郭 芬，曹靈慧，陳宇霖，歐柏青，吳秀山*

(1.湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)及魚類發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 心臟發(fā)育研究中心， 湖南 長沙 410081；2.湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 湖南 長沙410005)

GATA家族是一類能夠特異性識別受調(diào)控基因啟動子內(nèi)GATA基序并與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。其共同特點(diǎn)除了對一致性的序列(T/A)GATA(A/G)具有高度的親和性之外還均具有鋅指結(jié)構(gòu)。GATA家族包括GATA1至GATA6六個成員[1]，根據(jù)最初的研究及其參與的生命活動的不同，將此6種轉(zhuǎn)錄因子又細(xì)分為GATA1/2/3和GATA4/5/6。前者參與調(diào)控紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和性腺的發(fā)育，而后者則調(diào)控機(jī)體心臟、消化系統(tǒng)及胚組織的分化[2]；已知GATA1是造血系統(tǒng)特有的轉(zhuǎn)錄因子[3]，表達(dá)嚴(yán)格限制于造血細(xì)胞系，包括紅系祖細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。GATA1控制不同譜系分化的功能大多通過與不同的蛋白質(zhì)作用來實(shí)現(xiàn)，在紅系發(fā)育過程中，GATA1會與造血轉(zhuǎn)錄因子或染色體重塑復(fù)合體形成多種復(fù)合體，發(fā)揮特定的功能[4]。

gata1基因定位于Xp21-11上，cDNA為1.8 kb，所編碼的GATA1轉(zhuǎn)錄因子為413個氨基酸[5]。人的gata1基因具有6個外顯子，分子量約為42 kD，研究表明，人體gata1基因突變至少與唐氏綜合征兒童患者發(fā)生急性巨核細(xì)胞白血病部分有關(guān)[6]。斑馬魚gata1基因位于11號染色體上，共有6個外顯子，cDNA全長1 257 bp，編碼413個氨基酸。

本文采用的是一種新型的免疫學(xué)技術(shù)-DNA免疫技術(shù)[7]。該技術(shù)所用的質(zhì)粒pCAGGGS-p7含有雞的β-actin啟動子和CMV增強(qiáng)子[8]，可以使下游插入基因在哺乳動物細(xì)胞中更加高效的表達(dá)，且質(zhì)粒上具有KpnI、XhoI、EcoR I等多種酶切位點(diǎn)，方便目的基因的插入。本研究將具有g(shù)ata1目的基因的高純度重組質(zhì)粒pCAGGGS-p7/gata1注射進(jìn)小鼠肌肉、皮下部位，使小鼠體內(nèi)表達(dá)外源性的目的基因，發(fā)生抗原抗體免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)小鼠對外源DNA產(chǎn)生抗體。DNA免疫的詳細(xì)機(jī)理目前尚不十分清楚，其免疫機(jī)制可能為：肌細(xì)胞通過T小管和細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷把外源基因納入并表達(dá)相應(yīng)的抗原蛋白[9]，抗原蛋白被抗原呈遞細(xì)胞攝取后被水解為多肽，一部分與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合，被CD8+CTL細(xì)胞識別；另一部分多肽可以進(jìn)入溶酶體/內(nèi)體區(qū)與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合，表達(dá)在細(xì)胞膜后被CD4+TH細(xì)胞識別，從而來激發(fā)機(jī)體有效的免疫應(yīng)答[10]。分泌到細(xì)胞外的抗原則被帶有相應(yīng)抗體的B細(xì)胞捕捉，在Th細(xì)胞的作用下轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。Vahlsing等[11]認(rèn)為：肌細(xì)胞可能作為一種中心成分直接參與免疫應(yīng)答，而小鼠肌細(xì)胞能夠有效的吸收和表達(dá)外源DNA的機(jī)理尚不清楚，可能與其自身的結(jié)構(gòu)有關(guān)[12]。該免疫技術(shù)可用于已知DNA編碼而又不能得到目的蛋白或獲得的抗原蛋白為低免疫原性抗原的免疫。

由于斑馬魚血細(xì)胞的譜系及調(diào)節(jié)血細(xì)胞的基因與哺乳動物高度保守，且斑馬魚心血管系統(tǒng)早期發(fā)育與人類極為相似，而血液和心血管系統(tǒng)有缺陷的斑馬魚突變體仍然可以存活數(shù)天，為該領(lǐng)域研究提供了極為有利的條件，斑馬魚成為了造血系統(tǒng)研究的最佳模式生物[13]。為了進(jìn)一步通過斑馬魚研究gata1基因在血液血管發(fā)育方面的功能，我們需要制備GATA1多克隆抗體。本文克隆了斑馬魚gata1基因全部編碼區(qū)，并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGGS-p7/gata1通過DNA免疫技術(shù)免疫小鼠，分離免疫后血清，制備多克隆抗體。結(jié)果表明制備的GATA1多克隆抗體特異性好，效價高，能用于GATA1功能的進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞和主要試劑

