朱丹峰，胡雪芹，張洪斌

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽合肥 230009)

磷脂酶是用于磷脂改性專一性較強(qiáng)的酶，能夠催化磷脂的各種水解反應(yīng)，并在一定?；氖荏w和供體存在下催化酯交換反應(yīng)，對磷脂的結(jié)構(gòu)進(jìn)行各種改變或修飾，從而得到不同結(jié)構(gòu)和用途的磷脂[1]。磷脂酶是脂肪酶的一種，是界面酶，能在脂質(zhì)-水界面催化水解磷脂，磷脂分散在水中，形成雙層膠束，膠束與水的界面就是酶反應(yīng)的點，反應(yīng)界面的大小直接反映反應(yīng)速度與水解程度[2-5]。磷脂酶能應(yīng)用于植物油的脫膠，即在煉油過程中(油脫膠)磷脂的去除[6-7]，相比傳統(tǒng)方法，酶法脫膠是一種經(jīng)濟(jì)節(jié)約、高效穩(wěn)定、綠色環(huán)保的脫膠方法。此外，其在焙烤食品工業(yè)、乳制品加工業(yè)、蛋黃醬加工業(yè)等領(lǐng)域具有重要用途[8]。微生物種類繁多，生長周期短，易于分離和誘變，可工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)，利用微生物發(fā)酵是工業(yè)化生產(chǎn)磷脂酶的良好途徑。因此，獲得高酶活的磷脂酶產(chǎn)生菌具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者從土樣中篩選磷脂酶產(chǎn)生菌株并對其特性進(jìn)行研究，以期為磷脂酶的生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1土壤樣品。合肥地區(qū)油脂類物質(zhì)污染后的表層土壤。

1.1.2培養(yǎng)基。孟加拉紅培養(yǎng)基(W/V)(分離真菌：加入放線菌酮以抑制真菌生長)：孟加拉紅培養(yǎng)基粉末3.5%，pH 7.2±0.2。真菌分離培養(yǎng)基(W/V)：大豆卵磷脂3.0%，(NH4)2SO40.2%，NaH2PO4·H2O 0.05%， K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.10%，瓊脂 2.0%，溴甲酚紫0.003 %，pH 7.2±0.2。真菌發(fā)酵培養(yǎng)基(W/V)：大豆卵磷脂3.0%，(NH4)2SO40.2%，NaH2PO4·H2O 0.05%， K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.10%，pH 7.2±0.2。滅菌條件：121 ℃滅菌20 min。

1.2產(chǎn)磷脂酶菌株的篩選

1.2.1平板初篩。將采集的土樣按照10倍稀釋法稀釋，使用分離平板培養(yǎng)基進(jìn)行菌株篩選。利用涂布法進(jìn)行涂布，30 ℃恒溫培養(yǎng)，菌落周圍產(chǎn)生透明圈者為磷脂酶產(chǎn)生菌。透明圈直徑和菌株直徑比越大則表明磷脂酶的活力越大。將有透明圈的菌株用劃線分離法進(jìn)行分離純化，并選擇純種的菌株進(jìn)行下一步復(fù)篩。

1.2.2搖瓶復(fù)篩。將平板初篩獲得的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，按照酶活力測定方法測定磷脂酶的活性，比較酶活力的大小，最終獲得產(chǎn)酶能力最高的菌株，并斜面保存。

1.3菌株鑒定

1.3.1形態(tài)鑒定。觀察菌株在分離培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、顏色等；參照《真菌鑒定手冊》確定菌種。

1.3.2分子生物學(xué)鑒定。利用真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，并以此為模板采用18S rDNA基因的通用引物NS6(5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′)和NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃10 min[9-10]。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定后，交由上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)GenBank上利用BLAST程序進(jìn)行相似性搜索，選取相似性最高且有效發(fā)表的典型菌株的序列，用ClustalX 1.83進(jìn)行序列比對，運用MEGA 4.0的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4磷脂酶活力的測定[11-12]將一定量經(jīng)丙酮提純的大豆卵磷脂溶于預(yù)訂pH緩沖液中，10 000 r/min均質(zhì)10 min，得到底物溶液。取100 mL三角瓶加20 mL底物溶液，于預(yù)訂溫度的水浴中預(yù)熱5 min，然后在各瓶中加入一定量的酶液，同時做空白樣品，混勻計時，在預(yù)訂溫度的水浴中180 r/min振蕩準(zhǔn)確反應(yīng)一定時間，于樣品中和空白瓶中立即補(bǔ)加95%乙醇10 mL終止反應(yīng)，取出，在自動滴定儀下用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計算標(biāo)準(zhǔn)堿液平均消耗量。

