黃金鳳，尋知慶，汪晨霞，郭新東*，冼燕萍，盧宇靖，吳玉鑾

(1.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東 廣州 511447；2.廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

圖1 4種化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of four compounds

嬰幼兒配方乳粉因與母乳成分較接近而被用作母乳的替代品，膽堿、左旋肉堿、?；撬岷图〈紴閶胗變号浞绞称房蛇x擇添加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1-2](結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)。其中，膽堿是強(qiáng)堿性有機(jī)物，為卵磷脂組成成分，在生物體內(nèi)常以游離態(tài)或與卵磷脂、鞘磷脂等結(jié)合態(tài)形式存在，當(dāng)體內(nèi)膽堿不足時(shí)會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻、營(yíng)養(yǎng)不良、繁殖力差等；左旋肉堿結(jié)構(gòu)與膽堿類(lèi)似，其可促使長(zhǎng)鏈脂肪轉(zhuǎn)化為能量，缺乏時(shí)會(huì)造成細(xì)胞能量代謝的紊亂，導(dǎo)致肌肉無(wú)力、脂肪堆積等；?；撬嵊址Q(chēng)α-氨基乙磺酸，能促進(jìn)機(jī)體的激素分泌，增強(qiáng)和改善機(jī)體的免疫力，?；撬釘z入不足會(huì)影響嬰幼兒的智力或引起腦的疾??；肌醇是一種水溶性維生素，易溶于水，廣泛存在于各種天然動(dòng)物、植物及微生物組織中，能降低膽固醇、促進(jìn)脂肪代謝等，并對(duì)脂肪肝、肝硬化、肥胖等疾病有治療和預(yù)防作用。成人所需膽堿、左旋肉堿、?；撬岷图〈疾糠挚捎勺陨砗铣桑部赏ㄟ^(guò)食物補(bǔ)充，而嬰幼兒的各種器官未發(fā)育健全，自身合成量非常有限，絕大部分需通過(guò)食品補(bǔ)充。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[1-2]規(guī)定了嬰幼兒配方食品中膽堿、左旋肉堿、?；撬岷图〈嫉奶砑恿?，膽堿添加量為1.7～12.0 mg/100kJ，左旋肉堿添加量不低于0.3 mg/100kJ，?；撬崽砑恿繛?～3.0 mg/100kJ，肌醇添加量為1.0～9.5 mg/100kJ。因此，建立嬰幼兒配方食品中膽堿、左旋肉堿、?；撬岷图〈嫉臋z測(cè)方法十分必要。

現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.20-2013[3]以比色法或分光光度法測(cè)定嬰幼兒食品或乳品中的膽堿；GB 29989-2013[4]使用分光光度法測(cè)定嬰幼兒食品或乳品中左旋肉堿。兩種方法均需酸或堿水解，將結(jié)合態(tài)或其它形式的膽堿、左旋肉堿均轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，然后進(jìn)行測(cè)定。GB 5009.169-2016[5]中使用鄰苯二甲醛(OPA)柱后衍生或丹磺酰氯柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定牛磺酸，GB 5009.270-2016[6]規(guī)定了肌醇的微生物檢測(cè)或硅烷化衍生、氣相色譜檢測(cè)方法，但微生物法耗時(shí)長(zhǎng)，衍生化法操作復(fù)雜，且高濃度的衍生劑較易殘留從而污染儀器。其它相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[7-11]、氣相色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-16]、離子色譜法[17-18]、電化學(xué)發(fā)光法[19]、氨基酸自動(dòng)分析儀法[20]等，上述方法均僅涉及1～2種分析物，每種營(yíng)養(yǎng)素建立一套獨(dú)立的檢測(cè)方法，耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，檢測(cè)工作量大大增加。因此，本研究以嬰幼兒配方乳粉為研究對(duì)象，采用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白后直接用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀檢測(cè)。方法前處理簡(jiǎn)單快捷，其線(xiàn)性范圍、檢出限、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性均可滿(mǎn)足嬰幼兒配方乳粉中膽堿、左旋肉堿、肌醇和?；撬岬姆治鲆蟆?/p>

