,,,,愛軍, ,曉兵,,

(浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310018)

豬病毒性腹瀉是一類呈全國性散發(fā)流行的急性、接觸性腸道傳染病。臨床上以引起仔豬水樣腹瀉、嘔吐、脫水消瘦甚至死亡為典型癥狀，成年豬多不可見臨床癥狀或僅有一過性軟便。該病病原主要有豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PoRV)，是影響我國生豬養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和健康可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。

2010年入冬以來，全國大部分地區(qū)豬場爆發(fā)了嚴(yán)重的仔豬病毒性腹瀉疫情，高發(fā)病率、高死亡率的流行態(tài)勢給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。隨后，徐麗華[2]等針對2008-2011年浙江省1118份臨床病豬病料展開病毒性腹瀉病原學(xué)調(diào)查，PEDV和TGEV感染率分別為84.4%和9.0%。張傳亮[3]等對2011-2012年浙江省采集的136份臨床腹瀉豬病料檢測結(jié)果顯示，PEDV檢出率最高，為59.56%；TGEV和PoRV的陽性率分別為2.94%和4.60%。為了解近幾年浙江省豬病毒性腹瀉流行變化情況，本研究于2016年4月至2017年3月在浙江省8個(gè)市的規(guī)?；B(yǎng)殖場隨機(jī)采集臨床健康豬糞便樣品611份、并對送檢發(fā)病豬小腸樣品50份進(jìn)行PEDV、TGEV、PoRV病原學(xué)檢測，旨在了解當(dāng)下浙江省養(yǎng)殖場中三種腹瀉病毒感染情況，從而為該病的防控指導(dǎo)工作提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑及儀器 MagMAXTM-96 viral RNA Isolation Kit(applied biosystems)購自杭州怡丹生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、異丙醇購自生工生物工程有限公司；PEDV、TGEV、PoRV三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司；RNase-free H2O購自寶生物工程(大連)有限公司。Kingfisher flex-96全自動核酸提取儀、小型高速離心機(jī)為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，羅氏LightCycler?480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為Roche公司產(chǎn)品。

1.1.2樣品來源 2016年4月至2017年3月，在浙江省8個(gè)市的32個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場采集臨床健康豬糞便樣品611份。50份臨床發(fā)病豬小腸樣品為2016年二季度來自浙江省6個(gè)市的16個(gè)規(guī)模豬場送檢樣品。

1.2方法

1.2.1樣品處理 取適量糞便樣品于2 mL離心管中，加入900 μL無菌PBS，渦旋震蕩3 min，10000 r/min離心5 min后取上清液于-80℃?zhèn)溆?。病豬小腸樣品取適量置于MP組織研磨管中，加入900 μL無菌PBS，每次3 min，反復(fù)研磨3次后于-40℃凍融3次，10000 r/min離心5 min后取上清液于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2核酸提取及熒光RT-PCR檢測 按照MagMAXTM-96 viral RNA試劑盒操作說明提取樣品病毒核酸。采用PEDV、TGEV、PoRV三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行三種腹瀉病毒的病原檢測，結(jié)果依據(jù)試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)確定。

2 結(jié)果與分析

2.1PEDV、TGEV、PoRV流行情況分析 采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法對611份豬糞便樣品、50份豬小腸樣品進(jìn)行PEDV、TGEV、PoRV檢測。結(jié)果顯示(見表1)，健康豬糞便樣品中PEDV陽性率為4.09%，PoRV陽性率為6.55%。50份發(fā)病豬小腸樣品的PEDV和PoRV檢出率分別為74.00%、6.00%，未檢出TGEV陽性樣品，亦未發(fā)現(xiàn)PEDV、TGEV、PoRV三種病原間的混合感染情況。較之近年來山東省[4]、黑龍江省[5]、廣西壯族自治區(qū)[6]關(guān)于豬腹瀉病的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，同樣以PEDV為腹瀉主要病原，其次為PoRV，表明浙江省豬病毒性腹瀉病流行趨勢與我國其他省份大體相符。

