黃 鑫,王 妮,張 勇,李帥坪,劉淑瑩,2*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所 長(zhǎng)春質(zhì)譜中心，吉林 長(zhǎng)春 130022)

西洋參原產(chǎn)于加拿大東南部和美國(guó)北部，與人參同屬于五加科人參屬植物，主要藥效成分均為皂苷類[1-2]。西洋參具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、提高記憶力等方面的藥理作用[3-7]，具有較高的治療和保健價(jià)值。與人參相比，西洋參性寒涼，味微苦，歸心、肺、腎經(jīng)。人參的加工炮制品有生曬參和紅參，而西洋參的常用加工品為生曬西洋參類，對(duì)于西洋參的炮制品西洋紅參研究較少。已報(bào)道的皂苷類化合物的常用分析檢測(cè)技術(shù)為高效液相色譜法(紫外檢測(cè)器和蒸發(fā)光檢測(cè)器)[8-12]。隨著現(xiàn)代化高新技術(shù)的不斷發(fā)展，高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在應(yīng)用方面取得了很大進(jìn)展，在中醫(yī)藥領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越重要的作用[13-19]。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以同時(shí)對(duì)分析物進(jìn)行含量測(cè)定和結(jié)構(gòu)鑒定，檢測(cè)更為簡(jiǎn)便、快速、效率更高。現(xiàn)代研究表明，中藥發(fā)揮藥效是其整體成分共同作用和多靶標(biāo)機(jī)制，因此同時(shí)檢測(cè)盡可能多的成分至關(guān)重要。超高效液相色譜-軌道阱高分辨質(zhì)譜法(UPLC Orbitrap HRMS)同時(shí)具備液相色譜的高度分離性能及軌道阱高分辨質(zhì)譜的高敏感性和檢測(cè)能力，且樣品消耗量小、靈敏度高、選擇性強(qiáng)，以及將分離和結(jié)構(gòu)確定一次完成等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)樣品進(jìn)行更加準(zhǔn)確可靠的分析[20]，在天然藥物化學(xué)分析中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是藥物分析領(lǐng)域的主要研究手段。

目前對(duì)西洋參藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)研究，多以幾種常見人參皂苷Rg1、Re、Rb1等的含量或動(dòng)態(tài)變化為考察指標(biāo)[21]。本研究采用超高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法(UPLC Orbitrap HRMS)，通過高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)和串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，總結(jié)了西洋參中4種不同類型皂苷的特征質(zhì)譜碎裂規(guī)律，在此基礎(chǔ)上鑒定出西洋參中55種皂苷類成分，并對(duì)比了不同西洋參加工炮制品中皂苷類組成的差異，為揭示不同加工方法對(duì)西洋參皂苷成分的影響規(guī)律提供了依據(jù)，為西洋參的開發(fā)利用以及闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

UltiMate 3000 series 高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo-Fisher公司)；Q-Exactive四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo-Fisher公司)；BT25S電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rh2、Rk1、Ro、F1、F2和偽人參皂苷F11(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；乙腈(色譜純，德國(guó)默克公司)；甲醇、甲酸(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；正丁醇(分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；超純水(德國(guó)Milli-Q超純水系統(tǒng)制備)。

鮮西洋參(6年生)購(gòu)于吉林省撫松縣，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為五加科人參屬西洋參PanaxquinquefoliumL.根。將鮮西洋參洗凈、晾干表面水分、分級(jí)，選擇主根直徑在1.0～1.5 cm的鮮參分別進(jìn)行不同加工處理。將西洋鮮參置于陰涼通風(fēng)處自然晾干，制備西洋生曬參。在不同蒸制溫度(100、120 ℃)下蒸制4 h，50 ℃下烘干，制備西洋紅參。

1.2 對(duì)照品與供試品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rh2、Rk1、Ro、F1、F2和偽人參皂苷F11各1 mg,分別用甲醇溶解，定容至1 mL，制成1 mg/mL溶液，備用。

取不同加工西洋參樣品，粉碎，過80目篩。精密稱取樣品粉末1.0 g，置于50 mL離心管中，加入10 mL 80%甲醇，室溫下超聲提取3次，每次30 min，合并上清液，減壓濃縮至1 mL，過0.45 μm微孔濾膜，待測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件Thermo Scientific Syncronis C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸(A)-乙腈(B)。梯度洗脫程序：0～10 min，10%～20% B；10～40 min，20%～100% B；40～50 min，100% B。流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為35 ℃。

1.3.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)，采用負(fù)離子模式，噴霧電壓為2.5 kV，毛細(xì)管溫度為320 ℃，透鏡電壓50 eV，鞘氣流速40 arb，輔助氣流速10 arb，輔助氣溫度300 ℃，掃描范圍m/z150.0 ～2 000.0，質(zhì)譜分辨率70 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC Orbitrap HRMS實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

