李艷敏，王利民，董曉宇，師　曼，張　晶，蔣　卉，王慧娟，高　杰，張和臣

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

紅葉櫻花(Prunusserrulata‘Royal burgundy’)屬薔薇科李屬紅葉落葉喬木，葉片紅色，花玫瑰色重瓣，集觀花、觀葉于一身，是風(fēng)景園林、城市綠化的名貴觀賞彩葉樹種。關(guān)于櫻花的組織培養(yǎng)研究比較多[1-8]，王永清等[1]、冷天波等[2]、及華[3]的研究結(jié)論差異較大，可能與外植體取材時(shí)間相關(guān)。李艷敏等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在生長季節(jié)采集紅葉櫻花外植體，萌發(fā)生長良好;在休眠季節(jié)采集的外植體能萌發(fā)，但是萌發(fā)后生長緩慢，生長勢不如生長季節(jié)外植體好，組培苗的生長與外植體的取材時(shí)期、腋芽休眠和萌發(fā)狀態(tài)密切相關(guān)。

木本植物為抵御寒冷侵襲，大多需要經(jīng)過休眠才能在春季萌發(fā)成芽。植物抵御寒冷，進(jìn)入休眠以及隨后解除休眠進(jìn)入生長發(fā)育狀態(tài)，與內(nèi)源物質(zhì)含量變化及其調(diào)節(jié)機(jī)制密切相關(guān)。其中，最主要相關(guān)的是可溶性糖、可溶性蛋白和植物激素?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍资侵参锷L的物質(zhì)基礎(chǔ)，秋冬季節(jié)芽休眠時(shí)可以提高其抗寒性，春季芽萌發(fā)時(shí)為其生長提供能量[9-10]；在秋冬季休眠的主要低溫期，木本植物的可溶性蛋白及可溶性糖含量均隨溫度降低呈遞增趨勢，品種抗寒性越強(qiáng)可溶性蛋白及可溶性糖含量越高[10]。通過低溫處理，花芽可溶性糖和可溶性蛋白的含量急速增加，有利于促進(jìn)休眠誘發(fā)花芽的分化[11]?？扇苄缘鞍椎挠H水膠體性質(zhì)強(qiáng)，秋冬休眠時(shí)期，通過束縛更多的水分顯著增強(qiáng)細(xì)胞的持水力，降低細(xì)胞結(jié)冰溫度，減少原生質(zhì)因寒冷帶來的傷害[9]，解除休眠后消耗可溶性蛋白促進(jìn)各類生理代謝的酶、蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)合成。植物激素在低溫脅迫、休眠和解除休眠的過程中也起到非常重要的作用，內(nèi)源激素赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)參與植物的休眠解除過程，GA3是最為重要的促進(jìn)休眠解除激素，而ABA則是休眠解除的主要拮抗物，GA3含量和GA3/ABA比值可以作為打破休眠的信號指標(biāo)[11]。通常認(rèn)為，細(xì)胞分裂素(ZA)和吲哚乙酸(IAA)是促進(jìn)生長的激素，二者之間存在拮抗作用，共同調(diào)控細(xì)胞的分化，細(xì)胞分裂素與生長素的濃度比值高，可誘導(dǎo)芽形成，解除頂端對腋芽的抑制(即解除頂端優(yōu)勢)，反之則有利于誘導(dǎo)頂端生長優(yōu)勢[12]。因此，可溶性糖、可溶性蛋白及內(nèi)源激素(主要包括ABA、GA3、IAA和ZA等)含量和比例對木本植物腋芽的休眠、解除休眠、萌發(fā)等生理生化過程具有重要的作用。在2016年1—5月進(jìn)行了紅葉櫻花外植體取材時(shí)期的研究，通過各時(shí)期生理指標(biāo)及其含量的測定，包括可溶性糖、可溶性蛋白、內(nèi)源激素等，分析各內(nèi)源物質(zhì)含量變化規(guī)律，結(jié)合外植體組織培養(yǎng)萌發(fā)結(jié)果，探尋紅葉櫻花腋芽萌芽差異的內(nèi)源因素，為研究紅葉櫻花外植體在不同采集時(shí)期生理生化差異及其產(chǎn)生原因，確定紅葉櫻花外植體最佳采集時(shí)期提供理論依據(jù)，為其他木本植物外植體的采集提供參考。

