王炫 多麗娜 楊勇 曹先偉 林志淼

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科［王炫（現(xiàn)在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，330006）、多麗娜、楊勇、林志淼］；南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科（曹先偉）

結(jié)節(jié)性硬化癥（tuberous sclerosis complex，TSC）是一種常染色體顯性遺傳性疾?。?］，典型的皮膚表現(xiàn)為色素減退斑、面部血管纖維瘤、膠原瘤和甲周纖維瘤?；颊叱０橛邪d癇發(fā)作、精神異常等癥狀，皮膚損害往往是其最初的臨床表現(xiàn)［2］。TSC致病基因?yàn)門SC1（染色體9q34）和TSC2（染色體16p13）［3?4］，均屬腫瘤抑制基因，分別編碼錯構(gòu)瘤蛋白（hamartin）和馬鈴薯球蛋白（tuberin）。這兩種蛋白可在體內(nèi)形成二聚體，傳導(dǎo)生長因子信號和能量調(diào)控信號［5］，并與其他細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)間具有相互作用。任一基因發(fā)生突變，都可能會破壞細(xì)胞骨架介導(dǎo)的細(xì)胞基質(zhì)間黏附，導(dǎo)致mTOR通路活性增強(qiáng)，引發(fā)細(xì)胞增生失控，導(dǎo)致錯構(gòu)瘤發(fā)生［2，6］。基因檢測是TSC確診的金標(biāo)準(zhǔn)，然而即使結(jié)合能夠檢測大片段缺失和插入的多重探針連接擴(kuò)增技術(shù)檢測，整體檢出率僅有80%左右［7］。本研究通過PCR和測序的方法確診了1例體細(xì)胞鑲嵌突變引起的TSC患者。

資料與方法

1.對象：患者男，漢族，28歲，出生時無異常，約3～4歲時面部出現(xiàn)多發(fā)血管纖維瘤，5～7歲時臀部出現(xiàn)結(jié)締組織痣，16～17歲時左足趾甲出現(xiàn)甲周纖維瘤?；颊邿o癲癇病史，智力正常。體檢：患者面部中央可見多發(fā)粉紅色丘疹，左顴部融合成約6～10 mm斑塊（圖1A）；右側(cè)腰部可見長約4 cm柳葉狀白斑（圖1B）；右足第3趾甲可見約綠豆大膚色質(zhì)硬結(jié)節(jié)，伴局部甲板輕度破壞（圖1C）。腹部超聲示腎部血管平滑肌脂肪瘤。根據(jù)國際TSC共識［7］，該患者診斷為TSC?；颊唠p親健康，三代內(nèi)直系或旁系血親未見類似癥狀。本研究通過北京大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

2.外周血DNA提?。喝』颊呒捌涓改竿庵苎? ml，2%乙二胺四乙酸抗凝，采用DNA試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，按照說明書步驟操作。檢測所提DNA純度和濃度，要求A260/A280范圍1.7～ 1.9，濃度50～ 100 ng/μl。

3.瘤體DNA提?。喝』颊吡鲶w組織100 mg，采用DNA提取試劑盒（美國ThermoFisher公司）提取組織DNA。檢驗(yàn)所提DNA純度和濃度。200例無TSC病史的無關(guān)正常人基因組DNA作為對照。

4.PCR擴(kuò)增目的基因：以200例無TSC病史的無關(guān)正常人基因組DNA作為對照。根據(jù)TSC1和TSC2基因序列（來源Ensemble），利用Primer?BLAST在線設(shè)計特異性引物，涵蓋TSC1基因23個外顯子和TSC2基因42個外顯子及各自的側(cè)翼序列，引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物序列：正向引物，5′?TGCAGTGCAGGAAAGGTAGG?3′；反向引物，5′?GCTGAGGGAGCCCCATATTC?3′。PCR 反應(yīng)體系 25 μl，含基因組 DNA 50 ng，dNTPs 0.4mmol/L，MgCl22.0mmol/L，正反向引物各10μmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s（每個循環(huán)依次降 0.5℃），72℃延伸45 s，10個循環(huán)；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸9 min，于4℃保存。取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳。

