朱士杰，施正祥

(1.浙江大學(xué)舟山醫(yī)院婦產(chǎn)科；2.神經(jīng)內(nèi)科，浙江 舟山 316000)

在人類的卵巢腫瘤患者中，其疾病的病理類型復(fù)雜，其中上皮性卵巢腫瘤的患者占大多數(shù)，包括黏液性、子宮內(nèi)膜樣以及漿液性的腫瘤及三種主要的亞型，三種亞型中漿液性的卵巢腫瘤患者占大多數(shù)[1]。漿液性卵巢癌具有容易轉(zhuǎn)移、早期臨床癥狀不明顯以及散播廣泛的生物學(xué)行為，在患者中超過(guò)70%的在明確診斷的時(shí)候已經(jīng)處于腫瘤的晚期，病人的5年生活率比較低，僅僅有30%[2]。漿液性的卵巢腫瘤由于早期的癥狀不明顯，所以其死亡率已經(jīng)成為婦科的惡性腫瘤中的首位，已然成為威脅人類女性健康的主要的癌癥之一[3]。漿液性卵巢癌的發(fā)生以及發(fā)展的機(jī)制尚未明確，所以尋找其的發(fā)病相關(guān)基因，并且及時(shí)阻斷發(fā)病過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在目前具有至關(guān)重要的意義[4]。

近些年的研究數(shù)據(jù)顯示，miRNA通過(guò)調(diào)控有些致癌基因以及抑制腫瘤細(xì)胞基因的表達(dá)從而影響腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖以及凋亡等的過(guò)程[5]。亦有大型研究顯示，埃茲蛋白(Ezrin)在癌細(xì)胞中的異常表達(dá)，能夠在惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以及浸潤(rùn)的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。RNA結(jié)合蛋白QKI-5作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)目的mRNA的穩(wěn)定性、定位以及翻譯的效率，從而影響細(xì)胞的生理以及病理的發(fā)展過(guò)程[7]。本研究通過(guò)檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白QKI-5、Ezrin等指標(biāo)在正常人群的卵巢上皮組織和漿液性卵巢癌患者組織中表達(dá)的差異，探討其與漿液性卵巢癌發(fā)生以及發(fā)展的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2012-2017年在舟山醫(yī)院就診的卵巢漿液性腫瘤患者40例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡滿18周歲；②患者均未接受過(guò)新輔助化療；③未合并其他嚴(yán)重合并癥，如嚴(yán)重的肝腎功能不全等；④神志清，臨床依從性好；⑤將研究告知患者以及家屬，得到同意并且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷不明確；②合并其他嚴(yán)重的疾??；③患者臨床依從性差。在我院門診招募20名健康受試者。

根據(jù)上述納入以及排除標(biāo)準(zhǔn)，共有40名患者被納入本研究當(dāng)中，作為觀察組研究對(duì)象，招募的20名健康受試者作為對(duì)照組。本研究經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2方法

1.2.1石蠟組織切片制備

將組織放置于5倍體積的10%福爾馬林溶液中，并進(jìn)行24h的固定。將組織中的水分在由低到高濃度梯度的乙醇中脫去，將玻片在二甲苯中進(jìn)行浸泡至組織透明。在熱板上將組織中所含軟硬石蠟進(jìn)行融化，并將其平穩(wěn)轉(zhuǎn)移置冷凍面板上，充分進(jìn)行冷卻凝固。然后將蠟塊固定好，在42℃ddH2O中，將3μm厚組織展平，在防脫載玻片表面，將切片平整貼附，將其放置于玻片盒中風(fēng)干過(guò)夜。

1.2.2標(biāo)本的處理

收集的觀察組的患者，其術(shù)中切下的癌組織直接放入凍存管中，放在液氮中干燥，并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。對(duì)照組的卵巢上皮細(xì)胞，是在開腹手術(shù)中或術(shù)后使用無(wú)菌細(xì)胞刷刷取卵巢表面的卵巢上皮細(xì)胞直接放入加入1mL Trizol的無(wú)菌的1.5mLEP管中，術(shù)后放入液氮中保存。

