江麗 劉倩 張新翠 龔春燕

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所藥劑科（江麗、龔春燕），中西醫(yī)結(jié)合科（劉倩、張新翠）

口服或外用抗菌藥物治療痤瘡有效，但隨著抗菌藥物的廣泛使用，痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes，P.acnes）的耐藥性也隨之產(chǎn)生，治療效果明顯降低。因此，評估痤瘡患者毛囊內(nèi)微生物對抗菌藥物敏感性的變化，可為臨床合理選擇抗菌藥物、減少耐藥性的產(chǎn)生提供參考。

一、材料和方法

1.實驗菌株：P.acnes分離自2014年8月至2016年4月我院中醫(yī)美容科門診中重度痤瘡患者皮損組織。本研究通過本單位醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。P.acnes標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 6919購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

2.實驗藥物：四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、甲氧芐啶、左氧氟沙星、氯霉素、克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院），夫西地酸（香港澳美制藥有限公司）。

3.培養(yǎng)基和主要試劑：改良GAM肉湯培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；脫纖維羊血（南京茂捷微生物科技有限公司）；P.acnes培養(yǎng)所需的厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧指示劑（日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社）；API?20A厭氧菌鑒定條（法國bioMérieux公司）。

4.細(xì)菌鑒定：按常規(guī)無菌棉拭子沾取膿皰膿血接種于厭氧血瓊脂平板，37℃孵育48～72 h，再經(jīng)分離純化、連續(xù)3次耐氧試驗（厭氧環(huán)境的氣體條件為5%CO2、10%H2、85%N2）及需氧培養(yǎng)條件下無細(xì)菌生長，鑒定為厭氧菌。取厭氧菌經(jīng)觸酶試驗、吲哚試驗、耐氧試驗陽性及生化系列試驗鑒定為P.acnes。

5.抗菌活性測定和最低抑菌濃度（MIC）測定：配制12種抗菌藥物原液（1.280 g/L），倍比稀釋至128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L。取各濃度試驗藥物1.0 ml分別加于改良GAM肉湯培養(yǎng)基（9 ml）中。厭氧培養(yǎng)48～72 h的標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離株，用生理氯化鈉溶液制成菌懸液置于無菌試管中，調(diào)整濁度與0.5號麥?zhǔn)瞎軡岫认嗤?，稀釋至約1.5×108CFU/ml的菌液用于以下實驗：①抗菌活性測定，吸取5 μl菌液接種于含藥培養(yǎng)基中（從最低濃度的培養(yǎng)基接種起），置于厭氧盒內(nèi)37℃培養(yǎng)48 h；參照CLSI 2013 M100?S23標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)［1］的標(biāo)準(zhǔn)折點判定菌的敏感性，其中夫西地酸采用EUCAST2010臨界濃度標(biāo)準(zhǔn)［2］判斷；②MIC測定，采用肉湯稀釋法分別測定12種藥物對P.acnes的MIC，設(shè)置溶媒對照（1%二甲基亞砜）和空白對照；用改良GAM肉湯培養(yǎng)基1∶1 000稀釋1.5×108CFU/ml的菌懸液，取稀釋后的菌懸液100 μl接種于含不同濃度藥物的肉湯培養(yǎng)基中，P.acnes的接種量為105CFU/孔，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后觀察P.acnes的生長情況。

二、結(jié)果

1.P.acnes的培養(yǎng)與鑒定：從112例痤瘡患者（年齡13～47歲，女62例，男50例）皮損標(biāo)本中共分離出100株P(guān).acnes，陽性檢出率為89.28%。

2.抗菌活性測定結(jié)果：12種抗菌藥對P.acnes的抗菌活性由高到低依次為，米諾環(huán)素、多西環(huán)素、左氧氟沙星、氯霉素、克林霉素、夫西地酸、四環(huán)素、阿奇霉素，紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素耐藥。見表1。

3.MIC檢測結(jié)果：12種抗菌藥中，MIC50范圍≤8.0 mg/L的有多西環(huán)素、米諾環(huán)素、左氧氟沙星和夫西地酸，16～64 mg/L有四環(huán)素、克拉霉素、氯霉素和克林霉素，≥128 mg/L有紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素和甲氧芐啶；MIC90范圍≤8.0 mg/L的僅有米諾環(huán)素，16～64 mg/L有多西環(huán)素、左氧氟沙星和夫西地酸，≥128 mg/L有四環(huán)素、紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、甲氧芐啶、氯霉素和克林霉素。見表1。

三、討論

P.acnes在痤瘡的發(fā)生中起重要作用，促進(jìn)毛囊皮脂腺導(dǎo)管細(xì)胞的角化、皮脂腺分泌和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，最終導(dǎo)致痤瘡的發(fā)生或復(fù)發(fā)?？诜Ｓ玫目咕幬镏饕獮樗沫h(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、硝基咪唑類等。外用抗菌藥物為夫西地酸、克林霉素和氯霉素等。