通過檢驗(yàn)健康豬糞便和發(fā)病豬小腸樣品中PoRV及PEDV陽性率的差異性，結(jié)果PoRV陽性率差異不顯著(P>0.05)，PEDV陽性率差異顯著(P<0.05)，表明PoRV感染不是目前豬腹瀉臨床發(fā)病的主要因素。由此可見，在浙江省PEDV仍為病毒性腹瀉的主要致病原，且在規(guī)?；B(yǎng)殖場中存在隱性帶毒現(xiàn)象，一旦氣候環(huán)境等條件發(fā)生變化，易發(fā)生疫情；通過日常流行病學(xué)監(jiān)測掌握各地區(qū)或豬場的隱性感染率基線，對于預(yù)警PEDV、PoRV流行發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)十分重要。

表1 不同類型樣品中腹瀉病原檢測結(jié)果

2.2健康豬場PEDV、PoRV和TGEV感染情況分析 PEDV、PoRV和TGEV在我省8個(gè)市中有7個(gè)市健康豬場中檢測到目標(biāo)病原污染的存在。場點(diǎn)分布情況顯示，針對此3種病原，32個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場的陽性率為53.13%，其中PEDV和PoRV的陽性率分別為28.13%和43.75%，同時(shí)存在PEDV與PoRV感染的場點(diǎn)占比達(dá)18.75%。各場點(diǎn)樣品陽性率波動較大，PoRV場點(diǎn)樣品陽性率最高為100%，PEDV則為20.00%，表明自2016年二季度以來，浙江省健康豬場中PEDV和PoRV的污染范圍較廣。

按時(shí)間分布進(jìn)行分析，自2016年第二季度至2017年第一季度(見圖1)，浙江省健康豬場在不同季節(jié)均有PEDV與PoRV感染。檢測結(jié)果表明，2017年第一季度PEDV陽性場比例上升趨勢明顯，與該階段豬場腹瀉發(fā)病高峰時(shí)間段一致，其他季節(jié)PEDV樣品陽性率均低于第一季度，但持續(xù)可檢測到病原，可能與近年來PED發(fā)病范圍有所擴(kuò)大、全年呈散發(fā)性流行有關(guān)。本次PoRV在全省的檢出率較2012年顯著上升[3]，盡管第一季度是腹瀉病高發(fā)季節(jié)，但PoRV檢測率為零，表明其非一季度引起豬腹瀉病高發(fā)的主要原因；其他季度的高檢出率提示著PoRV引起腹瀉病從而造成豬場損失的風(fēng)險(xiǎn)正在增加，需加強(qiáng)對該病原的監(jiān)控。

圖1 健康場不同時(shí)段PEDV、PoRV感染陽性率

2.3發(fā)病場3種病原感染情況的分析 50份發(fā)病豬小腸樣品檢測結(jié)果顯示，16個(gè)規(guī)模豬場中有12個(gè)規(guī)模豬場送檢的樣品均為PEDV陽性，1個(gè)場點(diǎn)樣品為PoRV陽性，可見PEDV仍為導(dǎo)致臨床腹瀉發(fā)病的主要疫原。本調(diào)查中，3個(gè)場點(diǎn)的豬小腸樣品，盡管臨床腹瀉癥狀明顯，但未檢出目的病原，說明除傳統(tǒng)病毒性病原PEDV、TGEV、PoRV外，還需對引起豬發(fā)生腹瀉的原因進(jìn)行深入分析。

對比相同時(shí)間段健康豬和發(fā)病豬樣品檢測結(jié)果(如圖2)，發(fā)病豬PEDV檢出率為74.00%，而健康豬未發(fā)現(xiàn)PEDV感染，表明在特定季節(jié)交替、早晚溫差變化的條件下，隱性感染豬受環(huán)境應(yīng)激的影響，PEDV引起發(fā)病的數(shù)量明顯上升。差異性分析顯示同期PoRV在發(fā)病豬和健康豬中的感染率無顯著差異，亦表明PoRV不是引起豬病毒性腹瀉病的主要病原。