1.2.3 RNA結(jié)合蛋白QKI-5的測(cè)定

將40例觀察組漿液性腫瘤患者的腫瘤組織樣品和20例對(duì)照組受試者卵巢上皮細(xì)胞樣品取出，按照試劑盒說(shuō)明書的操作方法對(duì)于組織樣品進(jìn)行處理之后，使用實(shí)時(shí)定量的(polymerase chain reaction，PCR)方法對(duì)于組織樣本中的RNA結(jié)合蛋白QKI-5的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，并且及時(shí)記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 Ezrin的測(cè)定

將40例觀察組漿液性腫瘤患者的腫瘤組織樣品和20例對(duì)照組受試者卵巢上皮細(xì)胞樣品取出，采用免疫組織化學(xué)多聚體標(biāo)記兩步法對(duì)于樣本進(jìn)行檢測(cè)，其Ezrin在卵巢腫瘤組織與正常的卵巢上皮組織中的表達(dá)評(píng)分由其染色強(qiáng)度劃分成為4個(gè)等級(jí)，染色陽(yáng)性百分比也劃分為4個(gè)等級(jí)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)于RNA結(jié)合蛋白QKI-5與 Ezrin測(cè)定結(jié)果的判斷是由兩名資深的主任醫(yī)師在雙盲下讀取，并且取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。本研究中的所有數(shù)據(jù)全部采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料使用例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮細(xì)胞中QKI-5 mRNA水平的差異

QKI-5 mRNA在漿液性卵巢癌患者卵巢組織中的表達(dá)顯著的下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(t=2.71，P=0.01)，這說(shuō)明QKI-5在卵巢腫瘤組織中可能是一種抑制癌細(xì)胞的基因，見圖1。

注：*表示P<0.0001。

圖1漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮細(xì)胞中QKI-5mRNA水平的比較

Fig. 1 Comparison of QKI-5 mRNA levels in serous ovarian cancer tissues and normal ovarian epithelial cells (*meansP<0.0001)

2.2漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮細(xì)胞中Ezrin mRNA水平的差異

Ezrin在漿液性卵巢癌患者卵巢組織中的表達(dá)顯著的下調(diào)，下調(diào)大約4倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.72，P<0.01)，見圖2。

注：*表示P<0.0001。

圖2漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮細(xì)胞中Ezrin水平的比較

Fig. 2 Comparison of Ezrin levels in serous ovarian cancer tissues and normal ovarian epithelial cells (*meansP<0.0001)

2.3卵巢腫瘤組織和正常卵巢上皮組織中Ezrin的比較

Ezrin染色強(qiáng)度的劃分，依次為陰性：-；弱陽(yáng)性：+；陽(yáng)性：++；強(qiáng)陽(yáng)性：+++，觀察組40例卵巢腫瘤組織樣品中，Ezrin顯示陽(yáng)性的有39例，僅僅有1例染色結(jié)果陰性，其陽(yáng)性率為97.50%，見圖3。在20例對(duì)照組受試者卵巢上皮組織細(xì)胞中，其陽(yáng)性幾率為100.00%，兩組之間比較無(wú)顯著性差異(χ2=0.51，P=0.48)，見表1。

圖3 Ezrin染色強(qiáng)度的劃分

3討論

卵巢腫瘤是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其致死率一直穩(wěn)居?jì)D科腫瘤的首位[8]。在卵巢腫瘤的類型中，漿液性的卵巢腫瘤占大多數(shù)。但是對(duì)于漿液性的卵巢腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展機(jī)制，至今尚未清楚。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究均圍繞漿液性卵巢癌組織的發(fā)病以及發(fā)展機(jī)制進(jìn)行[9]。最近的研究均證實(shí)，漿液性的卵巢腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展機(jī)制與輸卵管的上皮細(xì)胞病變有相關(guān)性。目前，有研究已經(jīng)選取了輸卵管的上皮細(xì)胞組織作為對(duì)照，用來(lái)研究上皮性卵巢腫瘤的發(fā)病機(jī)制[10]。

