小鼠死亡率下降4倍，提示聯(lián)合治療具有協(xié)同作用并對小種植瘤產(chǎn)生“遠位效應(yīng)”。聯(lián)合治療組Treg和CD8+T細胞比例均有所上升，但是二者比值卻未發(fā)生明顯改變，與本研究得出的ATIR與Treg數(shù)量無關(guān)的結(jié)論具有一致性，有待進一步探究Treg影響ATIR的具體作用機制。

本研究通過探討冷凍消融聯(lián)合抗CTLA-4抗體對Treg及CTL的影響，提示免疫檢查點CTLA-4可能是抑制Treg功能的重要分子靶點，冷凍消融聯(lián)合免疫治療可能是提高ATIR的治療方案，為PCa的系統(tǒng)治療提供了動物實驗依據(jù)，具有臨床指導(dǎo)意義。

[1]Onik G,Vaughan D,Lotenfoe R,et al.The"male lumpectomy":focal therapy for prostate cancer using cryoablation results in 48 patients with at least 2-year follow-up[J].Urol Oncol,2008,26(5):500-505.

[2]Onik G.Rationale for a"male lumpectomy,"a prostate cancer targeted approach using cryoablation:results in 21 patients with at least 2 years of follow-up[J].Cardiovasc Intervent Radiol,2008,31(1):98-106.

[3]Si TG,Guo Z,Wang HT,et al.Cryoablation for prostate cancer induces tumor-specific immune response[J].Zhonghua Nan Ke Xue,2009,15(4):350-353.

[4]den Brok MH,Sutmuller RP,Nierkens S,et al.Efficient loading of dendritic cells following cryo and radiofrequency ablation in combination with immune modulation induces anti-tumour immunity[J].Br J Cancer,2006,95(7):896-905.

[5]Beyer M,Schultze JL.Regulatory T cells in cancer[J].Blood,2006,108(3):804-811.

[6]Grosso JF,Jure-Kunkel MN.CTLA-4 blockade in tumor models:an overview of preclinical and translational research[J].Cancer Immun,2013,13:5.

[7]Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[8]Edison E,Tariq Shah T,Ahmed HU.Focal ablation of early-stage prostate cancer:candidate selection,treatment guidance,and assessment of outcome[J].Urol Clin North Am,2017,44(4):575-585.

[9]Golbari NM,Katz AE.Salvage Therapy options for local prostate cancer reecurrence after primary radiotherapy:a literature review[J].Curr Urol Rep,2017,18(8):63.

[10]Yilmaz S,?zdogan M,Cevener M,et al.Use of cryoablation beyond the prostate[J].Insights Imaging,2016,7(2):223-232.

[11]Li F,Guo Z,Yu H,et al.Anti-tumor immunological response induced by cryoablation and anti-CTLA-4 antibody in an in vivo RM-1 cell prostate cancer murine model[J].Neoplasma,2014,61(6):659-671.

[12]Waitz R,Solomon SB,Petre EN,et al.Potent induction of tumor immunity by combining tumor cryoablation with anti-CTLA-4 therapy[J].Cancer Res,2012,72(2):430-439.

[13]Benzon B,Glavaris SA,Simons BW,et al.Combining immune checkpoint blockade and cryoablation in an immunocompetent hormone sensitive murine model of prostate cancer[J].Prostate Cancer Prostatic Dis,2018,21(1):126-136.