王詩堯，孫晶

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510000；2深圳市婦幼保健院)

近年來卵巢癌的發(fā)病率和病死率仍不斷增加,尤其有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，預(yù)后較差，5年生存率不足30%。研究表明雷公藤紅素可抑制多種類型腫瘤生長并誘導(dǎo)其凋亡，有良好的抗腫瘤的作用[1,2]，但有關(guān)雷公藤紅素治療卵巢癌移植瘤的研究較少，且具體機(jī)制尚不明確[3]。本研究觀察了雷公藤紅素對大鼠卵巢癌移植瘤的抑瘤作用，并探討PI3K/mTOR信號通路和PTEN 蛋白在其中發(fā)揮的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、細(xì)胞及主要藥物、儀器 60只SPF級F344大鼠由廣東省職業(yè)衛(wèi)生檢測中心提供，動物許可證號: SYXK(粵)2014-0048，周齡4～6周，雌性，體質(zhì)量160～180 g。人卵巢癌HO-8910 細(xì)胞由上海鈺博生物科技有限公司提供，用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的Hyclone培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，間隔2～3 天需用胰酶消化傳代1 次，傳代3次后用于造模。

1.2 大鼠分組、卵巢癌移植瘤模型的建立及雷公藤紅素應(yīng)用 將60只F344大鼠隨機(jī)分為A、B、C組，各20只。各組大鼠飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，消毒右腋下皮膚，皮下接種人卵巢癌HO-8910 細(xì)胞溶液0.2 mL(細(xì)胞濃度2×107/mL)，密切觀察，移植瘤肉眼可見即為造模成功[4]。3組大鼠均造模成功。造模成功后固定大鼠，碘伏消毒大鼠反麥?zhǔn)宵c皮膚、回抽無血無氣泡，C組予雷公藤紅素40 mg / (kg·d)腹腔注射、B組予順鉑注射液40 mg /(kg·d)腹腔注射，A組予同等體積生理鹽水腹腔注射。各組均給藥30 d。

1.3 各組大鼠移植瘤體積測算 給藥前、給藥后30 d每組各處死10只大鼠，測移植瘤長徑、短徑，腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2。

1.4 各組大鼠卵巢癌移植瘤組織PI3K、p-mTOR、PTEN檢測 采用Western blotting法。取給藥30 d各組大鼠移植瘤，加入1 mg/mL的RIPA裂解液1 mL，勻漿機(jī)3 000 r/min勻漿15 min, 低溫離心機(jī) 12 000 r/min 離心10 min后取上清，-20 ℃保存待用。BCA法測定蛋白濃度。8%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，TBST洗3 次,每次10 min，5%牛奶封閉2 h后，TBST 再洗3 次，每次10 min。加入PI3K抗體(工作濃度1∶1 000)、 p-mTOR抗體(工作濃度1∶1 000)、 PTEN抗體(工作濃度1∶1 000)、β-actin抗體(工作濃度1∶2 000)4 ℃過夜，TBST 再洗3 次。加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔抗體(工作濃度1∶2 000)，室溫2 h , TBST 再洗3 次，顯色。采用Flo urChem V2 .0 凝膠成像分析軟件記錄每條電泳條帶的灰度值。 以目的蛋白條帶與內(nèi)參照β-actin條帶灰度值之比表示目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 給藥前和給藥后30 d各組大鼠卵巢癌移植瘤體積比較 給藥前和給藥后30 d各組大鼠卵巢癌移植瘤體積見表1。與給藥前相比，給藥后30 d各組大鼠卵巢癌移植瘤體積均大于給藥前(P均<0.05)；給藥后30 d，C組腫瘤體積小于A、B組(P均<0.05)，B組腫瘤體積小于A組(P<0.05)。

表1 給藥前和給藥后30 d各組大鼠卵巢癌移植瘤體積比較

注：與給藥前相比，*P<0.05；與A組相比，#P<0.05；與B組相比，ΔP<0.05。

2.2 各組大鼠卵巢癌移植瘤組織PI3K、p-mTOR、PTEN表達(dá)比較 各組大鼠卵巢癌移植瘤組織PI3K、p-mTOR、PTEN相對表達(dá)量見表2。卵巢癌移植瘤組織PI3K、p-mTOR、PTEN相對表達(dá)量C組高于B組(P均<0.05)，B組高于A組(P均<0.05)。

表2 各組大鼠卵巢癌移植瘤組織PI3K、p-mTOR、PTEN相對表達(dá)量比較

注：與A組相比，#P<0.05；與B組相比，ΔP<0.05。

3 討論

近年來隨著生活環(huán)境的不斷惡化和人們生活壓力的增加，各種癌癥的發(fā)病率不斷攀升，卵巢癌的發(fā)病率、病死率也在全國范圍內(nèi)急劇增長[4]。盡管近幾十年來隨著醫(yī)療水平的發(fā)展癌癥死亡人數(shù)有所下降，但卵巢癌仍然是世界范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)死亡的最主要原因之一。雷公藤紅素是第一個從雷公藤藤本植物中提取的主要活性物質(zhì)，是一種五環(huán)三萜類化合物[5，6]。研究表明雷公藤紅素可抑制多種類型腫瘤生長并誘導(dǎo)其凋亡，有良好的抗腫瘤作用[7,8]。雷公藤紅素除具有良好的抗炎功能外，還可以抑制C6 膠質(zhì)瘤、黑色素瘤抗炎、人慢性髓系白血病等多種癌癥惡性增殖[9～11]。但是目前雷公藤紅素對卵巢癌轉(zhuǎn)移瘤抑制情況的相關(guān)報道較少，且具體機(jī)制尚不明確。因此研究雷公藤紅素對卵巢癌轉(zhuǎn)移瘤的抑制作用及分子機(jī)制具有重要臨床意義。本研究結(jié)果顯示，給藥后30 d各組大鼠卵巢癌轉(zhuǎn)移瘤體積均大于給藥前，C組大鼠卵巢癌轉(zhuǎn)移瘤體積小于A、B組，B組大鼠卵巢癌轉(zhuǎn)移瘤體積小于A組。說明雷公藤紅素腹腔注射可抑制F344大鼠卵巢癌轉(zhuǎn)移瘤生長，且效果優(yōu)于傳統(tǒng)化療藥物順鉑。

PI3K/mTOR信號通路是在腫瘤形成中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞內(nèi)信號通路，PI3K/mTOR信號通路相關(guān)蛋白PI3K、p-mTOR是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、代謝、細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡的核心蛋白[12～15]。PTEN基因是一種經(jīng)典的抑癌基因，該基因編碼的蛋白具有特異性磷酸酶活性，可調(diào)控細(xì)胞核生長周期來抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移[16～18]。本研究結(jié)果顯示，給藥30 d后B、C組大鼠卵巢癌轉(zhuǎn)移瘤組織PI3K、p-mTOR、PTEN相對表達(dá)量與A組相比增加，且C組大于B組。因此我們推測雷公藤紅素可能通過激活PI3K/mTOR信號通路，增加瘤體內(nèi)PTEN表達(dá)增加來抑制大鼠卵巢癌轉(zhuǎn)移瘤。但是若要進(jìn)一步驗證這一推測，我們?nèi)孕枰M(jìn)行進(jìn)一步研究。

本研究的不足之處在于僅初步探討了雷公藤紅素對大鼠卵巢癌轉(zhuǎn)移瘤的抑制作用及可能涉及分子機(jī)制，但是沒有考慮雷公藤紅素劑量濃度對于卵巢癌影響，下一步我們將研究高、中、低劑量雷公藤紅素對卵巢癌抑制作用的影響。

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