周長朋，劉 敏，李大栓，馬 壘，許 潔

(迪沙藥業(yè)集團(tuán)有限公司，山東 威海 264205)

坎地沙坦酯(Candesartan cilexetil)，化學(xué)名(±)-1-[[(環(huán)己氧代)羰基]氧代]乙基-2-乙氧基-1-[[2′-(1H-四氮唑基-5)-[1,1′-聯(lián)苯基]-4-基]甲基]-1H-苯并咪唑-7-羧酸酯，是一種新型選擇性血管緊張素Ⅱ受體(ATI)拮抗劑，可在體內(nèi)迅速被水解成活性代謝物坎地沙坦，通過與血管平滑肌ATI受體結(jié)合而拮抗血管緊張素Ⅱ的血管收縮作用，從而降低末梢血管阻力[1-3]。研究表明[4-5]，坎地沙坦酯在給藥間隔中可呈劑量依賴性地降低高血壓病人心舒張壓和收縮壓，降壓作用持久、平穩(wěn)，且耐受性良好，不良反應(yīng)較小，可用于較廣范圍高血壓病的治療，具有較為廣闊的市場(chǎng)前景和良好的實(shí)用性。

羥胺是一種還原劑，在坎地沙坦酯合成路線中主要用于還原某些氧化劑，但其對(duì)呼吸系統(tǒng)、皮膚、眼部及黏膜具有刺激性，且具有潛在的基因毒性，按照基因毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則的要求[6]，必須在生產(chǎn)過程中進(jìn)行控制。目前，羥胺的檢測(cè)方法主要有分光光度法[7-10]、氣相色譜法[11]和離子色譜法[12-14]，但分光光度法的靈敏度較低，氣相色譜法測(cè)定時(shí)需進(jìn)行衍生，樣品處理方法較為復(fù)雜，且可能會(huì)對(duì)儀器產(chǎn)生一定的污染。離子色譜在檢測(cè)陰陽離子時(shí)具有靈敏度高、重復(fù)性好、方便快捷等優(yōu)勢(shì)，已在藥物領(lǐng)域內(nèi)廣泛應(yīng)用[15-19]。本文基于離子色譜-電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)和羥胺的還原性質(zhì)，建立了坎地沙坦酯藥物中羥胺殘留的測(cè)定方法，并采用固相萃取技術(shù)配制供試品溶液。該方法簡(jiǎn)單、快速，回收率好、靈敏度高，能夠?qū)Φ蜐舛鹊牧u胺殘留進(jìn)行定性與定量分析，利于對(duì)坎地沙坦酯合成反應(yīng)過程中羥胺的殘留進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ICS-5000離子色譜儀(美國ThermoFisher公司)：配有電化學(xué)檢測(cè)器；BT25S精密分析天平(精度：十萬分之一，德國賽多利斯公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；OnGuard Ⅱ RP柱(2.5 mL,美國ThermoFisher公司)。

鹽酸羥胺(純度100%，中國食品藥品檢定研究院)；銨離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 g/L，國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)；甲磺酸(純度99.5%，阿拉丁)；50%氫氧化鈉溶液(美國ThermoFisher公司)；甲醇、乙腈(色譜級(jí)，德國Merck公司)；二氯甲烷(色譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)；坎地沙坦酯藥品(自制)。

1.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液：精密稱取鹽酸羥胺適量于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，混勻后配制成含羥胺0.5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃密封保存。取羥胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用30 mmol/L甲磺酸溶液配制成含羥胺0.15 mg/L的溶液，此溶液作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液：準(zhǔn)確稱取坎地沙坦酯藥品100 mg于20 mL具塞玻璃管中，加8 mL二氯甲烷溶解后再精密加入10 mL 30 mmol/L甲磺酸溶液，振蕩30 s后靜置分層，取上清液過OnGuard Ⅱ RP柱(先加10 mL甲醇活化，再加10 mL 30 mmol/L甲磺酸溶液活化)后再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，即得。

