邵建業(yè)，孫林，趙巍，王斌

（1.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266071；2.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266071）

自噬與癌癥、神經(jīng)退行性疾病、各種人類發(fā)育過程有關(guān)，相關(guān)的自噬研究在過去十幾年中顯著增加[1]。在真菌中，cAMP信號通路參與多種生物學(xué)過程，并且已被證明對免疫抑制的侵襲性曲霉病鼠科動物模型的毒力至關(guān)重要。cAMP途徑的主調(diào)控因子PKA是真核生物中重要的應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)劑[2]。PKA為異四聚體，是細胞中調(diào)節(jié)生長、代謝、增殖的一個重要的信號分子。當(dāng)cAMP與調(diào)節(jié)亞基結(jié)合時，發(fā)生構(gòu)象變化，釋放催化亞基使其自磷酸化并磷酸化下游靶標(biāo)。當(dāng)cAMP結(jié)合調(diào)節(jié)亞基時，會發(fā)生構(gòu)象變化，其釋放催化亞基自動磷酸化下游目標(biāo)[3]。PKA信號通路參與了煙曲霉的生長、孢子的形成過程以及影響煙曲霉的毒力，但其對曲霉菌自噬的影響并不明確。

為研究煙曲霉中PKA與其自噬水平的關(guān)系，本實驗采用ΔPkaR突變株和WT株，從孢子的存活率、菌絲營養(yǎng)獲取能力、自噬小體的形態(tài)以及自噬相關(guān)的基因表達來反應(yīng)自噬水平，驗證煙曲霉中的自噬是否受PKA通路的調(diào)控，為絲狀真菌中的自噬機制提供新的實驗證據(jù)[4]，爭取為預(yù)防和治療IA提供一個新的靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

煙曲霉（A.fumigatus）野生菌株（簡稱WT）為美國辛辛納提大學(xué)病理和實驗醫(yī)學(xué)系Judith C Rhodes教授惠贈，PKA調(diào)節(jié)亞基突變株（簡稱ΔPkaR）為本實驗室構(gòu)建，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。

1.1.2 培養(yǎng)基

AMM液體培養(yǎng)基、AMM固體培養(yǎng)基、YG液體培養(yǎng)基、YG固體培養(yǎng)基、WA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 營養(yǎng)缺乏時營養(yǎng)吸收能力的檢測

（1）收取AMM培養(yǎng)基上新鮮的孢子；（2）在4℃、4500r/min條件下離心5min，再用無菌蒸餾水清洗兩次，然后重懸于無菌蒸餾水中；（3）顯微計數(shù)，稀釋孢子濃度至1×104個/mL，用移液槍吸取孢子懸浮液，用三角玻璃棒均勻涂布于平板上；（4）在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h，然后使用吸管從平板上取單個菌，移到WA平板的中心排布；（5）在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4～5天，孵育24h時，開始測量菌落直徑。

1.2.2 Real-time PCR法檢測自噬相關(guān)基因的表達

將WT和ΔPkaR菌株的孢子以1.0×107個/mL濃度分別接種于AMM液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)8.5～9h，然后轉(zhuǎn)移到1.5mLEP管中離心棄上清，將菌體沉淀用滅菌過的濾紙進行進一步干燥處理。采用液氮研磨法破碎菌體后加Trizol提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板擴增。Real-time PCR反應(yīng)體系見表1，反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性1min；95℃、15s，56℃、15s，72℃、1min，共40個循環(huán)。擴增反應(yīng)完成后，應(yīng)用軟件設(shè)定閾值，使其處于擴增的指數(shù)增長期，并確定閾值循環(huán)數(shù)（Ct），計算Δ Ct（實驗組內(nèi)參照、目的基因的Ct值減去對照組內(nèi)參照、目的基因的Ct值）和ΔΔ Ct（目的基因的Δ Ct值減去內(nèi)參照基因的Δ Ct值），根據(jù)2-ΔΔCt計算實驗組目的基因相對于對照組目的基因變化的倍數(shù)。擴增引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表2，內(nèi)參為GAPDH。

表1 Real-time PCR反應(yīng)體系

表2 實驗所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 PkaR敲除對煙曲霉菌絲的覓食能力的影響

將已培養(yǎng)24h的WT和ΔPkaR菌的單菌落轉(zhuǎn)移到Y(jié)G和缺乏營養(yǎng)的WA培養(yǎng)基上，24h測一次菌落直徑，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，WT 72h長滿了整個平板，菌落直徑6.5cm，ΔPkaR 120h達到最大直徑4.2cm，表明PkaR的敲除影響了頂端菌絲的延伸，抑制了菌絲的伸長。轉(zhuǎn)移到WA培養(yǎng)基上的菌株，WT菌絲生長速度減緩，168 h達到最大直徑，但ΔPkaR72 h時停止生長，菌落直徑1.5cm，WA培養(yǎng)基上缺乏營養(yǎng)，饑餓可以誘導(dǎo)自噬，表明自噬對煙曲霉菌絲的延伸沒有影響。

