李冠烈，湯少嫻，饒智華，牛丞威，陳樂詩，陳澤程，張韋深，龍?zhí)斐?，汪雪蘭，劉瓊*

（1.中山大學(xué) 新華學(xué)院，廣東廣州 510520；2.中山大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510520）

冠心病（coronary heart disease，CHD）對中老年人的健康有著嚴(yán)重的影響，隨著人們生活方式的改變、飲食結(jié)構(gòu)的變化，該病癥逐步發(fā)生在青年人群中[1-2]。引起該病癥的主要原因是心肌缺血后產(chǎn)生大量的活性氧自由基，對心肌細(xì)胞造成損傷，復(fù)灌后導(dǎo)致氧化損傷加重[3-4]。研究有效的治療缺血再灌注損傷的藥物，改善CHD患者的治療效果，有重要意義。

中醫(yī)在治療方面，以中草藥為主，對心肌缺血的預(yù)防和保護(hù)有較大進(jìn)展。其中，總黃酮因能夠保護(hù)心腦血管、抗癌而受到醫(yī)學(xué)研究的重視。廣金錢草的統(tǒng)一藥用名稱源于《嶺南草藥志》，在治療泌尿系感染、泌尿系結(jié)石、小兒疳積、癰腫等方面，有較好的治療效果[5-6]。有報(bào)道，極性較大黃酮能增加狗在體心臟冠脈流量及減少心肌耗氧量，可能和擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、減少心肌耗氧量，改善心肌缺氧有關(guān)系[7-9]。因?yàn)橹兴幊煞謴?fù)雜，各種成分含量低，研究技術(shù)手段等制約了對其心肌缺血保護(hù)作用機(jī)制的進(jìn)一步研究。國外對廣金錢草研究主要集中在其生物堿、黃酮苷、酚類等各物質(zhì)的化學(xué)成分的構(gòu)成上，對廣金錢草總黃酮對心臟缺血/再灌注損傷的分子保護(hù)作用研究暫未見太多報(bào)道[10-11]。大鼠的冠脈走形和血液循環(huán)途徑與人類接近，模型穩(wěn)定性較好，可用于探索研究。離體心臟不受神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)，影響因素較少、可控性強(qiáng)，是一種可選模型[12]。本文研究了廣金錢草總黃酮對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的分子保護(hù)作用，采用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)復(fù)制心肌缺血模型，通過設(shè)置對照組和4個(gè)不同濃度用藥組，觀察廣金錢草黃酮是否對心肌缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用，初步探討從分子水平對心肌保護(hù)作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用以及中藥進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Wistar大鼠25只，體重300～350 g，平均體重為（321.46±7.48）g。

實(shí)驗(yàn)藥品：肝素鈉（上海第一生化藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31022051），戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，高級純），其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：Langendorff、恒溫水浴、電子天平、pH儀、蠕動(dòng)泵、多導(dǎo)生理儀、縫合針和導(dǎo)管等。

1.2 建立大鼠離體心臟缺血/再灌注模型

大鼠斷頭后，迅速開胸，取出心臟，洗凈血液，迅速轉(zhuǎn)移、固定，常規(guī)恒壓灌流，維持灌流液溫度37 ℃。缺血/再灌注的過程為平衡20 min，停止灌流30 min，復(fù)灌120 min。

1.3 方法

采用2010年版《中華人民共和國藥典》廣金錢草總黃酮制備方法。

稱取廣金錢草干品約6g，加80mL95%乙醇，超聲波提2.5h，抽濾。濾渣以同法提取2.5h，抽濾，兩次濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，將濃縮液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，得樣品液，測得樣品中總黃酮的含量C=0.148mg/mL。

大鼠25只，分5組，分別是對照組（僅做灌流，不停灌和用藥）、A組（停灌前未用廣金錢草總黃酮處理）、B組（廣金錢草總黃酮低濃度1 μg/mL）、C組（廣金錢草總黃酮中濃度10μg/mL）、D組（廣金錢草總黃酮高濃度100 μg/mL），具體如下。采用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)記錄心臟功能。大鼠斬頭后，迅速開胸腔取出心臟，經(jīng)主動(dòng)脈進(jìn)行插管，心臟懸掛于Langendoff灌流裝置上，用37 ℃氧飽和的K-H液，充以5%CO2和95%O2混合氣體20 min，調(diào)節(jié)其pH值為7.35～7.40，灌流方法為恒溫、恒壓逆向灌流，灌流壓力設(shè)定為11 kPa。經(jīng)房室口將一注水球囊插入左心室，小囊經(jīng)導(dǎo)管和壓力換能器進(jìn)行連接，把左心室內(nèi)壓輸入Powerlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，進(jìn)行信號(hào)的自動(dòng)采集、記錄。對心肌梗死及氧化應(yīng)激損傷測定心臟，復(fù)灌時(shí)間延長至120 min。各組僅在廣金錢草總黃酮所用濃度方面有差異，其他均一致。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察廣金錢草總黃酮對大鼠離體心臟缺血/再灌注血流動(dòng)力學(xué)、心肌梗死程度、冠脈流出液中LDH含量的影響。