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DIONEX Ultimate 3000 高效液相色譜儀-Thermal TSQ Endura三重四極桿質(zhì)譜儀 (HPLC-MS/MS，熱電公司)，MS3 basic旋渦混合器(德國(guó)IKA公司)，KQ-250DV型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司)，高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：氯化膽堿(純度為98.0%，CNW公司)、d9-氯化膽堿-三甲基(TRC)、左旋肉堿(純度≥98.0%，Dr.Ehrenstorfer公司)、d3-左旋肉堿鹽酸鹽(純度為98%，Cambridge Isotop公司)、肌醇(純度≥98.0%，CNW公司)、?；撬?純度≥98.0%，CNW公司)均購(gòu)于上海安譜有限公司；甲醇、乙醇、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；乙酸銨、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；實(shí)驗(yàn)用超純水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)10.0 mg(精確至0.1 mg )，置于100 mL 棕色容量瓶中，以水溶解并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為100 mg/L 的單標(biāo)儲(chǔ)備液。分別吸取適量的單標(biāo)儲(chǔ)備液配制4種分析物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中膽堿和左旋肉堿的質(zhì)量濃度為1.0 mg/L，?；撬岷图〈嫉馁|(zhì)量濃度為10.0 mg/L。臨用時(shí)，以水逐級(jí)稀釋成所需濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液于4 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取乳粉樣品0.20 g(精確至0.001 g)于100 mL比色管中，加入d9-氯化膽堿-三甲基和d3-左旋肉堿鹽酸鹽內(nèi)標(biāo)溶液(均為100 mg/L)各100 μL，加40 mL 40 ℃水溶解，渦旋1 min，超聲提取10 min，加入1 mL 15%亞鐵氰化鉀溶液，渦旋混合均勻后，再加入1 mL 30%乙酸鋅溶液，渦旋混合均勻，用水定容至100 mL，室溫靜置10 min后，取上清液于4 000 r/min離心3 min，經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾后待檢測(cè)。當(dāng)測(cè)試溶液濃度超出線(xiàn)性范圍時(shí)，可用水進(jìn)一步稀釋后再測(cè)定。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)(除不加樣品外，其它步驟相同)。

1.4 儀器條件

高效液相色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：A為5 mmol/L 乙酸銨，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～3.0 min，15%B；3.0～5.0 min，15%～70%B；5.0～6.0 min，70%～15%B；后運(yùn)行時(shí)間：2 min；流速：0.20 mL/min；進(jìn)樣體積：5.0 μL；柱溫：30 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源，正負(fù)模式切換(ESI+和ESI-)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；干燥氣：氮?dú)?，溫?00 ℃；傳輸毛細(xì)管溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：3 500 V(正模式)和2 500 V(負(fù)模式)；相應(yīng)的電離模式、監(jiān)測(cè)離子對(duì)(m/z)、碰撞電壓和RF棱鏡參數(shù)見(jiàn)表 1。

表1 化合物的MRM參數(shù)Table 1 The multiple reaction monitoring conditions of the analytes

*quantitative ion

1.5 樣品分析物的含量計(jì)算

樣品中分析物含量計(jì)算如下：Xi=(Csi-C0)V/m。式中：Xi為試樣中待測(cè)目標(biāo)化合物的含量(mg/kg)；Csi為待測(cè)試樣溶液中目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度(mg/L)；C0為空白試驗(yàn)中目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度(mg/L)；V為濃縮至干后試樣的定容體積(mL)；m為試樣質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1提取溶劑的選擇膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇水溶性好，可用水直接提取，但由于嬰幼兒配方乳粉中含有許多水溶性蛋白質(zhì)和脂溶性營(yíng)養(yǎng)成分，基質(zhì)復(fù)雜，需凈化后檢測(cè)。脂溶性成分不溶于水，用水提取時(shí)只需將水溶性蛋白沉淀。實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、乙醇、乙酸、三氯乙酸、亞鐵氰化鉀/乙酸鋅等沉淀劑對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈和乙醇沉淀蛋白質(zhì)緩慢，沉降不完全，樣品高速離心后也不澄清；乙酸和三氯乙酸對(duì)大多數(shù)乳粉樣品的蛋白質(zhì)沉降效果較好，但部分乳粉樣品沉淀不完全；而亞鐵氰化鉀/乙酸鋅沉淀劑對(duì)所有樣品的沉淀效果好，低速離心后即可澄清。因此實(shí)驗(yàn)采用亞鐵氰化鉀/乙酸鋅為沉淀劑。