1　材料和方法

試驗(yàn)于2016年1—5月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地(原陽)進(jìn)行。

1.1　材料

紅葉櫻花為5年生樹苗，種植在原陽基地。選取3株生長健壯一致的植株并標(biāo)記，每月中旬從這3株植株上剪取直徑≤0.2 cm的枝條作為外植體，進(jìn)行不同采集時(shí)期外植體萌芽研究。

1.2　方法

1.2.1外植體采集時(shí)期對紅葉櫻花腋芽萌芽的影響分別于1月19日、2月17日、3月15日、4月20日和5月18日剪取紅葉櫻花枝條，拿至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消毒預(yù)處理，先用流水沖洗30 min，然后用軟毛刷在肥皂水里輕輕洗枝條，最后流水沖洗30 min。將初步消毒后的枝條送至超凈工作臺，剪成長1.5～2 cm、帶1～2個腋芽的莖段，放進(jìn)無菌空瓶里，用75%乙醇滅菌30 s，再用0.1%HgCl2滅菌10 min，最后用無菌水沖洗4～5遍。

1—3月的紅葉櫻花枝條為1年生枝條，木質(zhì)化程度高，腋芽外邊包裹著鱗片，外植體滅菌后，存在污染率高的問題，因此，對這個時(shí)期的外植體采用滅菌后剝?nèi)パ客獠亏[片的方法接種。4—5月的紅葉櫻花枝條為當(dāng)年萌發(fā)新枝條，枝條光滑幼嫩未木質(zhì)化，采用帶腋芽莖段進(jìn)行接種。接種后30 d統(tǒng)計(jì)外植體的萌芽率和污染死亡率。污染死亡率=污染死亡個數(shù)/接入數(shù)×100%；萌芽率=萌芽數(shù)/(接入數(shù)-污染死亡數(shù))×100%。

1.2.2不同采集時(shí)期紅葉櫻花外植體內(nèi)源物質(zhì)含量的測定在采集紅葉櫻花外植體進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)的同時(shí)，隨機(jī)取帶芽枝條進(jìn)行外植體的可溶性糖、可溶性蛋白和內(nèi)源激素含量測定。將腋芽從枝條上切下后，混合然后稱質(zhì)量，每份0.5 g，各指標(biāo)均重復(fù)3次，迅速用液氮速凍，然后-80 ℃超低溫冰箱保存?？扇苄蕴呛坎捎幂焱y定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定，具體方法步驟參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[13]，內(nèi)源激素含量的測定采用高效液相色譜方法，由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司代測。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS V6.55軟件進(jìn)行差異顯著性(P<0.05)分析，用Excel軟件作圖。

1.3　啟動培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

外植體啟動培養(yǎng)基為MS，附加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.01 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂6g/L，pH值 5.8。培養(yǎng)條件為(25±2)℃，光照強(qiáng)度2 500 lx，光照時(shí)間12 h/d。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同采集時(shí)期對紅葉櫻花腋芽萌芽的影響

不同采集時(shí)期，枝條上腋芽的形狀、生理狀態(tài)不同，1月中旬到3月中旬采集的為1年生枝條上的腋芽，個體大，飽滿，長橢圓形，外邊包裹著多層鱗片；4月中旬和5月中旬，為當(dāng)年新萌幼嫩枝條上的腋芽，個體小，三角形，外邊光滑。分別以這2種枝條上的腋芽為外植體，其滅菌后的污染死亡率、萌芽率都不相同(表1)。從萌芽率來看，5個采集時(shí)期的萌芽率差異顯著，其中以4月萌芽率最高，為100.0%，顯著高于其他4個采集時(shí)期的萌芽率，其次是5月和3月萌芽率分別為78.3%和76.0%，二者差異不顯著，從污染死亡率來看，以1月和5月采集的外植體污染死亡率最低，分別為6.5%和4.6%，顯著低于其他3個采集時(shí)期，1月份的氣溫低，微生物較少，隨著氣溫回升，雜菌逐漸增多，因此污染率較高；4月份由于采集剛萌發(fā)的枝條，鱗芽幼嫩，滅菌后外植體容易出現(xiàn)變褐死亡現(xiàn)象，污染死亡率也高。綜合而言，采集當(dāng)年新萌發(fā)枝條上的腋芽，其萌芽率均高于1年生枝條上腋芽的萌芽率，說明4—5月為紅葉櫻花外植體適宜的采集時(shí)期，4月中旬采集外植體，可以獲得最高的萌芽率。

