白　茹，孫志紅，位　杰

(1.石河子大學 農(nóng)學院，新疆 石河子 832003； 2.新疆生產(chǎn)建設兵團特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用重點實驗室，新疆 石河子 832000； 3.新疆兵團第二師農(nóng)業(yè)科學所，新疆 庫爾勒 841000)

溫度是影響植物生長發(fā)育的重要生態(tài)因子，低溫是植物常遇到的一種逆境，不僅影響植物的生長發(fā)育，嚴重時可導致植物死亡。庫爾勒香梨作為新疆傳統(tǒng)的地方果樹品種，栽培歷史悠久，是當?shù)毓r(nóng)重要的經(jīng)濟收入來源之一。但是，2000年以來，低溫凍害造成許多香梨樹大面積死亡，給廣大果農(nóng)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1]，保障香梨安全越冬成為目前栽培管理的重要任務之一。因此，研究庫爾勒香梨越冬期的生理生化特征變化具有重要的理論和實踐價值。

植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、保護酶、相對電導率及丙二醛等與植物抵御凍害的能力密切相關[2-3]。植物在越冬過程中生理指標會出現(xiàn)不同的變化。趙樹亮[4]研究發(fā)現(xiàn)，越橘在自然越冬過程中，可溶性糖含量積累主要發(fā)生在越冬前期，脯氨酸含量最大值出現(xiàn)在溫度回升初期。何西風[5]在花椒的自然越冬抗寒性研究中發(fā)現(xiàn)，脯氨酸對抗寒性的提高有滯后性。自然條件下庫爾勒香梨經(jīng)歷由秋季到冬季的寒冷適應后進入休眠狀態(tài)，在此過程中，枝條在生理上如何適應這樣的低溫變化，香梨在何時最容易受到凍害威脅，是需要關注的主要問題。鑒于此，針對庫爾勒香梨枝條的細胞膜透性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性等生理指標在秋冬季的變化，研究香梨在自然降溫過程中的生理特點，探明庫爾勒香梨枝條對低溫變化的生理適應性，并利用隸屬函數(shù)法對庫爾勒香梨不同月份抵御凍害的能力進行評價，旨在為香梨凍害機制研究和香梨安全越冬管理提供科學依據(jù)和指導。

1　材料和方法

1.1　材料

選擇庫爾勒地區(qū)生長勢均衡的30株初果期的庫爾勒香梨樹，于2015年11月1日到2016年3月1日期間，每隔15 d采樣 1 次，每次采集120個枝條，保留枝條中部4節(jié)。采樣時，隨機從樹體外圍東、南、西、北4個方向，選取無病蟲害、充分成熟、粗度 0.5 cm 左右的1年生枝條，立即蠟封剪口，帶回實驗室用于生理指標的測定。在采樣期間利用高低溫度計測定和記錄采樣地每日最高、最低氣溫，并計算出半月平均最高、最低氣溫。

1.2　方法

1.2.1生理指標的測定參照撒俊逸等[6]的方法測定相對電導率；參考孫群等[7]的方法測定可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，參考Bai等[8]的方法測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性；采用硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛(MDA)含量[9]，每個指標測定均重復3次。

1.2.2枝條抵御凍害能力的綜合評價采用隸屬函數(shù)值法[10]對庫爾勒香梨越冬期不同月份枝條抵御凍害的能力進行評價。對各項指標測定值采用模糊數(shù)學隸屬度公式進行轉(zhuǎn)換，對所測的生理指標用下式求出各個時期被測指標的隸屬度。

(1)與抗寒性呈正相關的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、保護酶活性按以下公式計算：

U(Xi)=(Xi-Xi min)/(Xi max-Xi min)，Δ=1/n∑U(Xi)

(2)與抗寒性呈負相關的相對電導率、丙二醛含量按以下公式計算：

U(Xi)=1-(Xi-Xi min)/(Xi max-Xi min)，Δ=1/n∑U(Xi)

其中，n為測定的指標總數(shù)；Ui為第i個測定指標；U(Xi)∈[0，1]；Δ為不同采樣期各項指標測定的綜合評定結(jié)果。Xi max、Xi min為不同采樣期第i項指標的最大值和最小值。

1.3　數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　采樣地環(huán)境溫度變化

采樣地2015年11月1日到2016年3月1日半月平均最低、最高溫度見表1。由表1可以看出，采樣地溫度從2015年11月1日開始逐漸降低，到2016年2月1日溫度降到最低，半月平均最低溫度為-14.75 ℃，之后溫度開始逐漸上升。

表1　采樣地采樣期間半月平均溫度　℃

2.2　越冬期庫爾勒香梨枝條相對電導率的變化

由圖1可以看出，從11月到翌年3月，自然越冬香梨枝條的相對電導率由38.93%上升到最高點55.82%(2月1日)，之后，隨著溫度的回升，電解質(zhì)滲出率開始降低，相對電導率下降。

