杜娟，吳博，殷松娜，史海燕，王愛紅，趙菊梅

（延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，延安 716000）

印記基因是子代體細(xì)胞中僅父源或母源一方同源等位基因表達(dá)而另一方不表達(dá)的基因，主要存在于真獸類哺乳動(dòng)物和有袋類動(dòng)物中。個(gè)體發(fā)育過程中，基因印記在子代配子形成過程中建立，配子攜帶的親本印記在受精、卵裂過程中一直保持，至胚胎發(fā)育為8細(xì)胞和囊胚期時(shí)，親本印記在性腺中發(fā)生大規(guī)模擦除[1]。早期胚胎發(fā)育過程中，印記基因?qū)μ汉吞ケP的生長具有調(diào)節(jié)作用，單一染色體來源的核移植胚胎因只含父源或母源一方染色體基因，印記基因表達(dá)異常，胚胎不能正常發(fā)育[2,3]；個(gè)體發(fā)育過程中，印記基因與組織器官的建成、腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，印記基因的缺失或異常表達(dá)可使組織器官發(fā)育異常，促進(jìn)腫瘤的形成和發(fā)展[4-6]。因此，探究印記基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制有助于胚胎發(fā)育、腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展等生理、病理過程揭示作用機(jī)制。

印記基因的表達(dá)主要受甲基化調(diào)控。胚胎發(fā)育過程中發(fā)育多能關(guān)聯(lián)3（developmental pluripotency associated 3，Dppa3，又稱為Stella或Pgc7）能夠抑制Tet2和Tet3介導(dǎo)的母源基因組去甲基化， 維持父源基因組中特定印記區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)[7]；Uhrf1（又稱為NP95）是連接DNA甲基化與組蛋白甲基化的樞紐，能夠與增殖細(xì)胞核抗原、G9a、Dmnt1等協(xié)同作用促進(jìn)DNA的甲基化[8,9]。Dppa3和Uhrf1對(duì)DNA甲基化的維持和促進(jìn)作用提示：Dppa3和Uhrf1協(xié)同表達(dá)可能對(duì)印記基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。前期研究中，我們通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析法發(fā)現(xiàn)人HEK293T細(xì)胞中Dppa3與Uhrf1存在相互作用[10]，然而二者相互作用是否對(duì)胚胎發(fā)育過程中印記基因的表達(dá)具有調(diào)控作用還不清楚。本研究擬通過Dppa3和Uhrf1外源表達(dá)載體的構(gòu)建探究二者協(xié)同作用對(duì)印記基因表達(dá)的影響，以期為印記基因的表達(dá)調(diào)控提供研究基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材料

小鼠畸胎瘤F9細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，培養(yǎng)于0.1%明膠包被的含10%胎牛血清（FBS，Gibco），100μmol/L非必須氨基酸和2mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液中。小鼠胚胎干細(xì)胞系J1購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC），培養(yǎng)于0.1%明膠包被的C57BL/6×129小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（購自賽業(yè)生物科技有限公司）中。

2 質(zhì)粒構(gòu)建

為了構(gòu)建Uhrf1過表達(dá)載體pCMV-Myc-Uhrf1和Dppa3過表達(dá)載體pCDH-Flag-Dppa3，以J1小鼠胚胎干細(xì)胞為材料，Trizol法提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得J1細(xì)胞的cDNA。以上述cDNA為模板，Uhrf1-EcoR1-F和Uhrf1-Xhol-R，F(xiàn)lag-Dppa3-Nhe1-F和Dppa3-NotI-R分別為擴(kuò)增引物（引物序列見表1），PCR擴(kuò)增法獲得Uhrf1和Dppa3的表達(dá)序列，酶切后分別與pCMV-myc和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體連接。將連接產(chǎn)物經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化入DH5α菌體中，小提測序鑒定正確后用去內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒提取Uhrf1和Dppa3的體外過表達(dá)載體pCMV-Myc-Uhrf1和pCDH-Flag-Dppa3用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

表1 質(zhì)粒構(gòu)建引物序列Tab.1 Primer sequences for plasmids construction

3 免疫共沉淀法（Co-IP）

為檢測Dppa3與Uhrf1之間是否有相互作用，收集J1細(xì)胞，加入含全蛋白酶抑制劑的NP-40細(xì)胞裂解液，冰上裂解15min，12000r離心15min，取上清。預(yù)留少量裂解物，剩余裂解物分兩份，一份加入Dppa3抗體和proteinA+G agarose，另一份加入IgG和proteinA+G agarose，4℃過夜旋轉(zhuǎn)孵育，離心棄上清，用含全蛋白酶抑制劑的NP-40裂解液洗滌上述沉淀3次，向沉淀中加入1×SDS蛋白上樣緩沖液，95℃煮10min，8000r/min離心10min，取上清進(jìn)行Western Blot檢測。