考察了不同流動(dòng)相組成(甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水)和梯度洗脫程序，以皂苷類成分的分離效果和離子相對(duì)豐度為指標(biāo)，最終確定乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相，梯度洗脫程序如“1.3.1”所示。在負(fù)離子模式下，優(yōu)化Orbitrap HRMS參數(shù)，以皂苷類成分的離子強(qiáng)度為依據(jù)，自動(dòng)優(yōu)化了軌道阱內(nèi)部參數(shù)，手動(dòng)優(yōu)化了電噴霧離子源參數(shù)，如“1.3.2”所述。

圖1 原人參二醇型、原人參三醇型、齊墩果烷型和奧克梯隆型皂苷的苷元結(jié)構(gòu)Fig.1 Aglycone structures of protopanaxdiol，protopanaxtriol，oleanane and ocotillol

2.2 4種類型皂苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

西洋參中含有的皂苷類成分主要為三萜皂苷，依據(jù)結(jié)構(gòu)的不同可分為3組：達(dá)瑪烷型(Dammarane)、奧克梯隆型(Ocotillol)和齊墩果烷型(Oleanane)(圖1)。達(dá)瑪烷型又分成兩類，分別為原人參二醇型(Protopanaxdiol)和原人參三醇型(Protopanaxtriol)。采用負(fù)離子模式，在人參皂苷的一級(jí)質(zhì)譜圖中，其準(zhǔn)分子離子主要以[M-H]-和[M+HCOOH-H]-形式存在。通過四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜分析可以獲得皂苷類成分的精確分子質(zhì)量，通過串聯(lián)質(zhì)譜分析可獲得皂苷類化合物的碎片離子信息，以確定皂苷苷元的類型和苷元所連接糖鏈的單糖組成和連接順序。以下分別對(duì)西洋參中4種不同類型皂苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品進(jìn)行質(zhì)譜分析，并總結(jié)了不同類型皂苷的結(jié)構(gòu)特征和裂解規(guī)律。

2.2.1原人參二醇型(Protopanaxdiol，PPD) 以人參皂苷Rb1為例，一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z1 107.605 7[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，串聯(lián)質(zhì)譜分析得到碎片離子m/z945和m/z783，分別為失去C20位1分子葡萄糖殘基(162 Da)和兩分子葡萄糖殘基(162 Da+162 Da)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步丟失C3位1分子葡萄糖殘基生成m/z621碎片離子，丟失兩分子葡萄糖殘基生成m/z459碎片離子。除了糖苷鍵斷裂生成的一系列碎片離子外，還檢測(cè)到糖鏈的交叉環(huán)斷裂生成的碎片離子(m/z101和m/z221)。根據(jù)其他原人參二醇型皂苷Rb2、Rc、Rd、Rg3、F2、Rh2的串聯(lián)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)此類型皂苷具有相同的碎裂途徑，其中m/z459離子為原人參二醇型皂苷苷元的特征碎片離子，單糖殘基146 Da 和 132 Da分別對(duì)應(yīng)鼠李糖和阿拉伯糖或木糖。

2.2.2原人參三醇型(Protopanaxtriol，PPT) 以人參皂苷Re為例，一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z945.545 9[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，串聯(lián)質(zhì)譜分析得到碎片離子m/z783，為失去C20位1分子葡萄糖殘基(162 Da)。進(jìn)一步丟失C6位1分子鼠李糖殘基(146 Da)生成m/z637碎片離子，丟失1分子鼠李糖殘基和1分子葡萄糖殘基(146 Da+162 Da)生成m/z475碎片離子。檢測(cè)到糖鏈的交叉環(huán)斷裂生成的碎片離子有m/z101、m/z205和m/z279。根據(jù)其他原人參三醇型皂苷Rg1、Rg2、Rh1、F1的串聯(lián)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)此類型皂苷具有相同的碎裂途徑，其中m/z475離子為原人參三醇型皂苷苷元的特征碎片離子。

2.2.3奧克梯隆型(Ocotillol) 以偽人參皂苷F11為例，一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z799.486 5 [M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，串聯(lián)質(zhì)譜分析得到碎片離子m/z653，為失去C6位1分子鼠李糖殘基(146 Da)。丟失1分子鼠李糖殘基和1分子葡萄糖殘基(146 Da+162 Da)生成m/z491碎片離子，此離子為奧克梯隆型皂苷苷元的特征碎片離子。檢測(cè)到糖鏈的交叉環(huán)斷裂生成的碎片離子有m/z101、m/z205和m/z279。