2.2.2提取條件的選擇比較了振蕩提取和超聲提取兩種提取方法。結(jié)果表明，超聲提取操作簡(jiǎn)便，提取效率較高。研究了超聲時(shí)間分別為5、10、15、20 min時(shí)的提取率，發(fā)現(xiàn)超聲10 min時(shí)，提取率基本達(dá)最大值，超聲時(shí)間超過(guò)10 min后對(duì)提取率無(wú)顯著影響。因此，確定超聲時(shí)間為10 min。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

膽堿和左旋肉堿均含有季銨鹽結(jié)構(gòu)，分子帶正電荷；?；撬岷邪被?，在酸性條件下易加氫形成正電荷化合物[M+H]+；肌醇含有6個(gè)羥基，易形成[M-H]-母離子，因此實(shí)驗(yàn)選擇ESI正負(fù)切換電離模式，膽堿、左旋肉堿和?；撬崾褂肊SI+模式，肌醇使用ESI-模式。實(shí)驗(yàn)中以1.0 mg/L單標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注入三重四極桿質(zhì)譜儀，通過(guò)質(zhì)譜自動(dòng)優(yōu)化MS/MS采集參數(shù)和特征碎片離子。表1列出了各化合物的母離子、子離子、RF棱鏡參數(shù)以及碰撞能量。在優(yōu)化的碰撞能下，選擇每個(gè)母離子所對(duì)應(yīng)豐度最大的子離子進(jìn)行定量分析。

2.3 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

ESI正負(fù)切換模式下檢測(cè)時(shí)，流動(dòng)相多使用甲醇、乙腈和水。實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水和乙腈-水流動(dòng)相體系的分離效果，發(fā)現(xiàn)兩種流動(dòng)相下分析物的響應(yīng)強(qiáng)度差別不大，但采用甲醇-水體系的峰形明顯優(yōu)于乙腈-水體系。此外，牛磺酸在兩種流動(dòng)相體系下響應(yīng)均不高，而在流動(dòng)相中加入乙酸銨可明顯提高?；撬犴憫?yīng)，且肌醇響應(yīng)未見(jiàn)明顯降低；綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-乙酸銨體系為流動(dòng)相。考察了乙酸銨溶液濃度(3、4、5、6 mmol/L)對(duì)各組分分離度、響應(yīng)值和峰形的影響。結(jié)果表明，乙酸銨溶液的濃度對(duì)4種組分的分離度、響應(yīng)值無(wú)顯著影響。由于5 mmol/L乙酸銨溶液作為水相時(shí)的峰形最好，故選擇5 mmol/L乙酸銨溶液作為水相。

2.4 色譜柱的選擇

膽堿、左旋肉堿、?；撬岷图〈季鶎俅髽O性親水化合物，在常規(guī)C18色譜柱上很難實(shí)現(xiàn)保留，因此需選用親水性色譜柱進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)比較了ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和BEH HILIC(2.1 mm ×150 mm，1.7 μm)的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然兩種色譜柱對(duì)4種化合物的保留效果均不強(qiáng)，但ACQUITY UPLC HSS T3保留時(shí)間的穩(wěn)定性更優(yōu)；由于4種化合物的提取離子色譜圖之間互不干擾，可通過(guò)提取離子對(duì)各化合物進(jìn)行定量，因此選擇ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱。在優(yōu)化的HPLC-MS/MS條件下，化合物的提取離子色譜圖如圖2所示。