表1　不同采集時(shí)期對紅葉櫻花外植體萌芽的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2　不同采集時(shí)期對紅葉櫻花外植體可溶性糖含量的影響

紅葉櫻花外植體中可溶性糖含量變化見圖1，1月中旬至5月中旬，紅葉櫻花外植體的可溶性糖含量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢。1月中旬外植體仍處于休眠期，其體內(nèi)可溶性糖含量最高，這與植物的抗性相關(guān)，低溫下，鱗芽內(nèi)可溶性糖含量增加可以增加細(xì)胞的滲透壓，從而降低冰點(diǎn)，提高抗寒性；1月中旬到2月中旬，可溶性糖含量略微減少，處于休眠期的鱗芽各項(xiàng)生命代謝活動緩慢，對能量的需求較少；2月中旬之后，鱗芽內(nèi)可溶性糖含量迅速下降，此時(shí)氣溫回升，日照延長，鱗芽休眠解除，代謝活動逐漸增強(qiáng)，對糖類消耗增加；4月中旬，新萌發(fā)枝條處于旺盛生長期，對碳水化合物的需求大，此時(shí)可溶性糖含量最低；此后隨著植株的生長，合成的有機(jī)物質(zhì)多于消耗，外植體內(nèi)的可溶性糖含量增加。

圖1　不同采集時(shí)期紅葉櫻花外植體可溶性糖含量變化

2.3　不同采集時(shí)期對紅葉櫻花外植體可溶性蛋白含量的影響

外植體的采集時(shí)期不同，其可溶性蛋白含量也不相同，從圖2可以看出，1月中旬到5月中旬，紅葉櫻花外植體的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。在1月份可溶性蛋白含量較高，可溶性蛋白可以增加細(xì)胞的持水力，增加植株的抗寒性；此后隨著氣溫開始回升，樹液開始流動，鱗芽休眠逐漸打破，可溶性蛋白含量開始降低；2月中旬到3月中旬，可溶性蛋白含量保持穩(wěn)定；3月中旬之后鱗芽萌發(fā)，抽出新枝，生命活動更加活躍，各種酶活性增強(qiáng)，鱗芽體內(nèi)的可溶性蛋白含量上升。此外，植物體內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖含量變化是植物解除休眠開始萌發(fā)的重要信號，在3月中旬氣溫回暖，腋芽萌動的情況下，可溶性蛋白含量率先開始升高，而可溶性糖含量在4月中旬開始升高，說明腋芽主要完成了蛋白質(zhì)、酶、脂類等物質(zhì)的積累，為萌發(fā)相關(guān)代謝基因誘導(dǎo)、生理生化反應(yīng)提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2　不同采集時(shí)期紅葉櫻花外植體可溶性蛋白含量變化

2.4　不同采集時(shí)期對紅葉櫻花外植體內(nèi)源激素含量的影響

隨著紅葉櫻花外植體采集時(shí)期的不同，植物內(nèi)源激素ZA、IAA、GA3和ABA含量也有明顯的變化(圖3)。ZA含量總體呈現(xiàn)上升趨勢，其中在1—4月外植體ZA含量差異不顯著，5月外植體中ZA含量顯著高于其他4個處理。1月中旬到3月中旬，外植體中ZA含量基本上在39.07 ng/g左右；到4月中旬，ZA含量降至28.98 ng/g后；之后開始急劇上升至137.18 ng/g。3月中旬到4月中旬外植體中ZA含量略微下降，此時(shí)休眠鱗芽開始萌發(fā)，細(xì)胞分裂素的作用是解除芽的休眠并促進(jìn)細(xì)胞分裂，因此含量有所下降，4月之后新梢形成，根尖和嫩梢是其合成的主要部位，外植體中的ZA含量也大幅上升。