大鼠Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，采用ADInstruments公司的設(shè)備及配套PowerLab信號(hào)采集分析系統(tǒng)。

心肌梗死面積測定：冷凍保存、切片、TTC 染色、拍照、用Motic Med 6.0圖像分析系統(tǒng)分析處理圖像、計(jì)算百分比。

心臟流出液中乳酸脫氫酶（LDH）檢測，用南京建成生物技術(shù)公司的試劑盒，用分光光度法檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用IBM SPSS Statistics 22統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行本研究數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用（x-±s）表示，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用百分比（%）表示，分別用t和x2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對大鼠離體心臟缺血/再灌注血流動(dòng)力學(xué)的影響

廣金錢草總黃酮對大鼠離體心臟缺血/再灌注血流動(dòng)力學(xué)的影響見表1。結(jié)果表明，大鼠各項(xiàng)心功能指標(biāo)在復(fù)灌期間都出現(xiàn)了異常，和生理鹽水組比較，A組的RPP、±dP/dtmax、CF均顯著下降，表明缺血/復(fù)灌模型建立成功。不同濃度的廣金錢草總黃酮能夠改善缺血缺氧引起的血流動(dòng)力學(xué)改變，減輕因缺血/再灌注造成的心肌損傷，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.2 對大鼠離體心臟缺血/再灌注心肌梗死程度的影響

廣金錢草總黃酮對大鼠離體心臟缺血/再灌注心肌梗死程度的影響見圖1。結(jié)果表明，離體心臟停灌前，采取廣金錢草總黃酮進(jìn)行預(yù)處理，和A組比較，可以調(diào)節(jié)心肌formazan含量，降低心肌梗死面積，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖1 廣金錢草總黃酮對大鼠離體心臟缺血/再灌注心肌梗死程度的影響

2.3 對大鼠離體心臟缺血/再灌注冠脈流出液中LDH含量的影響

表1 廣金錢草總黃酮對大鼠離體心臟缺血/再灌注血流動(dòng)力學(xué)的影響（x-±s）

廣金錢草總黃酮對大鼠離體心臟缺血/再灌注冠脈流出液中LDH含量的影響見圖2。離體心臟停灌前，采取廣金錢草總黃酮進(jìn)行預(yù)處理，和A組比較，可以降低心肌冠脈流出液中LDH的含量，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖2 廣金錢草總黃酮對大鼠離體心臟缺血/再灌注冠脈流出液中LDH含量的影響

3 討論

研究結(jié)果顯示，不同濃度的廣金錢草總黃酮均能改善缺血缺氧引起的血流動(dòng)力學(xué)改變，減輕因缺血/再灌注造成的心肌損傷，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。血流動(dòng)力學(xué)是評價(jià)心功能的主要參數(shù)。由此證實(shí)，廣金錢草總黃酮對于改善缺血/再灌注造成的心肌損傷方面，能夠改善心臟功能，效果較好。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，廣金錢草有利膽、利尿、抗泌尿系結(jié)石、對心血管系統(tǒng)有影響、抗炎、鎮(zhèn)痛抗菌、益智、對血液有影響等[13-14]。急性心肌缺血損傷，梗死面積的大小直接影響到治療效果[15-16]。研究結(jié)果顯示，離體心臟停灌前，采取廣金錢草總黃酮進(jìn)行預(yù)處理，和A組比較，可以改善心肌formazan含量，降低心肌梗死面積，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）?？s小心肌梗死的面積，是治療效果的主要判斷依據(jù)。

LDH廣泛存在于細(xì)胞漿膜中，在正常情況下，其含量降低。研究結(jié)果顯示，離體心臟停灌前，采取廣金錢草總黃酮進(jìn)行預(yù)處理，和A組比較，可以降低心肌冠脈流出液中LDH的含量，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。由于發(fā)生了細(xì)胞膜和線粒體的損傷，使得細(xì)胞膜的通透性增加，造成LDH的變化。其水平降低，表明減少了心肌損傷的情況。

總之，廣金錢草總黃酮對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷有較好的分子保護(hù)作用，可以減輕因缺血/再灌注造成的心肌損傷，改善心肌formazan含量，降低心肌梗死面積，降低心肌冠脈流出液中LDH的含量。

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