在特定條件下，1 min水解磷脂產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸所需的酶量即為1個磷脂酶活力單位U[13]。

X=(V-V0)×C×100/(0.1×t×m)

式中，X為樣品酶活力，U/mL；V為樣品消耗堿液的體積，mL；V0為空白消耗堿液的體積，mL；C為NaOH溶液的溶度，mol/L；t為反應(yīng)時間，min；m為酶液用量，mL。

1.5發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1不同碳源、復(fù)合碳源比例對菌株B8產(chǎn)磷脂酶的影響。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基其余組分和培養(yǎng)條件保持不變的情況下，以2%的比例，分別添加甘油、環(huán)糊精、蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、卵磷脂作為發(fā)酵產(chǎn)酶的碳源；根據(jù)碳源結(jié)果，卵磷脂是誘導(dǎo)物，考察碳源比例(麥芽糖和卵磷脂的比例為5∶1,4∶1,3∶1,2∶1,1∶1)對B8產(chǎn)酶的影響。

1.5.2氮源對菌株B8產(chǎn)磷脂酶的影響。以1.0%的比例，分別添加蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、(NH4)2HPO4、NH4Cl作為發(fā)酵的氮源，考察其對產(chǎn)酶的影響。

1.5.3無機(jī)鹽對B8菌株產(chǎn)磷脂酶的影響。選擇4種無機(jī)鹽：NaH2PO4·3H2O(0.04%、0.05%、0.06%)、K2HPO4·3H2O(0.05%、0.10%、0.15%)、MgSO4·7H2O(0.04%、0.05%、0.06%)、CaCl2(0.05%、0.10%、0.15%)，4種無機(jī)鹽設(shè)3個水平，以磷脂酶活力為指標(biāo)，選擇L9(34)進(jìn)行正交試驗[14]。

1.6培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.6.1轉(zhuǎn)速對菌株B8產(chǎn)磷脂酶的影響。在其他培養(yǎng)條件一致的條件下，將培養(yǎng)基在160、180、200、220、240 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h后，檢測磷脂酶活力，確定搖床轉(zhuǎn)速。

1.6.2發(fā)酵時間對菌株B8產(chǎn)磷脂酶的影響。在其他培養(yǎng)條件一致的條件下，搖床振蕩培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后檢測磷脂酶活力，確定最適發(fā)酵時間。

1.7磷脂酶特性研究

1.7.1反應(yīng)溫度對磷脂酶活力的影響。按照上述測定酶活的方法，將酶活力測定溫度分別設(shè)置為25、30、35、40、45、50、55 ℃，測定其酶活力，以確定磷脂酶的最適反應(yīng)溫度。

1.7.2pH對磷脂酶活力的影響。將酶活力測定初試pH分別設(shè)定為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，測定酶活力，以確定磷脂酶的最適pH。

2 結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)磷脂酶菌株的分離以卵磷脂為誘導(dǎo)物和底物，以溴甲酚紫為顯色劑對土壤樣本進(jìn)行分離，可以形成白色透明圈，此法能粗略分離產(chǎn)磷脂酶的菌株。將初篩得到的菌株發(fā)酵提取酶液，細(xì)菌發(fā)酵溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min，發(fā)酵2～3 d，放線菌和真菌發(fā)酵溫度30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,發(fā)酵3～5 d。每天觀察發(fā)酵液的狀態(tài)，發(fā)酵到一定程度后取出發(fā)酵液，8 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液即酶液，在新體系中催化卵磷脂生成GPC量作為評價標(biāo)準(zhǔn)。利用薄層色譜檢測產(chǎn)GPC的能力進(jìn)行初步定性分析，初篩得到的6株較優(yōu)菌株搖瓶發(fā)酵測定酶活，發(fā)現(xiàn)菌株B8活力最高，為2.06 U/mL,進(jìn)一步對該菌株進(jìn)行鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化。菌株B8轉(zhuǎn)化產(chǎn)物TLC檢測結(jié)果見圖1。

圖1 菌株B8轉(zhuǎn)化產(chǎn)物TLC檢測Fig.1 TLC test of transformation products from strain B8

