廣西壯族自治區(qū)玉林市中西醫(yī)結合骨科醫(yī)院，廣西 玉林 537000

骨疏寧方是全國名老中醫(yī)賴祥林的經(jīng)驗方，由淫羊藿、骨碎補、制何首烏、丹參、續(xù)斷等中藥組成，主治老年性骨質疏松癥。前期試驗表明骨疏寧方有抗維甲酸及去卵巢所致大鼠骨質疏松癥作用；可治療原發(fā)性骨質疏松癥及骨質疏松癥引起的骨折、骨痛[1-4]。為推廣該方在臨床上的應用，結合本方各藥主要有效成分易溶于水的特點，擬將該方開發(fā)成口服液體制劑。本實驗采用單因素考察、正交試驗設計，以淫羊藿苷含量及干膏量為指標，優(yōu)選骨疏寧口服液最佳提取工藝。

1 實驗藥材與儀器

1.1 藥材與試劑 淫羊藿、骨碎補、制何首烏、丹參、續(xù)斷等十九味中藥均購自玉林市平安堂中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定，均符合《中國藥典》2015年版相關項下要求。淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號110737-200415)，乙腈(Fisher；色譜純)，95%乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)。

1.2 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津)，AB204-S型電子分析天平(梅特勒-托利多公司)，DHG-9006型9246A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏)

2 實驗方法與結果

2.1 淫羊藿苷含量的測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為C18柱(Inertsil ODS-SP， 5μm，4.6 mm×150 mm)，流動相為乙腈-水(30∶70)；流速為1 mL/min，檢測波長為270 nm，進樣量為10μL。理論塔板數(shù)以淫羊藿苷計算為1500。

2.1.2 對照品貯備液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品0.0135 g，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品母液。精密吸取1.0 mL對照品母液置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液(0.0108 mg/mL)。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取藥材，加20倍水，浸泡30 min后，煎煮2 h，濾過，濃縮，定容至100 mL容量瓶中作為供試品儲備液。精密量取上述儲備液10 mL，置聚酰胺層析柱(100～200目，6 g，內徑為1.5 cm)上，用蒸餾水100 mL洗脫，水洗液棄去，再用95%乙醇100 mL洗脫，收集醇洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，定量轉移至10 mL量瓶中并定容，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即為供試品溶液，檢測結果如圖1所示。

2.1.4 線性關系考察 分別精密吸取2.1.2項下對照品貯備液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL，按2.1.1項下的色譜條件進行測定，以對照品進樣量(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線。結果表明淫羊藿苷對照品進樣量在0.06～0.36 μg范圍內與峰面積線性關系良好。回歸方程為y=1940560.35x-274.13(R2=0.9999，n=6)。

2.2 干膏量的測定 精密量取供試品貯備液50 mL，置經(jīng)105 ℃干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干，105 ℃干燥3 h，取出冷卻，稱定重量，計算藥材的干膏量。

2.3 單因素考察與結果

2.3.1 提取時間的研究 按處方比例稱取一定量的藥材，各加入20倍的水，浸泡30 min后，分別煎煮1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h，濾過，濾液濃縮至100 mL，測定淫羊藿苷含量及藥材干膏量。實驗結果發(fā)現(xiàn)提取2.5 h、3 h、3.5 h的淫羊藿苷含量趨平，因此，選擇提取時間2.5 h、3 h、3.5 h設計正交試驗。見表1。

表1 提取時間研究結果

2.3.2 提取次數(shù)的研究 按處方比例稱取一定量的藥材，各加入20倍的水，浸泡30 min后，分別提取1次(時間3.5 h，加水20倍)、2次(時間2 h+1.5 h，加水11倍+9倍)、3次(時間1.5 h+1 h+1 h，加水8倍+6倍+6倍)，濾過，收集濾液，測定淫羊藿苷含量和藥材的干膏量，確定最佳提取次數(shù)。隨著提取次數(shù)的增多，淫羊藿苷含量、干膏量均逐漸增大，但2次以后，淫羊藿苷含量、干膏量均增長緩慢，為減少能耗，選擇提取1次、2次、3次設計正交試驗。見表2。

表2 提取次數(shù)研究結果

2.3.3 提取倍數(shù)的研究 按處方比例稱取一定量的藥材，分別加18(10+8)倍、20(11+9)倍、22(12+10)倍、24(13+11)倍、26(14+12)倍的水，浸泡30 min后，煎煮2次，第1次2 h，第2次1.5 h，濾過，收集濾液，測定淫羊藿苷含量和藥材的干膏量，確定最佳提取倍數(shù)。隨著提取倍數(shù)的增加，淫羊藿苷含量、干膏量逐漸增加，22倍后增加緩慢，不適當?shù)脑黾犹崛∪軇?，不僅浪費溶劑、能源，還給后續(xù)的濃縮工藝加大難度，因此，選擇20倍、22倍、24倍設計正交試驗。見表3。