5.PCR產(chǎn)物序列測定及分析：所有PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送至北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。測序結(jié)果采用Bioedit軟件與Ensemble數(shù)據(jù)庫（http：//asia.ensembl.org/index.html）公布的 TSC1 和TSC2基因組正常序列進(jìn)行比對。

6.TSC相關(guān)基因二代測序：委托北京邁基諾基因公司制備患者DNA文庫，通過制定芯片對TSC1和TSC2目標(biāo)基因的編碼區(qū)及其側(cè)翼序列進(jìn)行捕獲和富集，使用Illumina Hiseq2000高通量測序平臺進(jìn)行突變檢測。

圖1 患者皮損表現(xiàn) 1A：面部中央密集粉紅色丘疹，左顴部融合成斑塊。箭頭指示提取皮損部位DNA進(jìn)行突變位點(diǎn)驗(yàn)證所選瘤體；1B：腰部柳葉狀白斑，長軸約4 cm；1C：右足第3趾甲綠豆大無色質(zhì)硬結(jié)節(jié)

結(jié) 果

1.患者DNA基因篩查：患者外周血DNA TSC1及TSC2基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳均可見目標(biāo)條帶，參照基因組正常序列，人工進(jìn)行比對未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。外周血DNA行第二代測序發(fā)現(xiàn)TSC2基因中存在1個僅8%的低頻變異位點(diǎn)（移碼突變，核苷酸改變c.5130_5131insT，氨基酸改變p.V1711Cfs*18）?；颊吡鲶wDNA擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)TSC2基因第40號外顯子攜帶有TSC2 c.5130_5131insT突變，導(dǎo)致了低頻移碼突變峰。再次比對Sanger測序檢測外周血DNA相應(yīng)的TSC2位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)存在相同的低頻率移碼突變峰（因突變峰較低，人工核對時遺漏）。見圖2。上述所有突變位點(diǎn)均經(jīng)反向測序驗(yàn)證。TSC2 c.5130_5131insT突變位點(diǎn)尚未見于HGMD數(shù)據(jù)庫、ExAC或1000G基因組計劃數(shù)據(jù)庫中。利用MutationTaster軟件對該突變位點(diǎn)進(jìn)行功能預(yù)測，預(yù)測分?jǐn)?shù)為1（分?jǐn)?shù)范圍0～1，分?jǐn)?shù)越高提示致病可能性越大）。

2.患者父母及無關(guān)對照基因篩查：患者父、母基因該位點(diǎn)測序未見異常（圖2A、2B），200例無關(guān)正常對照未攜帶類似基因突變。

討 論

TSC臨床表現(xiàn)復(fù)雜，約85%的患者可以檢測出突變基因，TSC1和TSC2基因突變分別占31%和69%，突變類型多樣且無熱點(diǎn)突變［8?9］。HGMD數(shù)據(jù)庫內(nèi)目前已報道的TSC1、TSC2基因突變導(dǎo)致TSC的分別有294種和940種，點(diǎn)突變?yōu)樽钪饕耐蛔兎绞?，分別占43%和50%，其次為小片段缺失突變，分別占比33%和21%，其余已有報道的6種突變類型以散發(fā)性病例多見，高達(dá)75%的病例來源于新的自發(fā)突變。雖然基因檢測是TSC確診的金標(biāo)準(zhǔn)，且目前并未有證據(jù)支持存在其他致病基因，但仍然有近20%的TSC患者在基因篩查過程中未能檢測到TSC1和TSC2基因突變［9?10］。因而，對于臨床癥狀明顯而外周血DNA基因篩查陰性的患者，并不能排除TSC的診斷。而這種高比例的血液檢測陰性結(jié)果，部分可能由鑲嵌現(xiàn)象所致［9?11］，“鑲嵌現(xiàn)象”為個體發(fā)育期間一部分體細(xì)胞發(fā)生突變導(dǎo)致出現(xiàn)新的性狀的現(xiàn)象。