圖3　不同采集時(shí)期紅葉櫻花外植體內(nèi)源激素含量變化

IAA含量在整個采集時(shí)期呈現(xiàn)下降趨勢，1—3月外植體中IAA含量差異不顯著，但均顯著高于4月和5月外植體IAA含量。1月采集的外植體IAA含量最高，這可能是植物內(nèi)源激素IAA對低溫的應(yīng)激響應(yīng)，低溫影響IAA極性運(yùn)輸，同時(shí)抑制了IAA氧化酶活性；隨著溫度回升，樹液流動，IAA在植株內(nèi)極性向下運(yùn)輸，鱗芽中IAA含量逐漸下降，3月中旬到 4月中旬鱗芽萌發(fā)形成幼嫩新梢，外植體中IAA含量急劇下降，4月中旬到5月中旬，新梢生長旺盛，IAA合成較多，外植體內(nèi)的IAA含量下降趨勢變緩。

GA3含量在1月中旬到5月中旬呈上升趨勢，在1月中旬和2月中旬的外植體中未檢測出來，從3月中旬的外植體中檢測到少量的GA3，4月到5月新萌枝條生長加快，外植體中的GA3含量大幅增加，其中3月和4月外植體中GA3含量差異不顯著，但均顯著低于5月的GA3含量。

ABA含量在整個采集時(shí)期中變化幅度較小，介于2.37～2.51 ng/g，呈現(xiàn)先緩慢上升然后緩慢下降的趨勢，各處理間差異不顯著。從1月中旬到2月中旬，ABA含量略微上升，2月中旬之后，ABA含量開始下降。ABA往往是IAA、CA3和ZA的拮抗物，它的消長過程大體上和生長進(jìn)程是相反的。

2.5　不同采集時(shí)期紅葉櫻花外植體內(nèi)源激素含量比值的變化

從圖4可以看出，1月中旬到5月中旬，GA3/ABA、ZA/ZAA比值均呈上升趨勢。在1月中旬到2月中旬采集的外植體中，GA3/ABA、ZA/IAA比值均很低，GA3/ABA比值在2月中旬之后開始緩慢上升，ZA/IAA從3月中旬之后緩慢上升，兩組比值在4月中旬開始大幅上升，說明1月中旬和2月中旬采集的外植體，仍處于休眠狀態(tài)；3月中旬采集的鱗芽已經(jīng)開始萌動，GA3/ABA比值雖然已經(jīng)開始上升，但是ZA/IAA比值仍舊很低；4月中旬之后采集的外植體，GA3/ABA和ZA/IAA均明顯提高，此時(shí)外植體接種后萌芽率也最高。

圖4　不同采集時(shí)期紅葉櫻花外植體內(nèi)源激素含量比值變化

3　結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)中，外植體的萌發(fā)受年齡、生理狀態(tài)、采集時(shí)期等多種因素影響，一般具有生長點(diǎn)且處于萌動狀態(tài)的幼嫩外植體容易誘導(dǎo)萌芽，處于旺盛生命活動的外植體萌芽率高，多數(shù)木本植物選擇春季采集新萌發(fā)枝條作為外植體[14]，也有一些木本植物會避開酚類物質(zhì)含量多的時(shí)期，避免褐化傷害[15]。1月中旬到3月中旬采集的紅葉櫻花外植體，萌芽率較低，并且外植體萌發(fā)后處于生長停滯狀態(tài)，主要表現(xiàn)為葉片展開小，莖短縮；4—5月采集外植體，萌芽率高，能夠正常展葉抽莖，但5月酚類物質(zhì)含量增加，褐化傷害加重，而4月中旬外植體萌芽率最高，是最適的采集時(shí)期，這與郭文久[16]、胡雪雁等[17]的研究結(jié)論一致。

