劉 媛，王 邃

(寧波大學(xué) 材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，寧波市新型功能材料及其制備科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 寧波 315211)

圖1 河豚毒素的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of tetrodotoxin

河豚毒素(TTX)是一種毒性很強(qiáng)的小分子海洋神經(jīng)毒素(結(jié)構(gòu)如圖1)，其分子量為319 Da，廣泛分布于各種海洋生物體內(nèi)[1-3]。河豚魚組織中的河豚毒素含量高于1 000 MU·g-1時(shí)，可通過食物鏈在人體內(nèi)積累，有效阻斷神經(jīng)興奮性膜鈉通道并阻礙神經(jīng)傳導(dǎo)，可導(dǎo)致人神經(jīng)麻痹和死亡[4]。目前，河豚毒素的檢測(cè)已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，但生物法測(cè)定比較耗時(shí)且昂貴；色譜和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法雖是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，但對(duì)儀器和實(shí)驗(yàn)室的要求較高[5-6]；表面等離子體共振(SPR)技術(shù)目前尚處于研究的初期階段，由于技術(shù)成熟度和儀器普及度等因素還難以實(shí)用化[7]；ELISA 的復(fù)雜操作和高成本也使之應(yīng)用受限[8]。因此，有必要建立一種簡(jiǎn)單有效的方法檢測(cè)TTX。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)室自組裝ECL檢測(cè)系統(tǒng)由BPCL超微弱發(fā)光分析儀(中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所)和CHI1110B電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器有限公司)構(gòu)成。三電極體系：裸電極或修飾的玻碳電極(GCE，Φ=3 mm)作為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極,Ag/AgCl(3 mol·L-1KCl)電極作為參比電極。使用CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜(EIS)分析。使用Hitachi SU-70掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi，Tokyo，Japan)對(duì)納米材料的形貌進(jìn)行表征。

1.2 AuNPs的制備

參照文獻(xiàn)[18-19]，將50 mL 0.01% 的HAuCl4溶液攪拌加熱至沸騰后迅速加入2 mL 1%檸檬酸鈉，溶液煮沸約10 min，當(dāng)顏色由黃色變成黑色再變成酒紅色即得到AuNPs溶膠，冷卻至室溫并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備

玻碳電極預(yù)處理：依次用1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3粉末將電極拋光至鏡面，分別置于水、乙醇、水中超聲各1 min，用氮?dú)鈱㈦姌O表面吹干備用。

圖2 電化學(xué)免疫傳感器的制備流程和檢測(cè)機(jī)制Fig.2 Fabrication process and detection mechanism of the ECL immunosensor

1.5 TTX的測(cè)定

TTX標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的配制：稱取5 mg 的TTX樣品，溶于10 mL 醋酸(5%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)),得到質(zhì)量濃度為500 mg·L-1的TTX 儲(chǔ)備液,用水稀釋得到其他質(zhì)量濃度的TTX標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。

將制得的ECL免疫傳感器置于100 μL 不同質(zhì)量濃度的TTX 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液中，37 ℃下孵育1 h后，用水沖洗，置于0.1 mol·L-1的PBS(pH 7.4)測(cè)試液中進(jìn)行ECL測(cè)定，并記錄數(shù)據(jù)。掃描電壓范圍為0～1.2 V，掃速為100 mV·s-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

2.2 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的電化學(xué)行為

2.2.2電化學(xué)阻抗譜電化學(xué)阻抗也可以有效表征傳感器表面的電子傳遞速率變化。在含有5.0 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-和 0.1 mol·L-1KCl 的PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.4)溶液中對(duì)不同修飾電極的阻抗值進(jìn)行測(cè)定。阻抗圖中曲線的半圓直徑越大，表明電極表面阻礙[Fe(CN)6]3-/4-電子傳遞的能力越大。如圖4B所示,隨著材料的逐級(jí)修飾，不同修飾電極(曲線a～e)的阻抗值逐漸變大，這與循環(huán)伏安的測(cè)定結(jié)果相一致，表明該生物傳感器構(gòu)建成功。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為獲得最佳的測(cè)試條件，提高TTX的檢測(cè)靈敏度，分別對(duì)緩沖溶液的pH值和目標(biāo)物的孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化?？疾炝司彌_溶液pH值在6.0～8.5范圍內(nèi)對(duì)ECL強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，pH值在6.0～7.5范圍內(nèi)，ECL強(qiáng)度隨著pH值的增加而增加，而在pH 7.5～8.5范圍內(nèi)，ECL強(qiáng)度隨著pH值的增加而減小，在pH 7.5時(shí)，ECL強(qiáng)度達(dá)到最大。這可能是由于測(cè)試液的pH值影響蛋白質(zhì)分子的活性，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子失活。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇PBS的最佳pH值為7.5。