表3 提取倍數(shù)研究結果

2.4 正交試驗優(yōu)選最佳提取工藝

2.4.1 因素水平設計 通過單因素試驗確定了提取時間、提取次數(shù)、提取倍數(shù)的因素范圍，并在其基礎上確定以下因素及水平。見表4、5。

表4 提取工藝正交試驗因素水平表

表5 骨疏寧口服液提取工藝正交試驗因素水平表

2.4.2 正交試驗設計 選用L9(34)正交試驗，以藥效成分淫羊藿苷含量及評價中藥提取效果的參考指標干膏量的綜合評分為指標，進行綜合加權評分，考察各因素對提取工藝的影響。本研究采用經(jīng)驗性權重法，根據(jù)評價指標的重要性確定權重系數(shù)：淫羊藿苷含量為60，干膏量為40。綜合評分=淫羊藿苷含量/最大淫羊藿苷含量×60+干膏量/最大干膏量×40。正交試驗設計及結果見表6。

表6 骨疏寧口服液提取工藝正交試驗設計及結果表

續(xù)表6

表6 骨疏寧口服液提取工藝正交試驗設計及結果表

2.4.3 方差分析結果 根據(jù)正交試驗分析結果和直觀分析可知，主次因素依次為C>B>A，即提取次數(shù)影響最大，其次為提取時間、提取倍數(shù)，最佳試驗條件為A1B3C2，即處方藥材分次加20(11+9)倍水，煎煮2次，第一次2 h，第二次1.5 h。見表7。

表7 骨疏寧口服液提取工藝正交試驗方差分析

注：F005(2，2)=19；F001(2，2)=99

2.6 最佳提取工藝驗證 根據(jù)正交試驗優(yōu)選出的最佳提取工藝，進行了3批樣品的驗證試驗，綜合評分RSD為1.83%，結果表明該提取工藝穩(wěn)定，可行，重復性好。工藝驗證結果見表8。

表8 工藝驗證結果

3 討論

方中君藥淫羊藿作為常用的補腎健骨中藥被廣泛應用于中醫(yī)骨科臨床，并對治療各種骨傷疾病有顯著療效，淫羊藿苷是淫羊藿中的主要活性成分，具有促進骨細胞增殖與分化的功能[5]，是反映該制劑藥效的一個重要指標；干膏量是藥效物質的總和，是制劑發(fā)揮療效的物質基礎，故本實驗以淫羊藿苷含量及干膏量作為優(yōu)化水提工藝的指標。

本方含19味中藥，成分復雜，曾對該制劑水煎液，干膏不同濃度的醇溶液進行高效液相色譜測定條件摸索，發(fā)現(xiàn)雜質峰較多，故采用聚酰胺進行凈化處理，先用蒸餾水洗脫，除去雜質，再用95%乙醇洗脫[6]，結果發(fā)現(xiàn)作為本制劑的君藥淫羊藿的主要有效成分淫羊藿苷色譜峰明顯，且易于定量分析。

本研究先通過單因素試驗確定骨疏寧口服液提取工藝各因素的因素范圍，再通過正交試驗對其水提工藝進行了優(yōu)化篩選，綜合評價了試驗結果及方法的可行性，并進行重復性驗證試驗，最終確定了本制劑的最佳水提工藝為處方藥材分次加20(11+9)倍水，煎煮2次，第1次2 h，第2次1.5 h。該提取工藝操作性強，穩(wěn)定性好，為骨疏寧口服液的開發(fā)提供了依據(jù)。

[1]呂琳，龐聲航，曾翠瓊，等.骨疏寧顆粒對維甲酸致大鼠骨質疏松的影響[J].廣西中醫(yī)學院學報，2008，11(1)：3-5.

[2]龐聲航，曾翠瓊，呂琳，等.骨疏寧顆粒治療去卵巢后骨質疏松大鼠的實驗研究[J].廣西中醫(yī)藥，2008，31(2)：54-56.

[3]李永斌，李開靜，賴祥林.骨疏寧治療原發(fā)性骨質疏松癥骨痛63例[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2007，9(6)：115.

[4]陳濤，黎觀保，賈世青，等.經(jīng)皮椎體成形術聯(lián)合骨疏寧片治療胸腰椎椎體骨折的臨床療效分析[J].中國臨床新醫(yī)學，2016，9(3)：201-204.

[5]戈勛，曹廣尚，孫洪勝，等.淫羊藿苷活性成分促進骨細胞增殖分化研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2018，24(3)：247-253.

[6]韓麗萍，陳行愉，鄧偉民. HPLC法同時測定補腎壯骨顆粒中柚皮苷和淫羊藿苷的含量[J].中成藥，2011，33(1)：184-186.