劉 飛，任安書(shū)，葛 萍，丁年芳，娜仁·琪琪格

(南京華譜分析檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，江蘇 南京 210001)

圖1 4種黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of the four aflatoxins

黃曲霉毒素是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的二氫呋喃香豆素衍生物，為黃曲霉菌和寄生曲霉菌等真菌經(jīng)過(guò)聚酮途徑產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是一種天然存在的毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，并具有致突變、致畸形和致癌作用。1993年，黃曲霉毒素 B1就已被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為Ⅰ類致癌物[1-2]。研究表明:黃曲霉毒素B1的毒性為氰化鉀的10倍,砒霜的68倍[3]；且其致癌性是二甲基亞硝胺的70倍[4]。黃曲霉毒素是飼料中最常見(jiàn)的真菌毒素，因在自然條件下，玉米、花生、大米等糧食未能及時(shí)曬干或儲(chǔ)藏不當(dāng)受污染而產(chǎn)生。黃曲霉毒素嚴(yán)重威脅了飼料和食品的消費(fèi)安全。天然產(chǎn)生的黃曲霉毒素根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同主要包括黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2) 4種，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

飼料中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[5]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[6-8]、液相色譜法[9-10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]等。其中，薄層色譜法是測(cè)定飼料中黃曲霉毒素的傳統(tǒng)方法之一，該方法對(duì)檢測(cè)的規(guī)范和熟練程度要求較高，準(zhǔn)確度較低，重現(xiàn)性較差[14]；ELISA方法會(huì)對(duì)黃曲霉毒素及其類似物產(chǎn)生一定的交叉反應(yīng)，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性或者假陰性的結(jié)果；液相色譜法檢測(cè)黃曲霉毒素一般采用熒光檢測(cè)器柱后衍生法，但該方法的檢出限較高，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法比液相色譜法具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但可能存在基質(zhì)抑制效應(yīng)的影響。因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高的測(cè)定飼料中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法勢(shì)在必行。

樣品前處理是準(zhǔn)確、有效測(cè)定黃曲霉毒素的基礎(chǔ)，尤其是對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的飼料樣品，它甚至成為制約整個(gè)分析過(guò)程的決定性因素。本實(shí)驗(yàn)采用在線固相萃取富集技術(shù)，將飼料樣品直接進(jìn)樣，通過(guò)優(yōu)化在線富集條件和液相色譜-質(zhì)譜條件，采用高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法進(jìn)行分析，減少了人工操作的不確定因素，提高了方法的重現(xiàn)性，顯著縮短了飼料樣品的前處理時(shí)間。本方法具有前處理簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，可用于飼料樣品中黃曲霉毒素的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive(賽默飛世爾科技公司)，配HESI-Ⅱ源，Spark SymbiosisTM在線固相萃取-液相色譜系統(tǒng)( Spark Holland，荷蘭),包括系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)樣器模塊、二元高效液相色譜泵、SPE在線固相萃取儀(含溶劑混合高壓注射泵和小柱接夾組件)柱溫箱模塊；高純水發(fā)生器(英國(guó)ELGA公司)；XW-80A型渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；AFB1、AFB2、AFG1和AFG2(純度≥99%，Sigma公司)；乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；乙酸銨、甲酸(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取AFB1、AFB2、AFG1和AFG2標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封保存于4 ℃冰箱中。準(zhǔn)確吸取1 g/L的4種單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容得100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)需要，吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用初始流動(dòng)相將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入1 g NaCl和20 mL乙腈-水(80∶20，體積比)，溶解后，超聲提取20 min，于8 000 r/min離心5 min，吸取乙腈層，用20 mmol/L乙酸銨溶液(pH 6.80～7.05)稀釋10倍后進(jìn)樣；供高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀測(cè)定。

表1 固相萃取程序Table 1 Procedure of solid phase extraction

1.4 在線固相萃取條件

在線固相萃取柱為IMMUNOPREP?ONLINE AFLATOXIN(Part Code:P900)，上樣(活化)液：20 mmol/L乙酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH值至6.80～7.00；淋洗液：含6%甲醇的20 mmol/L乙酸銨溶液,調(diào)至pH 8.30～8.50；洗脫液：含50 mmol/L乙酸銨的75% 甲醇水溶液，調(diào)至pH(2.00±0.05)；稀釋液：20 mmol/L乙酸銨溶液，調(diào)至pH 6.80～7.05；在線固相萃取程序如表1所示。

1.5 液相色譜條件

色譜分析柱為Diamonsil Plus(150 mm ×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為20 mmol/L 乙酸銨水溶液(A)-甲醇(B);流速0.70 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；樣品室溫度25 ℃。色譜梯度洗脫程序?yàn)椋?～2.00 min，95%A；2.00～2.05 min，95%～75%A；2.05～6.00 min，75%～5%A；6.00～8.00 min，5%A;8.00～8.05 min，5%～95%A；8.05～10.00 min，95%A。