3.1不同卵巢組織上皮細(xì)胞中QKI-5 mRNA的差異

QKI是一種STAR家族的結(jié)合蛋白，在其進(jìn)化的過(guò)程中具有高度保守的特征，并且在人類機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，是髓鞘發(fā)育的至關(guān)重要的蛋白質(zhì)之一。在小鼠中，QKI基因的突變能夠?qū)е滦∈笤诔錾熬退烙谛难芗∪庀到y(tǒng)的發(fā)育缺陷，或者在小鼠出生之后，臨床表現(xiàn)為快速的震顫以及強(qiáng)直性的驚厥發(fā)作[11]。QKI在血管的發(fā)生、細(xì)胞粘附、細(xì)胞生長(zhǎng)以及細(xì)胞凋亡等的過(guò)程中，亦發(fā)揮著及其的調(diào)節(jié)作用。QKI-5在神經(jīng)管的發(fā)育中，存在于多種細(xì)胞中均有表達(dá)，在成體的神經(jīng)元中反而沒(méi)有表達(dá)[12]。在QKI的家族中，只有QKI-5在胚胎的形成過(guò)程中亦有表達(dá)，是其發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量最高的異構(gòu)體[13]。先前的研究結(jié)果表明，QKI-5在多種腫瘤組織中的表達(dá)均比較低，可能影響腫瘤組織細(xì)胞的分化與增殖[14]。然而，QKI-5在卵巢腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)趨勢(shì)以及細(xì)胞學(xué)功能尚不清楚。在本研究中，QKI-5 mRNA在漿液性卵巢癌患者卵巢組織中的表達(dá)顯著的下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P<0.05)，這說(shuō)明QKI-5在卵巢腫瘤組織中可能是一種抑制癌細(xì)胞的基因。

3.2漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮細(xì)胞中Ezrin mRNA水平

在本研究中，Ezrin mRNA在漿液性卵巢癌患者卵巢組織中的表達(dá)顯著的下調(diào)，下調(diào)大約4倍，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P<0.05)。Ezrin 蛋白在2004年采用基因芯片的高等技術(shù)，在兩種間葉來(lái)源以及高低轉(zhuǎn)移的能力不同的骨肉瘤以及橫紋肌腫瘤中發(fā)現(xiàn)的[15]。有研究表示，Ezrin是細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架之間的連接蛋白，參與細(xì)胞膜區(qū)域的整合調(diào)節(jié)，以及細(xì)胞膜區(qū)域的穩(wěn)定性的調(diào)控，同時(shí)Ezrin能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜內(nèi)外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但是其在腫瘤組織中的作用卻尚未達(dá)成統(tǒng)一的意見[16]。有研究者采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Ezrin在幾種軟組織腫瘤中存在較高的表達(dá)，比如脂肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、滑膜肉瘤以及惡性外周神經(jīng)鞘瘤等，并且Ezrin和上述幾種軟組織肉瘤的浸潤(rùn)性的生長(zhǎng)過(guò)程有著密切的相關(guān)性[17]。

3.3漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮細(xì)胞中Ezrin的蛋白水平

在本研究中，觀察組的Ezrin顯示陽(yáng)性率為97.5%，而對(duì)照組受試者卵巢上皮組織細(xì)胞中，其陽(yáng)性幾率為100%。有研究亦發(fā)現(xiàn)，Ezrin在子宮內(nèi)膜腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)較高，并且其的高表達(dá)行為與患者的總生存期呈現(xiàn)反比例的關(guān)系，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Ezrin能夠作為侵襲性子宮內(nèi)膜腫瘤的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素存在[18]。但是也有很多研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin在腫瘤組織中出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，并且還存在重新定位的可能性，過(guò)度表達(dá)的Ezrin可能抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生以及發(fā)展過(guò)程[19]。有研究者發(fā)現(xiàn)，Ezrin和Moesin在結(jié)直腸腫瘤患者中的表達(dá)有下調(diào)的現(xiàn)象，并且存在著重新定位表達(dá)在細(xì)胞膜上的現(xiàn)象，Ezrin的表達(dá)和Dukes的分期呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系[20]。

綜上所述，RNA結(jié)合蛋白QKI-5、Ezrin的表達(dá)下調(diào)與漿液性卵巢癌患者腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展等的臨床病理過(guò)程息息相關(guān)，所以這兩個(gè)指標(biāo)有望成為卵巢癌早期診斷指標(biāo)，并為卵巢癌患者臨床治療提供新思路。

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