表1 100株痤瘡丙酸桿菌對12種抗菌藥的敏感性及最低抑菌濃度（MIC）

本實驗發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類藥物抗菌作用最強，米諾環(huán)素、多西環(huán)素、四環(huán)素敏感率分別為66%、36%和4%，其中米諾環(huán)素敏感率最高；氟喹諾酮類藥物左氧氟沙星，主要對革蘭氏陰性菌有較強的的抗菌活性，而實驗結(jié)果顯示其抗菌效果僅低于米諾環(huán)素；大環(huán)內(nèi)酯類藥物紅霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素耐藥率很高，均大于90%。有研究顯示，阿奇霉素對臨床P.acnes株耐藥率為82%，其中治療前的耐藥率為72.7%，治療后為92.5%［3?4］。對于大環(huán)內(nèi)酯類藥物，臨床使用更多的是其抗炎機理，也不排除協(xié)同的弱效抗菌作用，使療效更為肯定［5］。

外用抗菌藥物克林霉素對痤瘡棒狀桿菌和各種厭氧菌作用強［6］。本研究中，克林霉素耐藥率則達(dá)88%，這可能與其外用治療選擇頻率高，使用周期長有關(guān)。反之，氯霉素的外用制劑市售品種少，多為院內(nèi)制劑，由臨床處方用藥，耐藥率相對較低。夫西地酸對多種革蘭氏陽性菌有較強的抗菌作用，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)對P.acnes不敏感。這一結(jié)果與馬英等［7］的結(jié)果差異較大，可能的原因是實驗方法不同，有待進(jìn)行方法學(xué)比較。楊桂蘭等［8］報道，夫西地酸聯(lián)合他扎羅汀外用治療痤瘡療效確切，可能的原因是夫西地酸具免疫增強功能，能迅速消除細(xì)菌所致的組織水腫、滲出、變性、壞死等炎癥反應(yīng)［9］，多機制治療痤瘡可獲得較好效果。此外，夫西地酸臨床常用為乳膏劑型，基質(zhì)本身易于滲透，容易進(jìn)入毛囊內(nèi)殺滅P.acnes，而克林霉素、氯霉素多為凝膠劑和洗劑，兩種劑型向毛囊內(nèi)滲透能力弱。

體外試驗僅從一個側(cè)面反映了皮損處病原菌的耐藥狀況，不能完整反映體內(nèi)動態(tài)的機制變化，如抗炎作用和抗炎對厭氧菌株抑制狀態(tài)等。因此，需進(jìn)一步開展抗菌藥物抗炎作用和對痤瘡致病菌生長抑制的機制研究，為臨床合理選擇抗菌藥物及劑量提供有效數(shù)據(jù)。

［1］葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.3版.南京:東南大學(xué)出版社,2006:902.

［2］Jugeau S,Tenaud I,Knol AC,et al.Induction of toll?like receptors by Propionibacterium acnes［J］.Br J Dermatol,2005,153（6）:1105?1113.doi:10.1111/j.1365?2133.2005.06933.x.

［3］González R,Welsh O,Ocampo J,et al.In vitroantimicrobial susceptibility of Propionibacterium acnes isolated from acne patients in northern Mexico［J］.Int J Dermatol,2010,49（9）:1003?1007.

［4］Ross JI,Snelling AM,Eady EA,et al.Phenotypic and genotypic characterization of antibiotic?resistant Propionibacterium acnes isolated from acne patients attending dermatology clinics in Europe,the U.S.A.,Japan and Australia［J］.Br J Dermatol,2001,144（2）:339?346.

［5］鐘連生,馬道銘.大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗炎作用機制的進(jìn)展及在皮膚科的應(yīng)用［J］.國外醫(yī)學(xué)（皮膚性病學(xué)分冊）,2004,30（5）:273?275.doi:10.3760/cma.j.issn.1673?4173.2004.05.001.

［6］Abdel FNS,Darwish YW.In vitro antibiotic susceptibility patterns of Propionibacterium acnes isolated from acne patients:an Egyptian university hospital?based study［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol,2013,27（12）:1546?1551.doi:10.1111/jdv.12057.

［7］馬英,劉曄,王倩倩,等.夫西地酸對痤瘡丙酸桿菌的體外抗菌活性研究［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（11）:823?825.doi:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2014.011.018.

［8］楊桂蘭,趙敏,肖輝,等.夫西地酸聯(lián)合他扎羅汀治療中度尋常痤瘡的療效觀察［J］.國際皮膚性病學(xué)雜志,2015,41（2）:79?81.doi:10.3760/cma.j.issn.1673?4173.2015.02.004.

［9］Sch?fer H,Simonsen L.Fusidic acid in dermatology:an updated review［J］.Eur J Dermatol,2010,20（1）:6 ?15.doi:10.1684/ejd.2010.0833.