1.6 質(zhì)譜條件

可加熱的電噴霧離子源(HESI-Ⅱ)；毛細(xì)管溫度為350 ℃，鞘氣(N2)流速50 L/min，輔助氣(N2)流速6 L/min，吹掃氣(N2)流速3 L/min；噴霧電壓為3 kV，透鏡電壓為50 V；采用正離子掃描模式；全掃描的分辨率R=35 000，掃描范圍：100～500m/z。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱與分析柱的選擇

由于黃曲霉毒素在飼料中含量較低，直接進(jìn)樣分析需增大進(jìn)樣體積方能檢出，但可能會(huì)超出色譜柱的承受范圍，導(dǎo)致色譜柱壽命縮短，另一方面飼料中存在大量的礦物質(zhì)、淀粉、蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，國(guó)標(biāo)GB/T 30955-2014中對(duì)黃曲霉毒素的檢出限較高，必須進(jìn)行富集。在AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的分析前處理中，為提高目標(biāo)化合物的分析效果，多選用免疫親和柱作為分析小柱[15-17]，因此本實(shí)驗(yàn)選用拜發(fā)公司生產(chǎn)的免疫親和柱作為樣品前處理固相萃取小柱；黃曲霉毒素在反相液相色譜柱上保留能力較強(qiáng)，選用C18基質(zhì)的色譜柱作為分析柱，以乙酸銨水溶液和甲醇作為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫。固相萃取柱和分析柱具有一定的正交性，可降低分析柱分析結(jié)果的干擾[18]。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

本研究采用XLC分析模式，系統(tǒng)通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器采樣后，經(jīng)閥切換樣品上樣到活化的SPE小柱中，經(jīng)固相萃取淋洗后，通過(guò)閥切換全量在線洗脫到LC分析柱上，然后進(jìn)行液相分離-質(zhì)譜分析。

以AFB1為靶標(biāo)物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)比較了以下3種前處理方式對(duì)回收率的影響。

①稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水(1∶1，體積比)溶解，加入4 g無(wú)水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋后，于8 000 r/min離心5 min，吸取1 mL乙腈層，用20 mmol/L乙酸銨溶液(pH=6.80～7.05)定容至10 mL；

②稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水(80∶20，體積比)溶解，于8 000 r/min離心5 min，吸取1 mL乙腈層，用20 mmol/L乙酸銨溶液(pH=6.80～7.05)定容至10 mL；

③稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入1 g NaCl，經(jīng)20 mL乙腈-水(80∶20)溶解，超聲提取后，于8 000 r/min離心5 min，吸取1 mL乙腈層，用20 mmol/L乙酸銨溶液(pH=6.80～7.05)定容至10 mL。

表2 3種前處理方法對(duì)樣品加標(biāo)回收率的影響Table 2 Influences of three pretreatment methods on recoveries of the sample

圖2 50 μg/kg黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of 50 μg/kg standard solution

結(jié)果表明：方法①的基質(zhì)效應(yīng)偏高，方法②和方法③的回收率明顯優(yōu)于方法①(見(jiàn)表2)。但在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，方法②中有些樣品存在沉淀不徹底的現(xiàn)象，而方法③中NaCl的加入有助于雜質(zhì)沉淀，使樣品澄清，進(jìn)樣時(shí)不堵塞SPE柱，同時(shí)有利于延長(zhǎng)SPE柱的使用壽命，因此選用方法③作為樣品前處理方法。

2.3 在線固相萃取條件的優(yōu)化

考慮到4種黃曲霉毒素從固相萃取小柱上洗脫，若與分析柱的流動(dòng)相不一致，可能導(dǎo)致色譜峰拖尾。因此，確定分析柱的流動(dòng)相和固相萃取柱的洗脫流動(dòng)相均為乙酸銨和甲醇兩種溶劑。通過(guò)調(diào)節(jié)甲醇-乙酸銨溶液的梯度比例，可將靶標(biāo)物質(zhì)與雜質(zhì)分離。