2.5 線(xiàn)性方程及檢出限

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，取質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L的膽堿、左旋肉堿、?；撬岷图〈蓟旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè)，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液中均含100 μg/L的同位素內(nèi)標(biāo)溶液。膽堿和左旋肉堿采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算，以目標(biāo)物定量離子峰面積(A)和內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積(Ai)的比值(y)對(duì)相應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度(x，mg/L)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析；?；撬岷图〈疾捎猛鈽?biāo)法計(jì)算，以目標(biāo)物定量離子峰面積(y)對(duì)相應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度(x，mg/L)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，膽堿和左旋肉堿在0.01～2.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2>0.999；?；撬岷图〈荚?.1～2.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，r2>0.997。以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限(LOD)，得膽堿和左旋肉堿的LOD為1.5 mg/kg，?；撬岷图〈嫉腖OD為15 mg/kg；以10倍信噪比計(jì)算方法定量下限(LOQ)，得膽堿和左旋肉堿的LOQ為4.5 mg/kg，?；撬岷图〈嫉腖OQ為45 mg/kg。本方法靈敏度高，適用于嬰幼兒配方乳粉中膽堿、左旋肉堿、?；撬岷图〈嫉亩ㄐ院投糠治?。

表2 4種分析物的線(xiàn)性方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Standard curves,linear ranges,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of 4 analytes

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由樣品中復(fù)雜的干擾物抑制或增強(qiáng)分析物的響應(yīng)導(dǎo)致，可用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率與標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率的比值進(jìn)行評(píng)估[21-22]。由于左旋肉堿和膽堿使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，內(nèi)標(biāo)校正了基質(zhì)效應(yīng)的影響，因此僅對(duì)牛磺酸和肌醇進(jìn)行了基質(zhì)效應(yīng)研究。其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如表2所示，基質(zhì)校準(zhǔn)曲線(xiàn)可以通過(guò)使用樣品提取液作為溶劑獲得。結(jié)果表明，肌醇和?；撬岬幕|(zhì)效應(yīng)比值分別為0.91和0.87，表明兩者的響應(yīng)可能被乳粉樣品中的干擾物質(zhì)輕微抑制?？紤]到嬰幼兒配方乳粉的復(fù)雜性，實(shí)驗(yàn)得到的基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)。

2.7 回收率與精密度

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，選取嬰幼兒配方乳粉樣品，分別添加3 個(gè)濃度水平的膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照本方法進(jìn)行前處理和檢測(cè)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6 次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。4 種化合物在不同加標(biāo)水平下的平均回收率為87.5%～102.4%，RSD為3.0%～7.3%。表明本方法精密度良好，能夠滿(mǎn)足嬰幼兒配方乳粉中膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇的測(cè)定要求。

表3 樣品的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs for analytes(n=6)

2.8 準(zhǔn)確度

為驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)控樣品進(jìn)行確證。采用本方法對(duì)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院奶粉質(zhì)控樣品SRM 1849a進(jìn)行3次平行檢測(cè)，結(jié)果表明，所有結(jié)果均在質(zhì)控樣品含量范圍內(nèi)(表4)。

2.9 實(shí)際樣品的測(cè)定

在市場(chǎng)上隨機(jī)挑選10個(gè)品牌的嬰幼兒配方奶粉(標(biāo)簽上均標(biāo)注了該4種成分的含量)，分別采用本方法以及現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[3-6]進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，兩種方法的測(cè)定結(jié)果一致(表5)，且測(cè)定結(jié)果均符合國(guó)家強(qiáng)制性產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)簽明示值的要求。

表5 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果Table 5 Analytical results for the market samples (mg/100kJ)

a：obtained by national standard method；b：obtained by the developed method

3 結(jié) 論

本研究針對(duì)嬰幼兒配方乳粉中膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇尚缺少方便、快速同時(shí)檢測(cè)方法的現(xiàn)狀，利用同位素內(nèi)標(biāo)和HPLC-MS/MS，建立了嬰幼兒配方乳粉中該4種成分的同時(shí)檢測(cè)方法。結(jié)果表明，膽堿和左旋肉堿在0.01～2.0 mg/L范圍內(nèi)，?；撬岷图〈荚?.1～2.0 mg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，膽堿和左旋肉堿的檢出限均為1.5 mg/kg，牛磺酸和肌醇的檢出限均為15 mg/kg。樣品基質(zhì)加標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明該方法回收率高、精密度良好；質(zhì)控樣品檢測(cè)以及實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度高，能滿(mǎn)足嬰幼兒配方乳粉中膽堿、左旋肉堿、?；撬岷图〈嫉亩繖z測(cè)要求。

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