2.2菌株B8的鑒定

2.2.1菌落形態(tài)鑒定。B8菌株在分離培養(yǎng)基能產(chǎn)生明顯的透明圈，菌落表面粗糙、蓬松，呈黑褐色，下層黏附在培養(yǎng)基上。

2.2.2菌株分子生物學(xué)鑒定。將菌株B8的18S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序得到一條1 281 bp左右的條帶，利用BLAST程序與GenBank中已登錄的基因序列進(jìn)行比對，選取同源性高且已定名菌株的相關(guān)序列信息，用ClustalX 1.83進(jìn)行序列比對，用MEGA 4.1的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)合菌落形態(tài)及18S rDNA基因序列的比對結(jié)果，鑒定菌株B8為黑曲霉(圖2)。

圖2 基于18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 18S rDNA sequences simility of selected strains

2.3發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1碳源對B8菌株產(chǎn)磷脂酶的影響。菌株B8以選定的7種碳源進(jìn)行發(fā)酵試驗，其中麥芽糖的發(fā)酵液酶活力最高，達(dá)2.21 U/mL，其次是卵磷脂、葡萄糖、乳糖、蔗糖及甘油，環(huán)糊精產(chǎn)酶效果最差(圖3)?？紤]到卵磷脂對酶有一定的誘導(dǎo)作用，繼續(xù)考察復(fù)合碳源(麥芽糖和卵磷脂的比例為5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1)對B8產(chǎn)酶的影響，結(jié)果顯示復(fù)合碳源較單一碳源有所提高，但各試驗組差別不大，其中麥芽糖和卵磷脂比例3∶1磷脂酶活力最高(圖4)。

2.3.2氮源對B8菌株產(chǎn)磷脂酶的影響。氮源能構(gòu)成微生物細(xì)胞和含氮的代謝產(chǎn)物，選擇合適的氮源對獲得高產(chǎn)量的磷脂酶有重要影響[15]。結(jié)果顯示，B8對有機(jī)氮源的利用效果較好，其中以麥芽糖作為氮源時，磷脂酶活力最高，達(dá)2.54 U/mL(圖5)。

2.3.3無機(jī)鹽的正交試驗。對NaH2PO4·3H2O(A)、K2HPO4·2H2O(B)、MgSO4·7H2O(C)、CaCl2(D)進(jìn)行正交設(shè)計試驗，進(jìn)一步確定無機(jī)鹽的最佳配比，結(jié)果見表1。由表1可知，各因素的影響由大到小依次為NaH2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、CaCl2。NaH2PO4·3H2O是影響發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果的最重要因素。最優(yōu)無機(jī)鹽的組成為NaH2PO4·3H2O 0.05%，K2HPO4·2H2O 0.10%，MgSO4·7H2O 0.06%，CaCl20.05%。

圖3 碳源對B8產(chǎn)磷脂酶的影響Fig.3 Effect of carbon sources on phospholipase activity of submerged cultured B8

圖4 復(fù)合碳源比例對B8產(chǎn)磷脂酶的影響Fig.4 Effect of compoud carbon sources on phospholipase activity of submerged cultured B8

圖5 氮源對B8產(chǎn)磷脂酶的影響Fig.5 Effect of nitrogen sources on phospholipase activity of submerged cultured B8

2.4培養(yǎng)條件優(yōu)化在確定發(fā)酵培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。由圖6可知，提高轉(zhuǎn)速可以提高發(fā)酵體系的溶氧濃度，對磷脂酶的合成非常有利，轉(zhuǎn)速220 r/min時酶活性最高。培養(yǎng)3～4 d時酶活力相對較高(圖7)，繼續(xù)培養(yǎng)營養(yǎng)條件惡化，菌體生長停滯甚至自溶，酶活降低。

表1無機(jī)鹽對B8產(chǎn)磷脂酶的正交試驗結(jié)果

Table.1QuadratureanalysisofinorganicsaltonphospholipaseactivityofsubmergedculturedB8

試驗號No.因素FactorABCD酶活Enzyme activity∥U/mL111112.350212222.440313332.610421232.790522313.140623122.830731322.590832132.480933212.420k12.4672.5772.5532.637k22.9202.6872.5502.620k32.4972.6202.7802.627R0.4530.1100.2300.017

圖6 轉(zhuǎn)速對B8產(chǎn)磷脂酶的影響Fig.6 Effect of nitrogen rotate on phospholipase activity of submerged cultured B8

圖7 培養(yǎng)時間對B8產(chǎn)磷脂酶的影響Fig.7 Effect of inculation time on phospholipase activity of submerged cultured B8

2.5磷脂酶特性

2.5.1反應(yīng)溫度對磷脂酶活性的影響。由圖8可知，發(fā)酵液的磷脂酶活約在30 ℃時達(dá)到最大，超過30 ℃后，酶活下降。這說明發(fā)酵得到的是一種低溫磷脂酶。