2.2.4齊墩果烷型(Oleanane) 以人參皂苷Ro為例，一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z955.493 0 [M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，串聯(lián)質(zhì)譜分析得到碎片離子m/z793，為失去1分子葡萄糖殘基(162 Da)。丟失兩分子葡萄糖殘基(162 Da+162 Da)生成m/z631碎片離子。丟失3分子葡萄糖殘基(162 Da+162 Da+162 Da)生成m/z455碎片離子，此離子為齊墩果烷型皂苷苷元的特征碎片離子。檢測(cè)到糖鏈的交叉環(huán)斷裂生成的碎片離子有m/z101、m/z119和m/z221。

2.2.5取代型皂苷對(duì)西洋參中發(fā)現(xiàn)的兩種取代型皂苷的質(zhì)譜行為進(jìn)行分析，以總結(jié)丙二酰基取代和乙酰基取代人參皂苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律。以取代型人參皂苷Rg1為例，丙二?；藚⒃碥誖g1在一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z885.596 5 [M-H]-準(zhǔn)分子離子峰。在二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜中，易丟失中性碎片86 Da(丙二?；?產(chǎn)生離子m/z799。串聯(lián)質(zhì)譜分析得到碎片離子m/z637，為失去1分子葡萄糖殘基(162 Da)；失去兩分子葡萄糖殘基(162 Da+162 Da)生成原人參三醇型人參皂苷苷元的特征碎片離子m/z475。可見，此m/z799離子的串聯(lián)質(zhì)譜碎裂規(guī)律與人參皂苷Rg1準(zhǔn)分子離子m/z799.77 [M-H]-一致。乙?；藚⒃碥誖g1在一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z841.608 0 [M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，在二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜中，易丟失中性碎片42 Da(乙酰基)產(chǎn)生離子m/z799，此離子的串聯(lián)質(zhì)譜分析得到的碎片離子也與人參皂苷Rg1準(zhǔn)分子離子m/z799.4862[M-H]-相同。綜合以上分析，根據(jù)取代型皂苷的質(zhì)譜特性，結(jié)合分子量信息、中性碎片丟失和相對(duì)應(yīng)的中性皂苷碎裂規(guī)律比對(duì)，可對(duì)西洋參中的丙二?；〈鸵阴；〈碥者M(jìn)行歸屬。

2.3 西洋參中皂苷類成分歸屬鑒定

對(duì)西洋參中皂苷類成分進(jìn)行歸屬鑒定，在負(fù)離子模式下，通過UPLC Orbitrap HRMS分析，將各未知皂苷成分在總離子流圖中的相對(duì)保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜圖中獲得的精確分子量信息和串聯(lián)質(zhì)譜分析得到的碎片離子種類和裂解途徑與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，確定苷元類型和所連接糖鏈的單糖組成與連接順序，進(jìn)而推測(cè)此皂苷化合物的結(jié)構(gòu)歸屬。已歸屬鑒定的55個(gè)皂苷類成分的UPLC Orbitrap HRMS數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 人參皂苷的色譜保留時(shí)間和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 Retention time and high resolution mass spectrometric data of ginsenoside

(續(xù)表1)

GinsenosideRetentiontimetR/min[M-H]-(m/z)MS/MSfragment(m/z)GypenosideXⅦ32 52945 5476783，179，621，323，459，101，221Rs232 941119 30061077，945，149，783，293，621，459，191，101，221Pseudo-RC134 45987 8010945，783，161，621，459，101，221QuinquefoliumⅢ35 53987 7995945，783，161，621，459，101，221Rg635 83765 9034619，145，457，307，101，205，279Rg436 22765 8999619，145，457，307，101，205，279F236 79783 5089621，161，459，101Rk336 85619 8947457，161，101ZingibrosideR137 25793 8967631，455，101，221Rh437 37619 8945457，161，10120(S)-Rg338 09783 5098621，179，459，323，101，22120(R)-Rg338 38783 5098621，179，459，323，101，22120(S)-Rs340 12825 6952783，621，179，459，323，101，221CalendulosideE40 28631 8041455，14920(R)-Rs340 38825 6930783，621，179，459，323，101，221Rk141 29765 9967603，161，441，323，101，221Rg541 60765 9852603，161，441，323，101，22120(S)-Rh242 75621 4380459，161，10120(R)-Rh243 00621 4380459，161，101Rs543 43807 5996765，603，161，441，323，101，221Rs443 77807 5998765，603，161，441，323，101，221