4 qPCR檢測基因的相對(duì)表達(dá)量

Trizol法提取各處理細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各基因的相對(duì)表達(dá)量（內(nèi)參基因和各基因的定量引物序列見表2）。反應(yīng)體系如下：2×SYBR premix Ex Taq（10ul），primer（上下游各 1μl），cDNA（1μl）， Rox（1μl），加水補(bǔ)至 20μl。反應(yīng)條件為：[95℃ 3min，（95℃ 5s， 60℃ 30s）×40 cycles]（擴(kuò)增條件），95℃ 5 s，（60℃ 1 min，持續(xù)升溫至95℃，熒光檢測間隔為5℃）（融解曲線測定條件）。各檢測基因的表達(dá)量變化以2-△△CT進(jìn)行計(jì)算，P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.2 Real-time PCR primer sequences

5 免疫熒光染色

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pCMV-Myc-Uhrf1和pCDH-Flag-Dppa3分別轉(zhuǎn)染至F9細(xì)胞中，36h后，PBS洗滌兩次，免疫染色固定液室溫固定15min，免疫染色洗滌液洗滌3次（每次5min），棄洗滌液，加入免疫染色封閉液室溫封閉90min，棄封閉液，分別加入鼠源Myc和Flag標(biāo)簽一抗（1∶500稀釋）4℃過夜封閉。棄一抗，分別加入Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（1∶500稀釋），室溫避光孵育2h，免疫染色洗滌液洗滌3次（每次5min），加入DAPI染液，室溫避光染核5min，免疫染色洗滌液洗滌3次（每次5min）。倒置熒光顯微鏡觀察法Uhrf1和Dppa3的分布，拍照記錄。

結(jié) 果

1 小鼠多能性干細(xì)胞中Uhrf1與 Dppa3存在相互作用

Uhrf1和Dppa3均參與基因的甲基化修飾，二者是否能夠協(xié)同作用調(diào)節(jié)印記基因的表達(dá)還不清楚。在前期研究中，為確定Dppa3對(duì)胚胎干細(xì)胞多能性的調(diào)節(jié)作用，我們以小鼠J1胚胎干細(xì)胞為材料，利用免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜法（Co-IP—MS）分離鑒定了J1細(xì)胞中Dppa3的相互作用蛋白，質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示Uhrf1與Dppa3存在相互作用[10]。在此，為探究Dppa3和Uhrf1對(duì)印記基因表達(dá)的調(diào)控作用，首先對(duì)Dppa3和Uhrf1之間是否存在相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示（圖1）：以小鼠J1胚胎干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，用Dppa3抗體進(jìn)行Co-IP，Western Blot可檢測到Uhrf1，即Dppa3與Uhrf1蛋白間存在相互作用，二者可能通過協(xié)同作用調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，該結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果一致。

圖1 Co-IP檢測Dppa3與Uhrf1間的相互作用Fig.1 Interaction between Dppa3 and Uhrf1 was analyzed using co-immunoprecipitation assay

2 Dppa3與Uhrf1協(xié)調(diào)作用調(diào)節(jié)印記基因的表達(dá)

為探究Dppa3和Uhrf1協(xié)同作用對(duì)印記基因的表達(dá)影響，首先利用基因體外克隆技術(shù)構(gòu)建了Dppa3和Uhrf1的過表達(dá)載體pCDH-Flag-Dppa3和pCMV-Myc-Uhrf1。將經(jīng)測序鑒定正確的Dppa3和Uhrf1表達(dá)載體pCDH-Flag-Dppa3和pCMV-Myc-Uhrf1以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至F9細(xì)胞中，24h后，用Flag和Myc標(biāo)簽抗體對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行免疫染色，觀察Flag-Dppa3和Myc-Uhrf1在F9細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示（圖2）：體外構(gòu)建的pCDH-Flag-Dppa3和pCMV-Myc-Uhrf1載體可正常表達(dá)Flag-Dppa3和Myc-Uhrf1融合基因，F(xiàn)lag-Dppa3在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有分布，Myc-Uhrf1僅存在于細(xì)胞核中，這與內(nèi)源Dppa3和Uhrf1的分布一致[11,12]。該結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pCDH-Flag-Dppa3和pCMV-Myc-Uhrf1載體能夠表達(dá)Dppa3和Uhrf1基因，可用于后續(xù)研究。