圖1 YG和WA培養(yǎng)基上菌落的變化

2.2 PkaR敲除對煙曲霉Atg1的mRNA水平的影響

對AMM培養(yǎng)基中培養(yǎng)了一段時間后的WT和ΔPkaR菌株提取RNA，進行Real-time PCR定量分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，與WT組相比，ΔPkaR組Atg1的mRNA水平顯著上升，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，PkaR敲除后能增加Atg1的mRNA水平，PkaR可能抑制細胞自噬。

圖2 PkaR敲除對煙曲霉Atg1的mRNA水平的影響

2.3 PkaR敲除對煙曲霉Atg8的mRNA水平的影響

對AMM培養(yǎng)基中培養(yǎng)了一段時間后的WT和ΔPkaR菌株提取RNA，進行Real-time PCR定量分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，與WT組相比，ΔPkaR組Atg8的mRNA水平顯著上升，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，PkaR敲除后能增加Atg8的mRNA水平，PkaR可能抑制細胞自噬。

圖3 PkaR敲除對煙曲霉煙曲霉Atg1的mRNA水平的影響。

2.4 PkaR敲除對煙曲霉Atg11的mRNA水平的影響

對AMM培養(yǎng)基中培養(yǎng)了一段時間后的WT和ΔPkaR菌株提取RNA，進行Real-time PCR定量分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，與WT組相比，ΔPkaR組Atg11的mRNA水平顯著上升，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，PkaR敲除后能增加Atg11的mRNA水平，PkaR可能抑制細胞自噬。

圖4 PkaR敲除對煙曲霉Atg11的mRNA水平的影響

3 結(jié)論

（1）PKA調(diào)節(jié)亞基促進煙曲霉的自噬的發(fā)生。（2）PKA調(diào)節(jié)亞基可能是通過促進Afatg1、Afatg8和Afatg11的表達來提高煙曲霉的自噬水平。

煙曲霉是免疫缺陷宿主的重要致病性真菌病原體，普遍存在于人們周邊，其孢子極小，漂浮于空氣中，可隨呼吸進入肺中[5]。在水分和足夠的營養(yǎng)物質(zhì)的存在下，如在哺乳動物肺中，休眠的分生孢子破壞代謝和細胞周期的休眠。經(jīng)過一段時間的核分裂和各向同性生長（膨脹）后，每個分生孢子建立一個極軸，然后發(fā)展成侵入性菌絲，引起侵染性曲霉病[6]。因此，分生孢子萌發(fā)代表了煙曲霉生命周期中的關(guān)鍵過程，并且是吸入后，成為侵入性曲霉菌病發(fā)展中的第一個關(guān)鍵步驟。免疫功能健全的人，吸入的孢子會被自身免疫清除；而對免疫受損的個體，吸入的孢子則會引起侵染性曲霉病或過敏反應(yīng)，危及生命[7]。

煙曲霉基因測序完成后，發(fā)現(xiàn)了大量未知功能的基因堿基序列。RNA干擾、基因敲除等基因功能的研究技術(shù)和方法，開始被應(yīng)用于研究未知功能的基因，來試圖找到煙曲霉的關(guān)鍵毒力因子[8]。而自噬是一種通常由饑餓應(yīng)激觸發(fā)的細胞存活反應(yīng)，在真菌中，自噬的報道相對較少，但真菌的滲透性，菌絲體的生長發(fā)育和它們能侵入不均勻、營養(yǎng)缺乏的物質(zhì)的非凡能力，有力地表明自噬可能是真菌生活方式的基礎(chǔ)。

本實驗證明，自噬的發(fā)生對煙曲霉分生孢子的存活率以及菌絲的生長有影響，但對其侵染性的作用未知。自噬通常被認為是促生存的過程，它對于細胞在細胞外環(huán)境中應(yīng)對營養(yǎng)不足至關(guān)重要[9]。因此，當(dāng)營養(yǎng)供應(yīng)不足以滿足細胞能量需求，或者當(dāng)細胞暴露于不同形式的應(yīng)激時，自噬就會上調(diào)。在這些條件下，一些研究表明自噬作用可以保護細胞免受各種真核生物的死亡。然而，自噬也被證明是細胞死亡的一個促成因素，是真核生物中存在一種非凋亡性程序性細胞死亡途徑，這種途徑取決于自噬基因[10]。在大多數(shù)情況下，這些自噬的雙重作用可能取決于當(dāng)時的細胞外環(huán)境條件。已經(jīng)了解TOR激酶在感染相關(guān)自噬的啟動中和PKA信號潛在的相互作用，對其附著胞形態(tài)發(fā)生是必需的，因此，在煙曲霉中了解TOR激酶和PKA信號的潛在聯(lián)系，以及煙曲霉自噬的基因組分析，對于了解煙曲霉感染至關(guān)重要[11]。如果能驗證自噬在煙曲霉侵染過程中的重要性，控制煙曲霉自噬的發(fā)生，可能成為開發(fā)新型抗真菌藥物提供新的靶標(biāo)。

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