不同小寫字母表示不同采樣時間間差異顯著(P<0.05)，下同圖1　越冬過程中庫爾勒香梨枝條相對電導率的變化

2.3　越冬期庫爾勒香梨枝條MDA含量的變化

由圖2所示，從11月至翌年3月，香梨枝條的MDA含量總體呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，11月初到 12月底上升緩慢，翌年1月后隨著溫度的極劇下降，MDA含量上升幅度加大，最寒冷的2月初，其含量較越冬初期的11月上升了52.93%。

圖2　越冬過程中庫爾勒香梨枝條MDA含量的變化

2.4　越冬期庫爾勒香梨枝條滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

從圖3可以看出， 2015年11月1日至2015年12月15日，越冬期香梨枝條可溶性糖含量隨著氣溫的降低而升高，之后的12月15日到翌年1月1日，隨著溫度的下降，可溶性糖含量雖然出現(xiàn)了下降，但較越冬初期，其含量仍高于越冬初期0.15%，之后隨著溫度的降低其含量又開始上升，在2月15日含量達到最大，為1.2%。在整個越冬期間，香梨枝條可溶性蛋白含量總體呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢，在2016年溫度最低的1月1日到2月1日，可溶性蛋白含量降到了整個越冬期最低，達到0.48 μg/g左右，與其他時期差異顯著，越冬后期，可溶性蛋白含量出現(xiàn)增加，到3月1日含量達到最高，為0.77 μg/g，與越冬初期(2015年11月1日)差異顯著。在整個越冬期，香梨枝條脯氨酸含量的變化趨勢是先升高后降低。從2015年11月1日開始香梨枝條脯氨酸含量隨著外界環(huán)境溫度的降低而漸漸升高，到12月1日，達到全年最高28.04 μg/g；之后，隨著環(huán)境溫度的降低，脯氨酸含量開始降低，2016年2月15日，含量最低到14.04 μg/g，雖然之后又出現(xiàn)了小幅上升，但含量仍低于越冬初期。

圖3　越冬過程中庫爾勒香梨枝條可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的變化

2.5　越冬過程中庫爾勒香梨枝條保護酶活性的變化

由圖4可以看出，在越冬期，香梨枝條SOD活性變化趨勢是先升高后降低。從2015年11月1日開始香梨枝條SOD活性隨著外界環(huán)境溫度的降低而漸漸升高，到12月1日，達到全年最高(392.32 U/g)；之后，隨著環(huán)境溫度的降低，SOD活性開始下降，到2016年3月1日，含量降到全年最低(86.6 U/g)。越冬期，香梨枝條POD活性呈現(xiàn)不規(guī)律小幅上升或下降趨勢，雖然在溫度最低的1月和2月，其活性最低，但與其他時期相比，差異并不顯著。在越冬期，香梨枝條CAT活性變化趨勢是先升高后降低。2015年11月1日至12月1日，香梨枝條CAT活性隨著外界環(huán)境溫度的降低而漸漸升高，12月1日達到全年最高[4.58 μmol/(g·min)]；之后，隨著環(huán)境溫度的降低，CAT活性開始下降，到2016年2月15日，含量降到全年最低[2.46 μmol/(g·min)]。

圖4　越冬過程中庫爾勒香梨枝條SOD、POD、CAT活性的變化

2.6　越冬期庫爾勒香梨不同月份枝條抵御凍害的能力評價

由表2可知，庫爾勒香梨在自然越冬期，不同時期枝條抵御凍害的能力有很大的差異。在氣溫開始下降的11月到12月，平均隸屬度出現(xiàn)上升，枝條抵御凍害的能力開始加強，12月15日達到最大，為0.800 7。之后的1月到2月中旬隨著氣溫的急劇下降，香梨生理指標平均隸屬度也開始下降，2月1日達到最小，為0.205 5，枝條抵御凍害的能力降到最低。之后隨著氣溫的回升，平均隸屬度開始上升，枝條開始逐漸恢復對凍害的抵御能力。

表2　庫爾勒香梨各生理指標的隸屬度及枝條抵御凍害能力的綜合評定

3　結(jié)論與討論

3.1　自然越冬過程中庫爾勒香梨抗寒性生理指標的動態(tài)變化

用電解質(zhì)滲出率反映植物在低溫脅迫下細胞膜透性的變化是鑒定植物抗寒性較直觀的辦法，已經(jīng)被廣泛應用[11]。果樹在低溫逆境中過多的活性氧易誘發(fā)膜脂過氧化，引發(fā)過氧化產(chǎn)物如MDA等的大量積累，因而MDA的產(chǎn)生量亦成為了鑒別逆境傷害的指標之一[12]，通過測定MDA含量的變化能夠反映植物細胞發(fā)生膜脂過氧化的劇烈程度和植物對逆境條件反應的強弱[13]。本研究結(jié)果表明，自然越冬過程中，隨著氣溫的降低，香梨枝條電解質(zhì)滲出率和MDA含量逐漸增加，表明外界氣溫越低，細胞膜透性程度越高，枝條所受的傷害越重，這與撒俊逸等[6]的研究結(jié)果一致。