在線固相萃取法處理樣品包括3 個(gè)步驟:①樣品組分由進(jìn)樣器與SPE 泵流動(dòng)相引入到SPE 柱進(jìn)行富集，干擾物(或基質(zhì))則從柱上流出并排至廢液收集器，同時(shí)分析物黃曲霉毒素保留在SPE 柱上，分析柱處于清洗與平衡的過(guò)程;②通過(guò)閥切換，將4種靶標(biāo)物質(zhì)由SPE 柱轉(zhuǎn)移至分析柱;③閥切換到初始位置，靶標(biāo)物質(zhì)在分析柱上保留洗脫，同時(shí)SPE 柱進(jìn)行離線清洗和平衡，為下一針進(jìn)樣準(zhǔn)備[19]。因此，閥切換時(shí)間和轉(zhuǎn)移過(guò)程是在線固相萃取的核心步驟，本實(shí)驗(yàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行優(yōu)化，以4種黃曲霉毒素均在質(zhì)譜上提取出完整譜峰為依據(jù)，確定閥切換時(shí)間為2.6 min；SPE柱選擇含50 mmol/L乙酸銨的75% 甲醇水溶液作為洗脫溶劑，將SPE柱吸附的4種靶標(biāo)物質(zhì)洗脫下來(lái)，同時(shí)將靶標(biāo)物質(zhì)保留在分析柱上，采用HPD共聚焦洗脫模式，確保所有靶標(biāo)物質(zhì)洗脫完全，提取質(zhì)量數(shù)范圍為10 ppm時(shí)4種黃曲霉毒素的提取離子流圖如圖2所示。

2.4 線性范圍與定量下限

在優(yōu)化條件下，對(duì)質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析。以黃曲霉毒素特征離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)、相應(yīng)含量為橫坐標(biāo)(x,μg/L)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。由表3可知，4種黃曲霉毒素的相關(guān)系數(shù)(r)大于0.99，在0.5～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為方法的檢出限和定量下限，結(jié)果如表3所示。由表3可知，本方法對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的檢出限為0.2 μg/kg，定量下限為0.5 μg/kg。

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

分別在濃縮飼料和發(fā)酵豆粕中添加0.5、1.0、5.0 μg/kg 3個(gè)水平的4種黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平平行測(cè)定5次，考察方法的回收率與精密度(見(jiàn)表4)。結(jié)果表明，4種目標(biāo)化合物在飼料中的回收率為94.6%～114.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于8.3%。本方法的準(zhǔn)確性較好，可用于實(shí)際飼料樣品中4種黃曲霉毒素的檢測(cè)。

表3 4種黃曲霉毒素的精確質(zhì)量數(shù)、線性方程、相關(guān)系數(shù)、保留時(shí)間、檢出限及定量下限Table 3 Accurate masses,regression equations,correlation coefficients(r),retention times,limits of detection(LOD,n=7) and limits of quantitation(LOQ,n=7) of AFB1,AFB2,AFG1 and AFG2

表4 飼料中4種黃曲霉毒素的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 4 Recoveries and RSDs of AFB1，AFB2，AFG1 and AFG2 spiked in feeds(n=5)

圖3 空白樣品中加入黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 μg/kg)的提取離子流色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms from blank sample spiked standard solution(0.5 μg/kg)

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

運(yùn)用本研究建立的方法，在上述測(cè)定條件下對(duì)30個(gè)進(jìn)口飼料樣品(包括寵物飼料、豆粕、濃縮飼料、配合飼料、發(fā)酵豆粕等)中4種黃曲霉毒素進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果顯示，30個(gè)樣品均未檢出AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。其中，空白飼料中加入黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流圖如圖3所示，可以看出，基質(zhì)對(duì)4種化合物的分離分析無(wú)影響，本方法對(duì)飼料的測(cè)定準(zhǔn)確、可靠。

2.7 與離線固相萃取/液相色譜-質(zhì)譜方法的比較

與離線固相萃取/液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定飼料中的4種黃曲霉毒素進(jìn)行比較[20]，本研究采用的自動(dòng)化控制在線固相萃取方法，具有操作簡(jiǎn)單、整體分析時(shí)間短、全自動(dòng)分析的特點(diǎn)。本方法的SPE柱理論上可進(jìn)行100次飼料樣品的分析，大大節(jié)約了檢測(cè)成本。而且本方法通過(guò)閥切換技術(shù)和HPD共聚焦洗脫模式，使得樣品中的大部分雜質(zhì)可以直接流入廢液中，僅靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)入分析柱，從而延長(zhǎng)了分析柱的使用壽命。此外，在線SPE方法的精密度更高，減少了人工操作的不確定性。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)閥切換技術(shù)將固相萃取與高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜相結(jié)合，建立了在線固相萃取直接測(cè)定飼料中黃曲霉毒素的方法。樣品經(jīng)溶解、超聲提取、稀釋后直接進(jìn)樣測(cè)定，自動(dòng)實(shí)現(xiàn)了靶標(biāo)物質(zhì)的在線富集和干擾雜質(zhì)的在線去除。應(yīng)用本方法可在13 min內(nèi)完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，大大提高了檢測(cè)效率。且該方法操作簡(jiǎn)單，能夠滿足飼料中4種黃曲霉毒素的分析要求。

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