在分析的55個(gè)皂苷成分中，經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜給出不同類型人參皂苷苷元的特征碎片離子(m/z459，m/z475，m/z491，m/z455)，可初步歸屬此皂苷為原人參二醇型、原人參三醇型、奧克梯隆型或齊墩果烷型。根據(jù)丟失糖殘基的種類、數(shù)量和糖苷鍵斷裂順序，可以進(jìn)一步推測(cè)此皂苷苷元所連接糖鏈信息，最終鑒定此成分。此外，在西洋紅參皂苷成分分析時(shí)還檢測(cè)到m/z441，m/z457，m/z493碎片離子，經(jīng)分析歸屬為轉(zhuǎn)化型皂苷苷元的特征碎片離子分別為：m/z441為Δ20(21)或Δ20(22)失水原人參二醇型皂苷的苷元離子，m/z457為Δ20(21) 或 Δ20(22)失水原人參三醇型皂苷的苷元離子，m/z493為24,25水合原人參三醇型皂苷的苷元離子。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[22]，Δ20(21)失水原人參三醇型皂苷先于其同分異構(gòu)體Δ20(22)失水原人參三醇型皂苷被洗脫下來，根據(jù)色譜相對(duì)保留時(shí)間順序可將二者區(qū)分。西洋參在蒸制過程中，其中的皂苷成分會(huì)發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)化，生成生曬西洋參中檢測(cè)不到的稀有皂苷成分(Rf2，Rh1，Rh2，Rh3，Rh4，Rk1，Rk2，Rk3，Rg3，Rg4，Rg5，Rg6)，同時(shí)部分人參皂苷在含量上也發(fā)生較大改變，這些成分的變化是西洋參蒸制藥效改變的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.4 不同西洋參加工品中差異皂苷成分比較

生曬西洋參和西洋紅參中皂苷成分的總離子流圖如圖2所示。對(duì)生曬西洋參和西洋紅參中已歸屬鑒定的55個(gè)皂苷類成分的相對(duì)含量進(jìn)行比較，將各成分在總離子流圖中峰面積與所有峰面積之和比較計(jì)算相對(duì)峰面積，以對(duì)比各人參皂苷的含量變化，結(jié)果列于表2。

表2 不同西洋參加工品中人參皂苷的相對(duì)含量(%)Table 2 Relative contents of ginsenosides in different processd Panax quinquefolium L.(%)

*no detected

結(jié)果顯示，生曬西洋參與不同溫度蒸制的西洋紅參的皂苷組成和含量存在顯著差異，皂苷類成分在蒸制過程中發(fā)生了化學(xué)轉(zhuǎn)化，并且這種轉(zhuǎn)化與蒸制溫度的高低具有一定相關(guān)性。丙二酰基取代和乙?；〈藚⒃碥諛O其不穩(wěn)定，西洋紅參中未檢出此類皂苷成分，這是因?yàn)樵谡糁七^程中發(fā)生酸水解轉(zhuǎn)化生成相對(duì)應(yīng)的中性皂苷使其含量急劇下降，而相對(duì)應(yīng)的中性皂苷(如原人參二醇型人參皂苷Rb1、Rb2)在100 ℃蒸制4 h的西洋紅參中的含量顯著升高。而在更高蒸制溫度120 ℃條件下蒸制4 h的西洋紅參中分子量較大的人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1含量顯著降低，生成分子量較小的稀有人參皂苷。其中一些產(chǎn)物皂苷是在蒸制過程中新生成，而在生曬西洋參中不存在，例如人參皂苷20(R,S)-Rf2、20(R)-Rh1、20(R)-Rh2、Rh3、Rh4、Rk1、Rk2、Rk3、20(R)-Rg2、20(R)-Rg3、Rg4、Rg5、Rg6。奧克梯隆型和齊墩果烷型人參皂苷偽人參皂苷F11和人參皂苷Ro也發(fā)生了糖苷鍵斷裂而含量降低，生成相應(yīng)分子量較小的稀有皂苷(Pseudoginsenoside RT5、Chikusetsusaponin IVa、Zingibroside R1、Calenduloside E)。

3 結(jié) 論

本文采用UPLC Orbitrap HRMS法快速測(cè)定西洋參中的人參皂苷，大大縮短了分析時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)，使定性、定量結(jié)果更準(zhǔn)確。并得出4種類型皂苷苷元的特征質(zhì)譜碎片離子(m/z459，m/z475，m/z491，m/z455)，總結(jié)了不同類型皂苷的特征質(zhì)譜碎裂途徑：C20位或C3位糖苷鍵水解以及糖鏈的交叉環(huán)斷裂，基于此特征初步歸屬和鑒定了西洋參中55種皂苷類成分。同時(shí)對(duì)比了不同蒸制溫度對(duì)西洋紅參皂苷組成和含量的影響，以及在蒸制過程中皂苷化學(xué)成分轉(zhuǎn)化的規(guī)律，結(jié)果表明，取代型皂苷轉(zhuǎn)化成相對(duì)應(yīng)的中性皂苷，分子量較大、極性較大的皂苷轉(zhuǎn)化成分子量較小、極性較小的稀有皂苷。通過與生曬西洋參進(jìn)行對(duì)比，總結(jié)出西洋紅參中特征的稀有皂苷組分，且蒸制溫度的升高有利于稀有皂苷組分的生成。本研究結(jié)果為西洋紅參炮制規(guī)范和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了科學(xué)依據(jù)。

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