系統(tǒng)適用性溶液：取羥胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、銨離子標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用30 mmol/L甲磺酸溶液配制成分別含羥胺0.25 mg/L、銨離子1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，此溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Ionpac CS16(250 mm×5 mm)陽離子交換色譜柱；流動(dòng)相：30 mmol/L甲磺酸溶液，等度洗脫，流速：1.0 mL/min；檢測(cè)器：電化學(xué)檢測(cè)器，電極材料為金電極，參比電極為pH-Ag/AgCl復(fù)合電極，電極模式為pH，電位波形為氨基酸六電位；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積25 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 供試品溶液的配制

坎地沙坦酯易溶于二氯甲烷、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，幾乎不溶于水，可采用甲醇溶解樣品后再加水定容，但坎地沙坦酯溶液會(huì)對(duì)色譜柱有一定的損傷。文獻(xiàn)[14]將甲磺酸雷沙吉蘭藥物以甲磺酸溶液溶解后采用在線固相萃取/離子色譜技術(shù)直接檢測(cè)，操作步驟較為簡(jiǎn)便，但對(duì)儀器配置的要求較高，且對(duì)于非水溶性藥品的應(yīng)用較為局限。OnGuard Ⅱ RP柱的主要功能團(tuán)為二乙烯基苯，對(duì)疏水性有機(jī)化合物有非常好的吸附效果，因此本文借鑒食品中藥物殘留檢測(cè)的液液萃取方法[20]，將坎地沙坦酯藥物溶于二氯甲烷后再用水萃取羥胺，水相過OnGuard Ⅱ RP柱后注入色譜儀，可確保去除全部有機(jī)物。該條件下，樣品的色譜圖背景較為干凈，無任何有機(jī)物峰干擾，但回收率僅為70%左右，分析原因可能是RP柱中含部分氨基化合物，羥胺在堿性環(huán)境下可與其他物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致過柱時(shí)損失。嘗試采用30 mmol/L甲磺酸溶液萃取羥胺和活化RP柱，回收率顯著提高(均在90%左右)，且樣品色譜圖背景較為干凈，分析原因是甲磺酸溶液可為羥胺提供一定的酸性環(huán)境，使得羥胺較為穩(wěn)定，過柱時(shí)基本不會(huì)損失，回收率明顯提高。

2.2 檢測(cè)方式的選擇

離子色譜常用的檢測(cè)器主要有電導(dǎo)檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器兩種，其中電導(dǎo)檢測(cè)器主要針對(duì)離子型化合物，其原理是測(cè)定溶液過電導(dǎo)池時(shí)的電導(dǎo)率。羥胺在水中可以進(jìn)行弱電離，其水溶液呈弱堿性，但使用電導(dǎo)檢測(cè)器測(cè)定時(shí)其響應(yīng)值非常弱，完全達(dá)不到檢測(cè)要求。電化學(xué)檢測(cè)器主要測(cè)量物質(zhì)的電信號(hào)變化，可檢測(cè)具有氧化還原性質(zhì)的化合物，如含硝基、氨基等的有機(jī)化合物及無機(jī)陰、陽離子等；而羥胺是一種還原劑，可在堿性環(huán)境下于電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而產(chǎn)生信號(hào)。因此，本研究采用電化學(xué)檢測(cè)器測(cè)定羥胺，樣品經(jīng)色譜柱分離后加氫氧化鈉溶液進(jìn)行柱后衍生，一方面可將鹽酸羥胺等全部轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)還原性的羥胺，參與氧化還原反應(yīng)；另一方面還可以為羥胺的氧化還原反應(yīng)提供足夠的堿性環(huán)境。該條件下的檢測(cè)信號(hào)較高，可滿足限度的相應(yīng)要求[6]。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取系統(tǒng)適用性溶液25 μL注入離子色譜儀，記錄色譜圖。羥胺、銨離子依次出峰，兩者的分離度為6.56。以30 mmol/L甲磺酸溶液為空白，注入離子色譜儀，記錄色譜圖，在羥胺出峰處無雜峰干擾，空白及系統(tǒng)適用性溶液的色譜圖見圖1。

