賴美玲 葛小麗 張海平 周成龍 張曉利 楊莉佳

214000江蘇，無錫市第二人民醫(yī)院皮膚科（賴美玲、張海平、周成龍、張曉利、楊莉佳），兒科（葛小麗）

頭癬是臨床常見的兒童皮膚病，如果不及時(shí)診斷治療或誤診誤治，可嚴(yán)重影響患兒及家屬身心健康［1］。真菌鏡檢及培養(yǎng)在頭癬的診斷和療效評價(jià)中扮演重要角色。但形態(tài)學(xué)鑒定菌種耗時(shí)長，而常規(guī)的分子診斷所需試劑、儀器較多，不利于臨床推廣［2］。本研究采用形態(tài)學(xué)鑒定及常規(guī)PCR診斷技術(shù)，對照評價(jià)菌落PCR用于頭癬診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

一、臨床資料

病例來自2016年1月至2017年3月在無錫市第二人民醫(yī)院就診、臨床疑診為頭癬并進(jìn)行真菌鑒定的首診患者，共17例。

二、真菌鏡檢

夾取患者病發(fā)或皮屑，用復(fù)方氫氧化鉀（KOH）玻片法進(jìn)行真菌直接鏡檢。

三、真菌培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)菌種鑒定

將斷發(fā)或皮屑接種于含氯霉素和放線菌酮的沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）上，28℃培養(yǎng)14 d，每日觀察生長情況。根據(jù)菌落生長速度、大小、形態(tài)及顏色等特征和鏡下形態(tài)進(jìn)行菌種鑒定，必要時(shí)輔以馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基小培養(yǎng)試驗(yàn)。接種3周無生長者視為培養(yǎng)陰性。

四、菌落PCR基因組模板制備

將臨床標(biāo)本接種于SDA培養(yǎng)基上，每天觀察，看到有菌落生長時(shí)用取菌針挑取少量菌絲體，加入準(zhǔn)備好的PCR管（20 μl TE緩沖液）中，100℃水浴5 min，然后立即置于-20℃冰箱中5 min，水浴凍融再重復(fù)1次。14 000 r/min（半徑8 cm）離心5 min，取1 μl上清液作為模板行PCR。

五、常規(guī)PCR基因組模板制備

將臨床標(biāo)本接種于SDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)14 d成為絲狀菌落，用取菌針盡量刮取多量菌絲體，嚴(yán)格按照Biospin試劑盒說明書制備基因組模板的［3］。

六、PCR擴(kuò)增

用真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）通用引物ITS 1（5′?TCCGTAGGTGAACC TGCGG ?3′）和ITS 4（5′?TCCTCCGCTTATTGATAT ?3′），PCR反應(yīng)體系25 μl，含10 × 擴(kuò)增緩沖液2.5 μl，MgCl2（10 mmol/L）1.5 μl，dNTP混合物（10 μmol/L）2 μl，引物（10 μmol/L）各0.5 μl，DNA模板2 μl，Taq DNA聚合酶2 U。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min后，95℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，每個(gè)加樣孔點(diǎn)樣4 μl，電泳緩沖液為1×TAE，恒壓80 V，電泳約30 min。電泳結(jié)束后，取瓊脂糖凝膠在凝膠成像儀上觀察結(jié)果并攝片。反應(yīng)設(shè)陰性對照和陽性對照，陰性對照用去離子水代替DNA模板，陽性對照用須癬毛癬菌DNA基因組作為模板。

七、ITS區(qū)基因序列分析

PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司測定堿基序列，測定結(jié)果用Blast比對（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

結(jié) 果

一、一般資料

17例兒童頭癬患者中，女12例，男5例，年齡3～8歲［（5.24±4.42）歲］。膿癬6例，黑點(diǎn)癬3例，白癬8例。

二、真菌鏡檢及培養(yǎng)結(jié)果

17例中15例真菌鏡檢陽性，為發(fā)內(nèi)或發(fā)外菌絲或孢子，17例真菌培養(yǎng)均為陽性，形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果為須癬毛癬菌5例，紫色毛癬菌1例，紅色毛癬菌1例，斷發(fā)毛癬菌1例，石膏樣小孢子菌2例，犬小孢子菌7例。

三、菌落PCR的DNA模板制備時(shí)間

17例標(biāo)本培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見菌落且可用于制備DNA模板的時(shí)間為（3.82±0.50）d，其中6例3 d，8例為4 d，3例為5 d。

四、菌落PCR與常規(guī)PCR、形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果比較

17株菌種菌落PCR均擴(kuò)增出陽性條帶。在相同條件下，菌落PCR與常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖結(jié)果一致，但前者條帶稍暗。見圖1。