電化學(xué)免疫傳感器對(duì)抗原的孵育時(shí)間也是影響ECL強(qiáng)度的重要因素。本實(shí)驗(yàn)考察了孵育時(shí)間(15～90 min)對(duì)ECL強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，孵育時(shí)間在15～60 min范圍內(nèi)，ECL強(qiáng)度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在60～90 min范圍內(nèi)，ECL強(qiáng)度無(wú)明顯變化。這可能是由于電極表面抗體的數(shù)量有限，孵育60 min時(shí)目標(biāo)物結(jié)合已達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，選擇最佳孵育時(shí)間為60 min。

圖5 ECL信號(hào)隨TTX濃度變化的響應(yīng)圖Fig.5 ECL intensities of the immunosensor after fabricating with different concentrations of TTX in 0.1 mol·L-1 PBS(pH 7.4)insert:calibration curves for TTX determination;concentration of TTX(a-h):0.01,0.1,1,5,10,50,100,1 000 μg· L-1

2.4 TTX的檢測(cè)

用0.1 mol·L-1pH 7.4的PBS 配制不同濃度的TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，孵育完成后，置于測(cè)試底液中，考察了ECL信號(hào)響應(yīng)隨濃度的變化情況。如圖5所示,在0.01～1 000 μg·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，ECL信號(hào)響應(yīng)值(y)隨TTX質(zhì)量濃度(C)的增加而增強(qiáng)，其線性回歸校準(zhǔn)曲線如圖5插圖所示，擬合方程為y=2 528.98+653.71 lgCTTX(μg·L-1)，相關(guān)系數(shù)為0.996。TTX的檢出限(S/N=3)為0.01 μg·L-1。與其他檢測(cè)TTX的方法相比(見表1)，該免疫傳感器具有線性范圍寬和檢出限低的優(yōu)點(diǎn)。

2.5 穩(wěn)定性

ECL信號(hào)的穩(wěn)定是傳感器用于檢測(cè)的基本條件。將修飾好的電極置于100 μL 1 000 μg·L-1TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育60 min后進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試，考察了電壓在0.2～1.2 V范圍內(nèi)連續(xù)循環(huán)掃描10圈的ECL信號(hào)變化情況。結(jié)果表明達(dá)到一定的掃描時(shí)間后，ECL信號(hào)趨于穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%，表明該免疫傳感器具有很好的穩(wěn)定性，適用于TTX的檢測(cè)。

表1 TTX檢測(cè)方法的比較Table 1 Comparison of the main methods reported for the determination of TTX

2.6 選擇性與重現(xiàn)性

為考察該免疫傳感器的選擇性，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，分別對(duì)100 μL濃度為10 mmol·L-1的NaCl、KCl、CaCl2、ZnCl2、葡萄糖、尿酸、抗壞血酸、膽紅素、溶菌酶溶液孵育過的傳感器的ECL信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其ECL信號(hào)強(qiáng)度與空白溶液孵育后的結(jié)果幾乎相同。用河豚毒素(1 mmol·L-1)孵育過的ECL信號(hào)值約為其5倍；用包含所有上述物質(zhì)的混合溶液(濃度與上述相同)進(jìn)行測(cè)試，其結(jié)果與河豚毒素(1 mmol·L-1)孵育后的ECL信號(hào)強(qiáng)度近乎相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該免疫傳感器對(duì)TTX具有良好的選擇性。

將制備好的ECL免疫傳感器置于4 ℃密閉保存，每2 d 于相同條件下進(jìn)行ECL測(cè)量，20 d后的ECL值為初始值的97.8%，說明該修飾電極可以保持抗體的活性和數(shù)量。另選取不同批次的修飾電極對(duì)10 μg·L-1TTX進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果的RSD為6.3%，表明該免疫傳感器具有很好的重現(xiàn)性。

2.7 樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定

實(shí)際樣品溶液根據(jù)文獻(xiàn)制得[13]。通過標(biāo)準(zhǔn)加入法，取50 μL未測(cè)得TTX的樣品溶液，向其中加入50 μL不同濃度的TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率測(cè)定。每份樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，其回收率為98.0%～104.0%，RSD為3.5%～8.2%，表明該免疫傳感器具有較好的實(shí)用價(jià)值。

表2 實(shí)際樣品中TTX的檢測(cè)結(jié)果(n=3)Table 2 Detection results of TTX in real samples(n=3)

3 結(jié) 論

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