圖2 免疫熒光染色檢測pCDH-Flag-Dppa3和pCMV-Myc-Uhrf1載體基因在F9細(xì)胞的表達(dá)。比例尺，100μmFig.2 Immunofluorescent examination for expression of pCDH-Flag-Dppa3 and pCMV-Myc-Uhrf1 in F9 cells.Scale bar, 100μm

圖3 Dppa3與Uhrf1協(xié)調(diào)作用調(diào)節(jié)印記基因的表達(dá)。A，乙醇（RA的溶劑，用作對(duì)照，CT）和1μmol/L RA處理后的J1細(xì)胞形態(tài)；比例尺：100μm； B，qPCR檢測RA處理J1細(xì)胞后Dppa3、Uhrf1、Peg3和Igf2基因的表達(dá)變化；C和D，qPCR檢測RA誘導(dǎo)J1細(xì)胞分化過程中Dppa3（2Vmyc+Dppa3+RA）、Uhrf1(Vpcdh+Uhrf1+RA)、Dppa3和Uhrf1(Uhrf1+Dppa3+RA)過表達(dá)對(duì)印記基因Peg3（C）和Igf2（D）表達(dá)的影響，以空載轉(zhuǎn)染的RA溶劑處理組細(xì)胞（2V+CT）為正常對(duì)照組，空載轉(zhuǎn)染的1μmol/L RA處理組細(xì)胞（2V+RA）為RA處理組；*P＜0.05；**P＜0.01Fig.3 Imprinted gene expression was regulated by Dppa3 and Uhrf1.A, morphology of J1 cells that were treated with ethanol (CT), or treated with 1μmol/L RA; scale bar∶ 100μm; B, relative expression change of Dppa3, Uhrf1, Peg3 and Igf2 in RA treated J1 cells was detected using real-time PCR;C and D, real-time PCR examination for two imprinting gene Peg3 (C) and Igf2 (D) expression, J1 cells pre-transfected with empty vectors（2V）,pCDH-Flag-Dppa3（Dppa3）, pCMV-Myc-Uhrf1（Uhrf1）, pCDH-Flag-Dppa3 and pCMV-Myc-Uhrf1（Uhrf1+Dppa3） were treated with ethanol（CT）or 1μmol/L RA （RA）separately; * P＜0.05; ** P＜0.01

印記基因的表達(dá)會(huì)隨胚胎發(fā)育階段的不同而改變，為明確Dppa3和Uhrf1協(xié)同表達(dá)對(duì)胚胎發(fā)育過程中印記基因的調(diào)節(jié)作用，首先以全反式維甲酸（RA）為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)J1胚胎干細(xì)胞進(jìn)行分化[13]。結(jié)果顯示：RA可誘導(dǎo)J1小鼠胚胎干細(xì)胞分化，加入RA后J1細(xì)胞的克隆樣結(jié)構(gòu)消失、細(xì)胞向外遷移呈單層生長、細(xì)胞形態(tài)由近圓形變?yōu)楸馄剿鬆罨蚨嘟菭睿▓D3A）。在RA誘導(dǎo)J1細(xì)胞分化的過程中，Dppa3基因表達(dá)下調(diào)，Uhrf1基因表達(dá)無明顯變化，印記基因Peg3表達(dá)上調(diào)、Igf2表達(dá)下調(diào)（圖3B）。然而，分別以pCDH-Flag-Dppa3、pCMV-Myc-Uhrf1、pCDH-Flag-Dppa3和pCMV-Myc-Uhrf1轉(zhuǎn)染J1細(xì)胞，用1μM RA誘導(dǎo)J1細(xì)胞分化時(shí)發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)Dppa3或Uhrf1均可抑制RA誘導(dǎo)的印記基因Peg3上調(diào)、Igf2下調(diào)；同時(shí)過表達(dá)Dppa3和Uhrf1可顯著增強(qiáng)Dppa3或Uhrf1對(duì)印記基因Peg3（圖3C）和Igf2（圖3C）調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果表明Dppa3和Uhrf1在胚胎發(fā)育過程中對(duì)印記基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。