圖2 TSC2基因測序圖（箭頭指示突變位點(diǎn)） 2A、2B：患者父母血液DNA測序，未攜帶樣本TSC2基因c.5130?5131insT突變；2C：患者血液DNA測序，c.5130?5131insT突變位點(diǎn)后出現(xiàn)低頻率移碼突變峰；2D：患者瘤體真皮組織DNA測序，突變位點(diǎn)c.5130?5131insT后出現(xiàn)較血液DNA稍高頻率的移碼突變峰

本例患者未發(fā)生癲癇及相關(guān)精神癥狀但出現(xiàn)了TSC的典型皮損，可以確診。最初利用患者血液樣本提取的基因組DNA進(jìn)行TSC1和TSC2基因的Sanger測序時，并未發(fā)現(xiàn)典型等高比例測序峰值的雜合性突變位點(diǎn)。在對患者外周血DNA進(jìn)行高通量二代測序時，發(fā)現(xiàn)1個頻率為8%的TSC2基因可疑突變位點(diǎn)c.5130_5131insT（p.V1711Cfs*18）。由于不能排除二代測序可能帶來的低頻率假陽性突變位點(diǎn)，我們進(jìn)一步對患者臉部血管纖維瘤組織進(jìn)行DNA提取，并進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)的Sanger測序驗(yàn)證。同時回顧之前外周血DNA測序峰圖，發(fā)現(xiàn)血液及組織DNA的Sanger測序圖都存在低峰值的TSC2基因雙峰區(qū)段，拆解雙峰區(qū)段序列分析確定突變?yōu)閏.5130_5131位點(diǎn)插入了1個堿基T而導(dǎo)致的移碼突變，將導(dǎo)致終止密碼子出現(xiàn)，最終影響蛋白的功能。該突變不僅未在患者父母及200個無關(guān)正常對照中發(fā)現(xiàn)，在109的千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫和ExAC超過6萬人的數(shù)據(jù)庫中均未發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)（已上傳dbSNP數(shù)據(jù)庫，收錄號BankIt2066017 Seq1 MG589762）。因此，我們最終認(rèn)為發(fā)生在體細(xì)胞的TSC2基因c.5130_5131insT突變很可能是該患者的病因。該患者臨床表現(xiàn)相對典型TSC患者輕（皮損較局限，未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀）很可能也和鑲嵌突變僅累及部分而非全身細(xì)胞有關(guān)，因此臨床表現(xiàn)輕，且皮疹更局限［12］；同時，鑲嵌現(xiàn)象在TSC中發(fā)生率高達(dá)26%，且迄今為止所有報道攜帶有TSC1或TSC2鑲嵌突變的患者均可發(fā)現(xiàn)TSC癥狀［13］。因此，鑲嵌現(xiàn)象的存在也對我們分析TSC患者基因型與臨床表型之間關(guān)系提出了新的思路，對于臨床表現(xiàn)已能明確診斷TSC而血液樣本基因篩查呈陰性的患者，可以考慮取典型皮損組織DNA進(jìn)一步篩查致病基因，排除體細(xì)胞鑲嵌突變的可能。此外，對于此類存在鑲嵌現(xiàn)象的疾病，在進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷時需考慮其伴有生殖鑲嵌體的可能，并進(jìn)一步尋找能夠更加快速可靠發(fā)現(xiàn)鑲嵌突變的篩查方法。

綜上，本研究檢出的TSC2基因的c.5130_5131insT為新發(fā)現(xiàn)的突變，該病例的鑲嵌現(xiàn)象及突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了我們對TSC相關(guān)致病基因基因型與表型關(guān)系的認(rèn)識，也為我們?yōu)榛颊咛峁┻z傳咨詢和進(jìn)行產(chǎn)前診斷提供了依據(jù)。

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