魏云計(jì)，馮 民，黃 娟，朱臻怡，何 健，沈金榮，何正和，秦 嫻，丁 濤

(1.淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局 國家飼料安全檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(淮安)，江蘇 淮安 223001；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局 動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心,江蘇 南京 210001)

伏馬毒素(又稱煙曲霉毒素)屬真菌毒素，是由串珠鐮刀菌、多育鐮刀菌和輪狀鐮刀菌等產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物[1-2]，為一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物，主要污染糧食類農(nóng)產(chǎn)品及其制品，尤其是玉米和玉米制品。目前發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素至少有28種，分為A、B、C和P族4類，每種類型又分為不同亞型，野生型菌株中產(chǎn)量最豐富為B族伏馬毒素。伏馬毒素以B族的伏馬毒素B1、伏馬毒素B2和伏馬毒素B3為主要存在形式，其中伏馬毒素B1最常見，約占總量的70%，廣泛存在于玉米、小米等農(nóng)作物中，是污染飼料的主要霉菌毒素之一，并且其毒性最強(qiáng)，對(duì)人類和動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生毒害作用。研究表明[3-5]，伏馬毒素可引起馬腦白質(zhì)軟化癥、豬肺水腫綜合癥、誘發(fā)人體食道癌、肝癌。1993年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將伏馬毒素劃為2B類致癌物。目前，我國對(duì)伏馬毒素尚無明確的限量規(guī)定[6]，但許多國家對(duì)伏馬毒素已制訂了限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟對(duì)伏馬毒素(伏馬毒素B1和伏馬毒素B2)的總量進(jìn)行了規(guī)定，玉米中限量為4 mg/kg，谷物類玉米基質(zhì)早餐及玉米基質(zhì)點(diǎn)心中的限量為0.8 mg/kg，嬰幼兒玉米制品中限量為0.2 mg/kg；美國FDA規(guī)定人類食用玉米中伏馬毒素總限量為2 mg/kg，F(xiàn)DA的畜牧醫(yī)學(xué)中心也發(fā)布了飼料中伏馬毒素的最高限量指導(dǎo)性公告，規(guī)定其限量為1～50 mg/kg，其中馬飼料限量為5 mg/kg，豬飼料限量為10 mg/kg，肉牛和家禽飼料為50 mg/kg；瑞士規(guī)定人類食物中伏馬毒素限量為1 mg/kg。

目前，國內(nèi)外關(guān)于食品中伏馬毒素檢測(cè)方法的報(bào)道較多，主要有酶聯(lián)免疫吸附法[7-8]、氣相色譜法[9]、液相色譜法[10-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-20]等。酶聯(lián)免疫吸附法操作簡單，快速，但靈敏度和準(zhǔn)確度較低，易受到基質(zhì)的干擾，出現(xiàn)假陽性結(jié)果；液相色譜法一般采用柱前或柱后衍生的方法進(jìn)行測(cè)定，需配備衍生裝置，分析成本較高，檢測(cè)周期長；氣相色譜法需對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行衍生化處理，方法穩(wěn)定性較差；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高，已成為近年來霉菌毒素測(cè)定的首選方法。近幾年采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中伏馬毒素的國家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)分析的目標(biāo)物一般為一種或兩種伏馬毒素，而3種伏馬毒素(B1、B2、B3)同時(shí)檢測(cè)的方法未見報(bào)道。本研究采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱有效去除基質(zhì)中的蛋白質(zhì)、磷脂干擾物，降低基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高的特性，建立了飼料中3種伏馬毒素簡單、快速、高效的分析方法，方法的定量限能滿足國家對(duì)飼料中霉菌毒素的監(jiān)控要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Scientific Accela液相色譜儀、TSQ Quantum Ultra EMR串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；Zorbax SB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國Agilent公司)；3K15低溫冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)；SB-5200DTD超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Oasis PRIME HLB小柱(60 mg/3 mL，美國Waters公司)。

乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸、乙酸銨(色譜純，美國Sigma公司)；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備。伏馬毒素B1(FB1)、伏馬毒素B2(FB2)、伏馬毒素B3(FB3)標(biāo)準(zhǔn)品均購自Sigma公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，得到質(zhì)量濃度為1.0 g/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃冰箱中避光保存；取上述各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 樣品前處理