大腸桿菌感受態(tài)DH5α、真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-p7以及HEK293T細(xì)胞為湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育實(shí)驗(yàn)室保存。BALB/c小鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。常規(guī)RpMII640培養(yǎng)液，含10%新生牛血清(FBS)，10 mmol/L Hepes，28 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。高保真酶試劑盒購自唯贊公司，限制性內(nèi)切酶KpnI、XhoI以及T4DNA連接酶均購自Takara公司。DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

在NCBI網(wǎng)站上搜索到斑馬魚gata1基因cDNA序列，經(jīng)primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物p1/p2如下所示。在p1/p2引物前均加入同源臂序列，同源臂序列中分別引入限制性內(nèi)切酶KpnI、XhoI識別位點(diǎn)。于上海生工公司合成，設(shè)計(jì)合成出的一對引物如下(下劃線序列為內(nèi)切酶識別位點(diǎn))：

p1：pCAG-gata1-F：

CTATAGGGCGAATTGGGTACC ATGGAGAACTCCTCTGAGCCTKpnI

p2：pCAG-gata1-R：ATCGATACCGTCGACCTCGAGTC ACACTAGTGTGGGCATCATXhoI

1.3 pCAGGS-p7/gata1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

首先用Trizol從發(fā)育至24 h的野生型斑馬魚胚胎中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板用上述p1/p2引物進(jìn)行高保真pCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出長1 257 bp的gata1基因序列。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，56 ℃復(fù)性15 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸30 s，4 ℃保存?zhèn)溆谩@得pCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳后經(jīng)回收制備約1 200 bp的gata1片段，與用限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI雙酶切pCAGGS-p7質(zhì)?；厥占s5 000 bp片段，用T4DNA連接酶16 ℃連接16 h。

1.4 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的鑒定

將上述gata1片段與pCAGGS-p7載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性單克隆菌落至液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。以培養(yǎng)菌液為模板并以p1/p2為引物進(jìn)行pCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后初步確定重組質(zhì)粒pCAGGGS-p7/gata1陽性克隆，并將陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步測序鑒定。

1.5 DNA免疫技術(shù)制備小鼠抗GATA1抗體

用pCAGGGS-p7/gata1重組質(zhì)粒免疫6-8周齡小鼠：電擊處理5只小鼠然后對其后肢股四頭肌注射重組質(zhì)粒DNA 50 μg，即每只小鼠注射100 μg。同時無目的基因片段的pCAGGGS-p7空載質(zhì)粒DNA等量注射5只小鼠作為對照組。分別在小鼠注射后的0、30、60 d，按上述方法注射同種相同劑量質(zhì)粒DNA。于67 d后取血分離血清，分裝后的血清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測GATA1多克隆抗體效價

將發(fā)育至24 h的野生型斑馬魚胚胎收集于1.5 mL離心管中。胚胎收集后用注射器將水吸凈，加入裂解試劑并用研磨棒研磨，在4 ℃搖床靜置30 min后將胚胎裂解物制成上樣樣本，沸水煮5 min，12 000 r/min，5 min取上清。取25 μL經(jīng)SDS-pAGE凝膠電泳2 h，凝膠經(jīng)半干轉(zhuǎn)20 min轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用DNA免疫產(chǎn)生的GATA1抗血清稀釋成不同濃度作一抗，用免疫前血清做陰性對照，4 ℃搖床過夜。次日，用pBST洗滌3次后加入1∶2 000抗小鼠的二抗，室溫孵育1.5 h，pBST洗滌3次后DAB顯色觀察。

1.7 免疫熒光檢測GATA1多克隆抗體效價

將培養(yǎng)48 h的HEK293T細(xì)胞，在pBS洗1次后用4%多聚甲醛固定30 min，用pBS洗3次，0.2%Triton-X-100處理10 min和5%山羊血清封閉30 min后實(shí)驗(yàn)組用DNA免疫產(chǎn)生的GATA1抗血清1∶100稀釋，4 ℃孵育過夜，對照組用等體積的免疫前血清4度孵育過夜。次日，pBS洗3次后，二抗孵育1.5 h，pBS洗3次。DApI按1∶1 000稀釋，孵育10 min，pBS洗3次，封片熒光顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-p7/gata1的構(gòu)建及鑒定

用p1/p2引物pCR擴(kuò)增得到約1 257 bp的gata1條帶(如圖1)，1、2、3號泳道對應(yīng)pCR產(chǎn)物純化回收后，在連接到pCAGGGS-p7質(zhì)粒的KpnI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGGS-p7/gata1(如圖2)。以重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的單克隆菌液為模板進(jìn)行pCR擴(kuò)增，鑒定的結(jié)果如下圖3所示，其中13，15，16號條帶與預(yù)期目的DNA片段大小相同。為進(jìn)一步確定重組質(zhì)粒序列的準(zhǔn)確性，選取13號泳道對應(yīng)的菌液提取質(zhì)粒測序，進(jìn)行核苷酸序列比對，結(jié)果表明：pCAGGGS-p7/gata1重組質(zhì)粒的目的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中人類gata1序列一致。以上結(jié)果表明：pCAGGS-p7/gata1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：DNA marker，1， 2，3：gata1基因pCR擴(kuò)增電泳圖。M: DNA marker, 1, 2, 3: gtat1 gene pCR amplified electrophoresis.圖1 pCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 pCR amplification electrophoresis