植物內(nèi)源激素是調(diào)節(jié)芽休眠與萌發(fā)的重要因子，Horvath等[18]認(rèn)為休眠是由內(nèi)源激素中促進(jìn)生長物質(zhì)和抑制物質(zhì)之間的平衡狀態(tài)決定的，ABA和GA3在促進(jìn)植物適應(yīng)低溫脅迫中發(fā)揮重要作用，IAA代謝也是植物抗寒力調(diào)控系統(tǒng)的一部分[19]。低溫脅迫能夠降低植物體內(nèi)IAA氧化酶含量，一般情況下，IAA氧化酶活性越高，IAA含量越少，生長受抑制的程度越高，低溫同時(shí)也抑制IAA的向下運(yùn)輸[19-20]。1—2月中旬紅葉櫻花枝條腋芽的IAA含量降低，2—3月中旬IAA含量升高，表明2月中旬紅葉櫻花開始慢慢解除低溫脅迫，與ABA變化時(shí)期相一致、變化方向相反。ABA是重要的休眠因子，GA3是重要的解除休眠因子[11]。在寒冷來襲，木本植物進(jìn)入休眠時(shí)ABA不斷積累直至解除休眠前達(dá)到最高，GA3在進(jìn)入休眠時(shí)含量逐漸降低，在解除休眠前達(dá)到最低。紅葉櫻花不同時(shí)期的腋芽中內(nèi)源激素ABA和GA3含量呈現(xiàn)不同的變化，其中ABA含量在1—2月中旬緩慢上升后緩慢下降，GA3含量在3月中旬開始提高。表明紅葉櫻花解除休眠從2月中旬開始，ABA含量的降低優(yōu)先于GA3含量的升高，GA3/ABA比值在3月中旬大幅提高，腋芽萌動出幼嫩綠芽，進(jìn)一步表明了ABA、GA3以及GA3/ABA比值在指示紅葉櫻花腋芽萌發(fā)中的重要作用。ZA能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，誘導(dǎo)芽分化，在紅葉櫻花的5個采集時(shí)期中，前3個時(shí)期變化不大，從4月中旬開始增加，整體來看，ZA對外植體萌芽起促進(jìn)作用，這與牡丹打破休眠中的變化規(guī)律一致[11]。

此外，本研究表明，GA3/ABA比值和ZA/IAA比值不僅反應(yīng)出腋芽休眠、萌發(fā)的狀態(tài)，也對紅葉櫻花組培生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)作用。在紅葉櫻花的不同采集時(shí)期中，GA3/ABA比值在1月中旬和2月中旬很低，說明此時(shí)的外植體仍處于休眠狀態(tài)；在3月中旬，GA3/ABA比值開始上升，外植體休眠解除，開始萌動，3月中旬采集的外植體，其萌芽率比1月中旬和2月中旬高，但是外植體萌發(fā)后生長緩慢，能夠展葉但是莖短縮，影響后期的增殖培養(yǎng)；在4月中旬，ZA/IAA比值開始上升，植株處于旺盛生長時(shí)期，新梢形成并伸長生長，此時(shí)取外植體萌芽率最高。

綜合上述，可溶性糖、可溶性蛋白、內(nèi)源激素(IAA、ABA、GA3和ZA)在紅葉櫻花低溫脅迫和休眠、萌發(fā)的過程中都具有重要作用，同時(shí)具有著一定的規(guī)律，1—2月中旬紅葉櫻花處于休眠期；2—3月中旬ABA、IAA和可溶性蛋白含量開始反向變化，慢慢解除休眠，3月中旬解除休眠因子GA3和可溶性糖含量大幅增加，GA3/ABA比值大幅上升；4月ZA/IAA比值開始上升，是影響紅葉櫻花外植體萌發(fā)的重要因素，表明GA3和GA3/ABA比值在指示紅葉櫻花休眠中具有重要作用，ZA和ZA/IAA比值在紅葉櫻花腋芽組培生產(chǎn)中具有重要指導(dǎo)作用。春季新萌枝條適宜作為紅葉櫻花組織培養(yǎng)的外植體，排除酚類物質(zhì)引起的褐化影響，最適的采集時(shí)期是4月中旬。