稱取(5.00±0.05) g飼料于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈-水-甲酸(50∶49∶1)，在渦旋混合器上混勻30 s后，超聲提取15 min，以8 000 r/min離心5 min，取2 mL上清液，過PRIME HLB固相萃取柱，加入2 mL乙腈淋洗，收集全部流出液，于45 ℃水浴中氮吹至干，用1 mL乙腈-水(20∶80)溶解殘?jiān)靹蚝蠼?jīng)0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4 分析條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A為乙腈，B為5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)；流速：250 μL/min；進(jìn)樣量：25 μL。梯度洗脫程序：0～3.0 min，20%A；3.0～4.0 min，20%～60%A；4.0～8.0 min，60%～90%A；8.0～10.5 min，90%～20%A；10.5～13.5 min，20%A。

離子源：電噴霧離子(ESI)源，正離子掃描；離子源溫度：400 ℃；離子傳輸管溫度：350 ℃；噴霧電壓：3 000 V；鞘氣壓力：4.5 MPa；輔助氣壓力：1 MPa；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式檢測(cè)。其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 MRM監(jiān)測(cè)模式下伏馬毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of fumonisins in multiple reaction monitoring(MRM) mode

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將質(zhì)量濃度為1 mg/L的各化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液通過蠕動(dòng)泵分別直接注入質(zhì)譜儀中，流速為5 μL/min。由于伏馬毒素為兩性化合物，實(shí)驗(yàn)分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，兩種模式下化合物均有響應(yīng)，通過對(duì)輔助氣、噴霧電壓、透鏡補(bǔ)償電壓等參數(shù)優(yōu)化使之達(dá)到最高響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正離子模式下的儀器響應(yīng)遠(yuǎn)高于負(fù)離子模式，因此采用正離子模式進(jìn)行監(jiān)測(cè)。選取[M+H]+作為母離子，再對(duì)每種物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行碰撞能量、碰撞氣、透鏡補(bǔ)償電壓等參數(shù)優(yōu)化，使每種物質(zhì)的分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大，選擇相對(duì)豐度最強(qiáng)，色譜峰無干擾的碎片離子為定量離子，其他離子為定性離子，優(yōu)化后的參數(shù)見表1。

圖1 不同比例乙腈-水-甲酸對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig.1 Effect of different ratios of acetonitrile-water-formic acid on recoveries of the target compoundsratio of acetonitrile-water-formic acid(1-9):50∶49∶1；50∶48∶2；50∶47∶3;70∶29∶1；70∶28∶2；70∶27∶3；90∶9∶1；90∶8∶2；90∶7∶3

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

樣品中伏馬毒素常用的提取溶劑主要為甲醇、乙腈、甲醇水溶液、乙腈水溶液、酸性甲醇、酸性乙腈、酸性甲醇水溶液、酸性乙腈水溶液。實(shí)驗(yàn)在相同的空白飼料樣品中添加50.0 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，考察了上述溶劑的提取效果，結(jié)果表明酸性乙腈溶液作為提取溶劑時(shí)回收率最高。這是因?yàn)榉R毒素為兩性化合物，極性較強(qiáng)，其提取溶劑中加入甲酸和水可增加提取效率。為獲得最佳的提取效率，本實(shí)驗(yàn)對(duì)乙腈-水-甲酸的混合比例進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖1，以乙腈-水-甲酸(50∶49∶1)作為提取溶劑時(shí)，提取效率最高，故選其為本方法的提取溶劑。