圖2 pCAGGGS-p7/gata1重組質(zhì)粒示意圖Fig.2 Construction of pCAGGGS-p7/gata1 Recombinant plasmid

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)；1-16：以重組質(zhì)粒的菌液為模板的pCR產(chǎn)物；13，15，16號泳帶為與預(yù)期目的條帶大小相近的條帶。M: DNA marker; 1-16: pCR products based on bacterial solution of Recombinant plasmid; The bands 13, 15 and 16 are similar to the size of the intended destination band.圖3 pCAGGGS-p7/gata1重組質(zhì)粒的pCR驗(yàn)證Fig.3 pCR Verification of pCAGGGS-p7/gata1 recombinant plasmid

2.2 GATA1多克隆抗體Western Blotting鑒定

提取發(fā)育至24 h的野生型斑馬魚胚胎總蛋白進(jìn)行Western blot檢測：用自制的GATA1多克隆抗體分別以1∶150、1∶500稀釋作為一抗進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示陰性對照未見特異性條帶，免疫后血清在42 kD處有一條特異的雜交帶出現(xiàn)，且稀釋濃度為1∶500時的雜交信號仍然非常明顯(如圖4)。說明免疫后的小鼠血清中產(chǎn)生了GATA1蛋白的特異性抗體，該抗體的特異性和敏感性良好。

2.3 GATA1多克隆抗體免疫熒光鑒定

免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明：陰性對照未見特異性熒光，DNA免疫制備的GATA1抗血清檢測HEK293T細(xì)胞中有較強(qiáng)特異性熒光，主要集中在細(xì)胞質(zhì)區(qū)域(如圖5)；該結(jié)果進(jìn)一步證明， DNA免疫產(chǎn)生的GATA1多克隆抗體能夠識別細(xì)胞生理狀態(tài)下的GATA1蛋白。

抗體稀釋倍數(shù)為：1.免疫前血清；2.1∶150；3.1∶500The detection of the antibody titers: 1.control; 2.1∶150; 3. 1∶500圖4 GATA1多克隆抗體Western-blotting鑒定Fig.4 Western-blotting of GATA1 polyclonal antibody

A：免疫前血清免疫的細(xì)胞核染色；B：用GATA1多克隆抗體免疫的細(xì)胞核染色；C：免疫前血清免疫的GATA1蛋白的表達(dá)；D：用GATA1多克隆抗體免疫的GATA1蛋白的表達(dá)；E：免疫前血清免疫的merge圖；F：用GATA1多克隆抗體免疫的merge圖A: Nuclear staining of serum immunization before immunization; B: Nuclear staining immunized with GATA1 polyclonal antibodies; C: Expression of GATA1 protein in serum before immunization; D: Expression of GATA1 protein immunized with GATA1 polyclonal antibody; E: Merge diagram of serum immunization before immunization; F: Merge diagram immunized with GATA1 polyclonal antibody圖5 免疫熒光檢測抗血清的特異性Fig.5 Immunofluorescence to detect antiserum specificity

3 討論

GATA1是造血祖細(xì)胞或前體細(xì)胞發(fā)育為特定類型血細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[15,16]，而斑馬魚又是生物研究的一個重要模式生物，斑馬魚心血管系統(tǒng)早期發(fā)育與人類極為相似，所以利用GATA1的抗體來進(jìn)一步研究斑馬魚的血液血管尤為重要。本研究的目的是制備高效價和特異性好的GATA1多克隆抗體。在研究中，我們采用的是新型免疫技術(shù)-DNA免疫技術(shù)；通過基因重組技術(shù)將編碼GATA1抗原蛋白的外源DNA直接導(dǎo)入動物細(xì)胞內(nèi)，在pCAGGGS-p7載體上的強(qiáng)啟動子的作用下，在宿主細(xì)胞中合成免疫原性蛋白；通過宿主細(xì)胞產(chǎn)生對該抗原蛋白的一系列免疫應(yīng)答，獲得免疫后血清。

Western Blot及免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定血清的效價，制備的GATA1多克隆抗體能與真核生物體內(nèi)表達(dá)的GATA1蛋白結(jié)合，同時檢測顯示該多克隆抗體與GATA1蛋白結(jié)合的特異性較好，雜帶少，為今后進(jìn)一步通過染色質(zhì)免疫共沉淀，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究gata1基因生物學(xué)功能提供了重要的研究材料[17,18]。

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