將菌落PCR產(chǎn)物及常規(guī)PCR產(chǎn)物均進(jìn)行堿基序列測定，測序片段為ITS1和ITS4之間的ITS區(qū)，經(jīng)Blast比對，菌落PCR與常規(guī)PCR的菌種鑒定結(jié)果一致，其中須癬毛癬菌6例，斷發(fā)毛癬菌2例，犬小孢子菌7例，石膏樣小孢子菌2例。

圖1 菌落PCR與常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 M：100 bp Ladder；1：陰性對照；2：陽性對照（須癬毛癬菌）；3～19：常規(guī)PCR結(jié)果；3a～19a：菌落PCR結(jié)果

以常規(guī)PCR為標(biāo)準(zhǔn)，菌落PCR菌種鑒定正確率為100%，形態(tài)學(xué)鑒定正確率為88.2%，其中1株斷發(fā)毛癬菌被形態(tài)學(xué)鑒定為紫色毛癬菌，1株須癬毛癬菌形態(tài)學(xué)鑒定為紅色毛癬菌。

討 論

常規(guī)PCR擴(kuò)增前的DNA制備需要經(jīng)過破壁、抽提、沉淀、純化等步驟，所需時(shí)間較長，涉及的試劑及儀器較多，這給分子鑒定的臨床推廣帶來較大阻力［7］。如果直接從臨床標(biāo)本提取真菌DNA，則需將標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，過程中可能會(huì)混入PCR反應(yīng)抑制物或造成真菌模板DNA的流失，使本來就含量甚微的DNA更難以檢測，出現(xiàn)假陰性結(jié)果［8］。所以目前極少直接從臨床標(biāo)本提取DNA進(jìn)行菌種鑒定［9］。

在前期實(shí)驗(yàn)中，我們將菌落PCR技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化、改良，應(yīng)用于絲狀真菌的鑒定，陽性率為84.2%［10］。因?yàn)榫銹CR省去抽提模板DNA的步驟，直接以菌體煮沸、凍解后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，涉及的試劑、儀器較少。但之前的實(shí)驗(yàn)研究所用菌種為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)醫(yī)學(xué)真菌中心的標(biāo)準(zhǔn)菌株，未進(jìn)行臨床標(biāo)本檢測。

本研究中，我們收集疑似頭癬患者的臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，并在操作過程中不斷改進(jìn)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程，對標(biāo)本取材的選擇、菌落PCR制備模板的條件、PCR的反應(yīng)條件等進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)，摸索最佳實(shí)驗(yàn)條件。17例臨床標(biāo)本的菌落PCR結(jié)果均為陽性，并成功測序，可以進(jìn)行菌種基因型鑒定。為了驗(yàn)證菌落PCR方法的可靠性，我們亦同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR菌種鑒定，經(jīng)Blast對比后發(fā)現(xiàn)，兩種技術(shù)菌種鑒定結(jié)果完全一致。但菌落PCR電泳條帶較常規(guī)PCR電泳條帶暗，可能是由于菌落PCR的DNA模板沒有完全清除細(xì)胞壁碎片及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在影響了PCR擴(kuò)增的反應(yīng)效率。形態(tài)學(xué)鑒定因技術(shù)人員的主觀差異等原因，鑒定正確率不及基因測序的正確率。

本研究結(jié)果顯示，菌落PCR可用于臨床頭癬病原菌的檢測，鑒定菌種的準(zhǔn)確性和可靠性較高，是一種快速簡便的分子檢測技術(shù)，易在臨床推廣。以后我們將擴(kuò)大樣本量并收集不同的真菌感染病例，以進(jìn)一步評價(jià)該方法的可靠性，為其在臨床推廣應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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［8］Metwally L,Fairley DJ,Coyle PV,et al.Improving molecular detection of Candida DNA in whole blood:comparison of seven fungal DNA extraction protocols using real?time PCR［J］.J Med Microbiol,2008,57（3）:296?303.doi:10.1099/jmm.0.47617?0.

［9］康道現(xiàn),冉玉平,代亞玲,等.直接從病發(fā)提取DNA鑒定菌種診治萬博節(jié)皮菌所致膿癬［J］.臨床皮膚科雜志,2013,42（6）:348?350.doi:10.3969/j.issn.1000?4963.2013.06.008.

［10］張曉利,呂雪蓮,沈永年,等.菌落PCR技術(shù)快速鑒別絲狀真菌的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華皮膚科雜志,2011,44（8）:556?559.doi:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2011.08.009.