圖2 相同時(shí)間段健康豬和發(fā)病豬檢測結(jié)果的比較

3 討論

近年來豬病毒性腹瀉廣泛存在于我國養(yǎng)殖場中，是引起仔豬高死亡率、嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的主要疫病之一。由于該病在不同地區(qū)的感染率差別較大，及時(shí)掌握不同區(qū)域病原的流行情況，將為該病的防控工作提供有效地指導(dǎo)。陳平潔[7]等對廣東省豬規(guī)?；B(yǎng)殖場豬病毒性腹瀉的調(diào)查研究顯示，PEDV檢出率最高(31.47%)，PoRV和TGEV的檢出率分別為27.92%和0%。李天芝[8]等針對2015年魯北地區(qū)豬病毒病檢測結(jié)果顯示，PEDV、PoRV和TGEV陽性檢出率分別為16.00%、4.20%和2.80%，其中三種病原在散養(yǎng)(場)戶的檢出率均略高于規(guī)模場。大北農(nóng)集團(tuán)北京動物醫(yī)學(xué)研究中心[9]對2011年至2015年9月全國送檢腹瀉仔豬病例的病原學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，2010年以來我國PEDV和TGEV的感染十分普遍，以PEDV為主導(dǎo)。本研究結(jié)果證實(shí)，近年來浙江省傳統(tǒng)病毒性腹瀉病原的流行風(fēng)險(xiǎn)較低，且呈現(xiàn)較為平穩(wěn)的流行態(tài)勢。近兩年來，PEDV仍是引起浙江省豬病毒性腹瀉的主要疫病病原，與其他區(qū)域稍有差異的是未檢測到TGEV感染。盡管在豬腹瀉病高發(fā)時(shí)段PoRV的檢出率為零，但臨床健康場PoRV的高檢出率，提示目前在本地區(qū)的病毒性腹瀉病防控中除PEDV這一重點(diǎn)病原外，PoRV引起腹瀉的潛在風(fēng)險(xiǎn)需加以重視。

近年的調(diào)查研究認(rèn)為，腹瀉類病例趨于復(fù)雜化，PEDV與TGEV、PDCOV(δ冠狀病毒)等混合感染比例升高，且流行毒株多為變異株[9]。豬病毒性腹瀉是一類與豬場飼養(yǎng)管理水平和衛(wèi)生狀況緊密相關(guān)的疫病，隨著浙江省養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；?、集約化發(fā)展，為有效防治腹瀉類疫病，一方面要做好豬舍保溫、消毒等衛(wèi)生管理工作，尤其是季節(jié)交替時(shí)段，以有效控制PoRV的流行；另一方面應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，了解流行毒株，針對性地選用PEDV、TGEV和PoRV二聯(lián)或三聯(lián)疫苗，并制定合理的免疫程序進(jìn)行預(yù)防十分必要。

[1] 李瑞香,王翠萍.豬病毒性腹瀉病的流行特點(diǎn)及防控措施[J].畜牧與飼料科學(xué),2016,37(2):111-112.

[2] 徐麗華,王一成,袁秀芳,等. 2008-2011年浙江省豬主要病毒性疫病病原流行病學(xué)調(diào)查[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,24(3):383-387.

[3] 張傳亮,陳星宇,趙靈燕,等.浙江省豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查及防控對策[J].中國動物檢疫,2013,30(7):47-48.

[4] 薛瑞雪,田野,田夫林,等.山東省部分地區(qū)仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015,37(4):254-257.

[5] 竇海燕,秦立鑫,張智明,等.黑龍江省部分地區(qū)PEDV和TGEV流行病學(xué)調(diào)查[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊,2016,12:75-76.

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[8] 李天芝,于新友,王金良,等.2015年魯北地區(qū)豬病毒病檢測結(jié)果與分析[J].養(yǎng)豬SWINE PRODUCTION,2016,33:121-122.

[9] 近年來我國豬腹瀉病的病原情況及防控方法分析[J].中國動物保健，2016,1(18):39-40.

[10] 楊波.豬病毒性腹瀉病的特點(diǎn)與緊急防控措施[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問,2012,7:150.