2.4 耐用性

取系統(tǒng)適用性溶液25 μL注入離子色譜儀，記錄色譜圖，同時(shí)分別改變淋洗液濃度(27、33 mmol/L)、柱溫(35、45 ℃)和流速(0.9、1.1 mL/min)進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，觀察系統(tǒng)適用性的改變情況。結(jié)果表明，當(dāng)色譜條件參數(shù)有微小變化時(shí)，羥胺與銨離子的分離度為6.39～6.89(均大于1.5)，證明方法耐用性良好。

2.5 檢出限、定量下限與精密度

取對(duì)照品溶液適量，加30 mmol/L甲磺酸溶液逐級(jí)稀釋后注入離子色譜儀，記錄色譜圖，按信噪比S/N=3和S/N=10分別計(jì)算得羥胺的檢出限和定量下限為0.007 24 mg/L和0.014 47 mg/L。取對(duì)照品溶液25 μL注入離子色譜儀，記錄色譜圖，重復(fù)進(jìn)樣6次，得到羥胺保留時(shí)間及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.11%和1.6%。

2.6 線性關(guān)系

在雜質(zhì)限度200%范圍內(nèi)，分別配制定量下限(0.014 47 mg/L)、50%限度(0.072 36 mg/L)、100%限度(0.144 7 mg/L)、150%限度(0.217 1 mg/L)、200%限度(0.289 4 mg/L)5個(gè)質(zhì)量濃度的羥胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別注入離子色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X，mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，羥胺在0.014 47～0.289 4 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=24.481X+0.007 9，相關(guān)系數(shù)r=0.999。

2.7 準(zhǔn)確度與重復(fù)性

采用不含羥胺的坎地沙坦酯藥品為空白基質(zhì)，分別添加80%限度、100%限度、120%限度濃度的羥胺對(duì)照品做回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)濃度做3個(gè)樣品。結(jié)果表明，羥胺的回收率為98.1%～103.1%，準(zhǔn)確度良好，具體結(jié)果見表1?？驳厣程辊タ瞻兹芤杭疤砑恿u胺的色譜圖見圖2。

表1 坎地沙坦酯中羥胺的加標(biāo)回收率Table 1 Recoveries of hydroxylamine in candesartan cilexetil

圖2 坎地沙坦酯空白溶液及添加羥胺的色譜圖Fig.2 Chromatograms of candesartan cilexetil blank and candesartan cilexetil blank spiked with hydroxylamine

采用不含羥胺的坎地沙坦酯藥品為空白基質(zhì)，添加100%限度濃度的羥胺對(duì)照品做重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定6個(gè)樣品。結(jié)果表明，6個(gè)平行測(cè)定結(jié)果的RSD為1.9%，方法的重復(fù)性良好。

2.8 應(yīng) 用

將所建方法應(yīng)用于檢測(cè)合成的坎地沙坦酯藥物小試3批、中試3批及工藝驗(yàn)證3批共9份樣品，所有樣品均未檢出羥胺殘留。

3 結(jié) 論

本文首次建立了離子色譜-電化學(xué)法測(cè)定坎地沙坦酯藥物中羥胺殘留的方法，采用固相萃取技術(shù)配制供試品溶液，陽離子交換色譜柱分離后加氫氧化鈉溶液進(jìn)行柱后衍生，利用電化學(xué)檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)羥胺的檢測(cè)。方法的靈敏度高，分離度好，回收率、精密度及定量下限均能滿足檢測(cè)要求，是檢測(cè)坎地沙坦酯藥物中羥胺殘留的有效方法。將本方法應(yīng)用于坎地沙坦酯小試3批、中試3批及工藝驗(yàn)證3批共9份樣品，所有樣品均未檢出羥胺殘留，有效地指導(dǎo)了坎地沙坦酯合成反應(yīng)進(jìn)程，在坎地沙坦酯藥物研發(fā)過程起到了良好的監(jiān)督作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] Tang X J，Chen M.AvancesinCardiovascularDiseases(唐顯軍，陳明.心血管病學(xué)進(jìn)展)，2004,25(3)：172-175.