討 論

印記基因的表達(dá)模式為單等位基因表達(dá)，即雙親來源的等位基因僅父源或母源一方表達(dá)，另外一方不表達(dá)。單等位基因的表達(dá)模式使得印記基因異常表達(dá)更易引起機(jī)體生命活動(dòng)網(wǎng)絡(luò)的紊亂—印記基因的異常表達(dá)不能夠通過等位基因的調(diào)節(jié)進(jìn)行“平衡”或“補(bǔ)償”。因此，印記基因異常表達(dá)常與個(gè)體異常發(fā)育、疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。胚胎發(fā)育過程中有研究結(jié)果顯示：母源印記基因如Peg3、Igf2和Peg10等可促進(jìn)胎兒和胎盤的生長，父源印記基因如H19、Igf2r和Grb10等可抑制胚胎的發(fā)育，父源或母源印記基因的缺失都可引起胚胎異常發(fā)育[14]。在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，印記基因異常表達(dá)不僅參與疾病的形成，也與腫瘤等疾病的臨床分期、預(yù)后相關(guān)，如已有研究顯示染色體15q11–q13區(qū)印記基因的異常表達(dá)與Prader-Willi/Angelman綜合征的形成相關(guān)[15,16]， Igf2、Peg10、H19等印記基因的表達(dá)與胃癌、肺癌、Wilms 腫瘤等腫瘤的臨床分期、預(yù)后相關(guān)[17,18]。印記基因與異常胚胎發(fā)育、腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提示：印記基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的繪制有助于胚胎發(fā)育和腫瘤等印記異常相關(guān)疾病作用機(jī)理和調(diào)節(jié)機(jī)制的揭示[19]。

印記基因的表達(dá)調(diào)控以DNA甲基化修飾為主。已有報(bào)道顯示Uhrf1和Dppa3均能夠參與DNA甲基化的調(diào)節(jié)。Uhrf1廣泛表達(dá)于生長旺盛的組織如早期胚胎和腫瘤組織中[20,21]。胚胎發(fā)育早期，Uhrf1能夠通過其SRA結(jié)構(gòu)域與半甲基化的DNA結(jié)合，募集G9a和Dmnt1促進(jìn)DNA的甲基化[8,22,23]，與親子代細(xì)胞間DNA甲基化的傳遞相關(guān)。腫瘤等組織中，Uhrf1通過其RING結(jié)構(gòu)域發(fā)揮泛素E3連接酶活性，促進(jìn)Dmnt和Dmnt3的泛素化降解，誘導(dǎo)全基因組DNA的低甲基化[24-26]。Dppa3的表達(dá)于印記基因甲基化直接相關(guān)。胚胎形成過程中，Dppa3表達(dá)于成熟卵母細(xì)胞、著床前的胚胎和原始生殖細(xì)胞形成期（E7.25至E15.5），其表達(dá)過程與印記基因的差異甲基化形成相關(guān)——等位基因的甲基化差異在卵母細(xì)胞和精子形成過程中出現(xiàn)（與Dppa3表達(dá)于胚胎原始生殖細(xì)胞形成期對(duì)應(yīng)），卵子與精子結(jié)合后在2細(xì)胞期發(fā)生父源基因組的主動(dòng)去基甲基化（與Dppa3表達(dá)于著床前的胚胎相對(duì)應(yīng)）[7,12]。受精卵中，Dppa3能夠直接抑制Tet3介導(dǎo)DNA主動(dòng)去甲基化，保護(hù)母源印記基因的DNA的甲基化[7]。Uhrf1對(duì)DNA甲基化的調(diào)節(jié)作用和Dppa3對(duì)印記基因DNA甲基化的保護(hù)作用提示：Uhrf1和Dppa3協(xié)調(diào)表達(dá)可能對(duì)印記基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。

前期研究中，我們通過Co-IP聯(lián)合質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)Dppa3與Uhrf1間存在相互作用[10]，然而二者相互作用是否影響印記基因的表達(dá)還不清楚。為確定Dppa3和Uhrf1對(duì)印記基因表達(dá)的調(diào)控作用，本研究首先通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)Dppa3與Uhrf1間存在相互作用，隨后以甲酸誘導(dǎo)分化前后的J1小鼠胚胎干細(xì)胞為模型，通過Dppa3和Uhrf1過表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：Dppa3和Uhrf1協(xié)調(diào)表達(dá)能夠調(diào)節(jié)印記基因表達(dá)。該研究結(jié)果的發(fā)現(xiàn)一方面有助于印記基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的闡明，另一方面為Dppa3、Uhrf1和印記基因表達(dá)異常相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的揭示，治療方式的選擇具有積極作用。

目前，本研究盡管通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)Dppa3和Uhrf1協(xié)調(diào)表達(dá)可以調(diào)節(jié)印記基因的表達(dá)，但二者協(xié)同作用是通過印記基因DNA甲基化修飾亦或其它基因表達(dá)調(diào)控方式調(diào)節(jié)印記基因的表達(dá)還不清楚。今后，我們將進(jìn)一步通過DNA甲基化測序等方法探究Dppa3與Uhrf1協(xié)調(diào)表達(dá)調(diào)節(jié)印記基因表達(dá)的機(jī)制。

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