2.3 凈化柱的選擇

飼料樣品提取后的基質(zhì)干擾物較多，應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定伏馬毒素存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，需對(duì)提取液進(jìn)行凈化。目前，伏馬毒素常用的凈化柱主要有免疫親和柱、多功能凈化柱和固相萃取柱(HLB、MAX)。免疫親和柱基于抗體抗原反應(yīng)，將特異性抗體連接在柱體內(nèi)，選擇性吸附樣品中的待測(cè)物，而雜質(zhì)不被吸附，柱上結(jié)合的目標(biāo)物再被特定的洗脫液洗脫下來，具有高度特異性但價(jià)格較高。實(shí)驗(yàn)選擇Multistep 211 Fum凈化柱、HLB、PRIME HLB、MAX固相萃取小柱分別對(duì)添加50.0 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的飼料提取液進(jìn)行凈化，外標(biāo)法定量。比較回收率后發(fā)現(xiàn)，伏馬毒素在HLB小柱上的保留性差，用甲醇洗脫后，大量的雜質(zhì)也被洗脫，凈化效果較差，回收率較低；Multistep 211 Fum凈化柱、PRIME HLB、MAX固相萃取小柱的凈化效果較好，回收率在60%以上，但Multistep 211 Fum凈化柱價(jià)格較PRIME HLB、MAX固相萃取小柱高，使用MAX固相萃取小柱需要活化及洗脫，步驟繁瑣，耗時(shí)較長。而PRIME HLB柱無需活化，提取液可直接過柱，操作簡單、快速，能夠有效去除基質(zhì)中的蛋白質(zhì)、磷脂干擾物，降低基質(zhì)效應(yīng)，回收率穩(wěn)定，因此實(shí)驗(yàn)最終選擇PRIME HLB小柱作為凈化柱。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

LC-MS/MS分析中存在基質(zhì)抑制或增強(qiáng)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)影響檢測(cè)的靈敏度、精密度及準(zhǔn)確度。基質(zhì)效應(yīng)以公式ME=(空白基質(zhì)標(biāo)樣的響應(yīng)值/純?nèi)軇?biāo)樣的響應(yīng)值-1)× 100%計(jì)算。當(dāng)ME為正值時(shí)表示基質(zhì)增強(qiáng)，ME為負(fù)值時(shí)表示基質(zhì)抑制，ME絕對(duì)值越大表示基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)越強(qiáng)。消除基質(zhì)效應(yīng)的手段主要有優(yōu)化前處理方法、使用同位素內(nèi)標(biāo)等。飼料基質(zhì)較為復(fù)雜，雖通過凈化柱可去除大部分基質(zhì)干擾，但仍存在一定的基質(zhì)抑制效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的考察結(jié)果表明，F(xiàn)B1、FB2、FB3的 ME分別為-24%、-26%、-30%，存在明顯基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此本文采用基質(zhì)匹配曲線校正回收率，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

圖2 加標(biāo)飼料(10 μg/kg)中伏馬毒素的MRM色譜圖Fig.2 Chromatograms of fumonisins in spiked feed samples(10 μg/kg)

2.5 線性范圍與定量下限

取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用空白基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、250.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用“1.4”優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定。以目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，3種目標(biāo)物在5.0～250.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，F(xiàn)B1、FB2、FB3的相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.998 2、0.996 7和0.997 5。在空白飼料中添加混合標(biāo)準(zhǔn)品，以特征定量離子對(duì)色譜峰的信噪比(S/N)為3作為檢出限(LOD)，S/N=10作為定量下限(LOQ)，得到3種待測(cè)物的LOD均為3 μg/kg，LOQ均為10 μg/kg。目標(biāo)物在定量下限加標(biāo)水平(10 μg/kg)下的MRM色譜圖見圖2。

2.6 回收率與精密度

在空白飼料樣品中分別添加低、中、高(10、20、50 μg/kg) 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)5次，用基質(zhì)匹配曲線校正，外標(biāo)法定量，得到方法的回收率及精密度。結(jié)果表明，目標(biāo)物的平均回收率為80.3%～93.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為7.5%～13.4%(見表2)。

表2 飼料中伏馬毒素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of fumonisins in spiked feeds(n=5)

2.7 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本方法對(duì)65份飼料樣品進(jìn)行測(cè)定，其中11份樣品檢出FB1，但含量(25.2～63.7 μg/kg)未超出FDA的規(guī)定，F(xiàn)B2、FB3未檢出。

3 結(jié) 論

本文建立了測(cè)定飼料中3種伏馬毒素含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。采用乙腈-水-甲酸(50∶49∶1)溶液提取，PRIME HLB固相萃取小柱凈化。本方法操作快速、簡單，穩(wěn)定性好，檢測(cè)成本低，方法的檢出限、回收率及精密度滿足國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)的要求，適用于飼料中3種伏馬毒素的定性與定量分析。

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