圖8 溫度對磷脂酶活性的影響Fig.8 Effect of temperature on phospholipase enzyme activity

2.5.2pH對磷脂酶活性的影響。由圖9可知，發(fā)酵液的磷脂酶活約在pH 7.5時達(dá)到最大，pH超過8.0后酶活顯著下降。這說明發(fā)酵得到的磷脂酶最佳pH為7.5。

圖9 pH對磷脂酶活性的影響Fig.9 Effect of pH on phospholipase enzyme activity

3 結(jié)論

生物酶催化反應(yīng)條件溫和，具有嚴(yán)格的對應(yīng)或區(qū)域選擇性，在工業(yè)化學(xué)合成中應(yīng)用十分廣泛，有機(jī)化學(xué)品的制造逐漸向生物法靠攏[16]。該試驗采用固體平板初篩和搖瓶復(fù)篩獲得了磷脂酶高產(chǎn)菌株，初步鑒定其為黑曲霉，對該菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化，通過搖瓶發(fā)酵檢測得出，復(fù)合碳源麥芽糖與大豆卵磷脂比例為1.5%與0.5%，最佳氮源為酵母粉1.0%，無機(jī)鹽組成為NaH2PO4·3H2O 0.05%，K2HPO4·2H2O 0.10%，MgSO4·7H2O 0.06%，CaCl20.05%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間4 d，較出發(fā)菌株酶活提高了1.61倍。菌株所產(chǎn)磷脂酶是低溫酶，其最適作用溫度為30 ℃，最適作用pH為7.5。

該菌種為野生菌，經(jīng)多次傳代后基本不變，適合作為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)研究，如誘變、基因重組和純化等，從而更好地用于磷脂改性與植物油脫膠。

[1] 郭浩.磷脂酶D高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[D].西安：西北大學(xué),2007.

[2] KHAN F I,NIZAMI B,ANWER R,et al.Structure prediction and functional analyses of a thermostable lipase obtained fromShewanellaputrefaciens[J].Journal of biomolecular structure & dynamics,2017,35(10):2123-2135.

[3] ARAVINDAN R,ANBUMATHI P,VIRUTHAGIRI T.Lipase applications in food industry[J].Indian journal of biotechnology,2007,6(2):141-158.

[4] ALOULOU A,RODRIGUEZ J A,FERNANDEZ S,et al.Exploring the specific features of interfacial enzymology based on lipase studies[J].Biochimica et biophysica acta,2006,1761(9):995-1013.

[5] 王大海,于才淵,楊天奎.磷脂酶A1催化水解大豆?jié)饪s磷脂的研究[J].食品工業(yè)科技，2008，29(2)：233-235.

[6] YU D Y,MA Y,JIANG L Z,et al.Optimization of magnetic immobilized phospholipase A1degumming process for soybean oil using response surface methodology[J].European food research & technology,2013,237(5):811-817.

[7] YU D Y,MA Y,XUE S J,et al.Characterization of immobilized phospholipase A1on magnetic nanoparticles for oil degumming application[J].LWT-Food Science and Technology,2013,50(2):519-525.

[8] CASADO V,MARTIN D,TORRES C F,et al.Phospholipases in food industry:A review[J].Methods in molecular biology,2012,861:495-523.

[9] 曹鳳明,楊小紅,馬鳴超,等.枯草芽孢桿菌近緣種群鑒定方法研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報,2014,41(5):968-974.

[10] 馮志彬,張娟,陳國忠,等.產(chǎn)L-天冬氨酸α-脫羧酶細(xì)菌的分離、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)報,2016,56(1):44-55.

[11] YANG J G,WANG Y H,YANG B,et al.Degumming of vegetable oil by a new microbial lipase[J].Food technology & biotechnology,2006,44(1):101-104.

[12] 占劍峰.磷脂酶A1的發(fā)酵制備、分離純化及催化特性的研究[D].合肥：合肥工業(yè)大學(xué),2013.

[13] 郭勇.酶工程原理與技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2005.

[14] 趙春海,闞振榮.無機(jī)鹽及微量元素對乙酰乳酸脫羧酶發(fā)酵活力的影響[J].中國釀造,2005,24(6):26-29.

[15] 沈萍，陳向東.微生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2007.

[16] OGAWA J,SHIMIZU S.Microbial enzymes:New industrial applications from traditional screening methods[J].Trends in biotechnology,1999,17(1):13-20.