低溫會增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，提高細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度，降低水勢，從而保持植物的正常生長[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在越冬初期，隨著外界環(huán)境溫度的降低，香梨枝條可溶性糖和脯氨酸含量逐漸升高，之后隨著氣溫的急劇下降，二者的含量出現(xiàn)了降低，但均比越冬初期高，在越冬后期，氣溫回升，二者的含量又開始升高，由此可以看出，雖然香梨枝條在越冬期細胞膜受到了低溫的傷害，但自身可以通過可溶性糖和脯氨酸的積累來降低冰點，增強細胞的保水能力，并對細胞膜起保護作用，避免了枝條死亡。

有關研究表明，植物在抗冷過程中形成了大量新的蛋白質(zhì)，直接參與植物的抗寒過程，尤其是可溶性蛋白與抗寒性的關系更為密切[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在越冬期開始時，香梨枝條可溶性蛋白含量很高，說明越冬前香梨枝條已積累了大量的蛋白質(zhì)來抵御寒冷脅迫。隨著外界氣溫的下降，可溶性蛋白含量比越冬初期降低，在溫度最低的月份，其含量降到了整個越冬期最低，可能是因為香梨枝條可溶性蛋白累積速率小于分解速率，導致在溫度降低時可溶性蛋白含量逐漸下降。

在生物進化過程中，細胞形成了SOD、POD、CAT等清除自由基和活性氧的保護系統(tǒng)，它們在植物體內(nèi)協(xié)同發(fā)揮作用，清除過多的自由基，使生物自由基維持在一個較低的水平，從而防止自由基的毒害，以保護細胞膜不受到傷害。這些保護酶系統(tǒng)雖不能直接判斷植物的抗寒性強弱，但都與抗寒性有密切的關系[16-17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，越冬期香梨枝條SOD、POD、CAT活性隨著氣溫的降低變化相似，較強冷空氣來襲前都出現(xiàn)了大量的積累，之后隨著氣溫的繼續(xù)下降，其活性開始降低，這可能是由于溫度的降低加重了細胞膜的受害程度，高濃度的自由基導致了酶蛋白分子的破壞，從而降低了其活性[18]。

2015年11月到2016年3月的自然降溫過程中，香梨枝條相對電導率和MDA含量隨著天氣的變冷而升高，它們在一定程度上反映了枝條細胞膜系統(tǒng)的受損害程度。在氣溫下降到-10 ℃以下之前(1月1日前)，枝條的相對電導率和MDA含量上升緩慢，這可能是由于在較強冷空氣來襲前的這段時間，香梨枝條的可溶性糖、脯氨酸SOD、POD、CAT出現(xiàn)了大量積累，可溶性蛋白在越冬前大量積累，從而降低了細胞膜系統(tǒng)的受損程度。然而，1月1日之后，外界氣溫快速下降，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和保護酶活性開始降低，致使枝條的相對電導率和MDA含量開始迅速上升。在整個越冬期，3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、3種保護酶之間通過相互協(xié)調(diào)配合，保持了細胞的滲透平衡，并通過調(diào)整各自的含量和活性的變化來適應低溫變化，從而保護香梨枝條安全越冬。

3.2　越冬期庫爾勒香梨不同月份枝條抵御凍害能力的綜合評價

隸屬函數(shù)法在植物抗寒性評價中是較為常用的一種綜合評價方法[19-20]，可以在多個指標測定的基礎上，對植物的抗寒性進行較為綜合和全面的評價，評價的結(jié)果較為科學、可靠。因此，本研究通過分析越冬期香梨枝條中抗寒性相關生理指標的變化，利用隸屬函數(shù)法對不同月份香梨枝條抵御凍害的能力進行綜合評價，結(jié)果表明：香梨枝條抵御凍害的能力在自然越冬過程中出現(xiàn)了動態(tài)的變化，在全年氣溫最低的2 月，香梨枝條各生理指標的平均隸屬度最小，此時香梨枝條抵御凍害的能力最弱，這與撒俊逸等[6]分析的2014—2015年越冬期香梨枝條抵御凍害的能力結(jié)論一致。

綜上，在自然越冬期間，氣溫降低導致的細胞膜破壞是香梨枝條受傷的重要原因之一，而可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量及SOD、POD、CAT活性的動態(tài)變化在一定程度上可以降低細胞膜系統(tǒng)的受損程度。運用隸屬函數(shù)法綜合評價香梨不同月份枝條抵御凍害的能力，結(jié)果顯示，在整個越冬過程中，全年氣溫最低的2月香梨枝條抵御凍害的能力最弱，因此，應重點在此期間積極采取防寒措施，防止降溫給香梨帶來凍害。