[2] Wu K W，Wu C J，Sun T M.CentralSouthPharmacy(吳奎偉，吳成軍，孫鐵民.中南藥學(xué))，2014,12(8)：785-787.

[3] Xie X Y，Li Y，Lin W，Chen C，Liao X R，Chen Y.Chin.J.Pharmacist.(謝向陽，李旸，林雯，陳晨,廖祥茹，陳鷹.中國藥師)，2015,18(4)：664-668.

[4] Sun Z M.Chin.Pharm.(孫在茂.中國藥房)，2015,26(21)：2922-2924.

[5] Lu F Y.J.DrugsClin.(魯風(fēng)云.現(xiàn)代藥物與臨床)，2013,5(9)：958-961.

[6] European Medicines Agency．Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities.http://www.ema.eu-ropa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500002903.pdf,2006-06-28/2013-12-13.

[7] Yang M.Chem.Ind.Eng.(楊明.化學(xué)工業(yè)與工程)，1999,16(4)：233-235.

[8] Li J X，Wen X R，Wu X P.Chin.J.Anal.Lab.(李京雄,溫欣榮，吳秀萍.分析試驗(yàn)室)，2013,32(3):86-88.

[9] Zhan G Q，Luo D B，Zhang Y B.J.Instrum.Anal.(詹國慶，羅登柏，張永波.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2004,23(5)：128-129.

[10] Ma W X，Liu W M.Chin.J.Pharm.(馬衛(wèi)興，劉文明.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志)，1993,24(7)：315-316.

[11] Ding H W，Chen G G，Ren L L，Gao P.Chin.J.Pharm.(丁宏偉，陳國廣，任麗莉，高盼.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志)，2016,47(4)：454-456.

[12] Xu C.Mod.Agrochem.(徐晨.現(xiàn)代農(nóng)藥)，2017,16(1)：36-40.

[13] Jiang T，Li X B，Zhao H X，Liu J，Du Y G.Chin.J.Med.Pharm.(姜濤，李孝壁，趙海霞，劉建，杜永剛.醫(yī)藥),2016,5(12):168-169.

[14] Zhang X W，Zheng H G，Chen L L.Chin.Pharm.J.(張曉偉，鄭洪國，陳禮莉.中國藥學(xué)雜志 )，2017,52(20)：1801-1804.

[15] Yang L，Hou Y，Wang B X，Yang S H，Zou Y，Yang Y，Yang Y，Liu J.J.Instrum.Anal.(楊蕾，侯英，王保興，楊式華，鄒悅，楊燕，楊勇，劉靜.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2010,29(2)：164-170.

[16] Zhang S F，Lin Z Z，Chen X Z，Zhang D L，Wang L S.J.Instrum.Anal.(張水鋒，林珍珍，陳小珍，張東雷，王立世.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2012,31(1)：85-89.

[17] Zeng X L，Ye M L，Chen Y X，Zhu Y.J.Instrum.Anal.(曾雪靈，葉明立，陳永欣，朱巖.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2006,25(3)：92-94.

[18] Li J，Li X，Luo J，Xu C G，Liu H J.Chin.J.Pharm.(李繼，李霞，羅晶，徐長根，劉海靜.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志)，2015,46(2)：197-199.

[19] Huang Q Q，Zhong N F，Hong G Y.Chin.J.HealthLab.Technol.(黃巧巧，鐘乃飛，洪高云.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志)，2014,24(4)：505-507.

[20] GB/T 21311-2007.Determination of Residues of Nitrofuran Metabolites in Foodstuffs of Animal Origin-HPLC-MS/MS.National Standards of the People’s Republic of China(動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)).