王　衛(wèi)，熊　緯，孫然然，吉莉莉，張佳敏，白　婷

(1.成都大學(xué) 肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都　610106；2.聞達(dá)食品配料有限公司，山東 大連　116000)

0　引　言

硝酸鹽在肉制品的生產(chǎn)過程中具有發(fā)色、防腐、抑菌等功效，其廉價(jià)、高效和安全性雖通過長(zhǎng)期的研究與應(yīng)用已得到行業(yè)的公認(rèn)，但若不當(dāng)使用或?yàn)E用則可能導(dǎo)致形成硝胺的潛在風(fēng)險(xiǎn)[1].為此，尋找更為安全可靠、經(jīng)濟(jì)適用，能替代硝鹽在肉制品生產(chǎn)中的多種功能添加劑一直受到的科研人員關(guān)注.目前，使用比較多的是芹菜汁粉類產(chǎn)品、天然香辛料和水果提取物及其微生物發(fā)酵產(chǎn)物[2-3].研究發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌廣泛存在于自然界中，是一種常見的食源性致病菌和人畜共患病病原菌，具有極強(qiáng)的生存能力，可在較低溫(低至-0.4℃)、酸性、高鹽的環(huán)境中生長(zhǎng)，其對(duì)低溫肉制品，尤其是不經(jīng)二次殺菌而依賴?yán)滏満蛧?yán)格衛(wèi)生條件來延長(zhǎng)貨架期的即食熟肉制品，極易導(dǎo)致較大的安全性隱患[4-5].相關(guān)研究表明，硝鹽(硝酸鹽和亞硝酸鹽)雖對(duì)單增李斯特菌具有較好的抑制作用，但仍不能完全抑制其生長(zhǎng)和將其殺滅，因此，實(shí)際生產(chǎn)中通常將有機(jī)酸鹽與硝酸鹽結(jié)合來控制并抑制單增李斯特菌的生長(zhǎng)繁殖[6-8].可以說，有關(guān)單增李斯特菌在肉制品中的特性及其有效控制長(zhǎng)期以來一直是肉品安全研究的重點(diǎn)[9]，而挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)也成為驗(yàn)證各種方法對(duì)單增李斯特菌等有害微生物抑制作用的有效手段[10-11].對(duì)此，本研究選擇商業(yè)化的T4NW S、DV和CS天然植物提取物來替代硝鹽在肉制品中的抑菌作用，以低溫雞肉腸為對(duì)象，單增李斯特菌作為靶向抑制菌株，采用經(jīng)典化學(xué)防腐劑組合(1.56 mg/kg亞硝酸鈉+3.5% SD4+5.5 mg/kg異抗壞血酸鈉)與乳酸鏈球菌素Nisin作為比較，通過微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)(MCT)對(duì)其抑菌效能進(jìn)行研究，并進(jìn)一步分析了植物提取物對(duì)產(chǎn)品色澤、pH值、水分含量、aw、質(zhì)構(gòu)等特性的影響，以期為替代硝鹽功效并更為安全的天然植物提取物的應(yīng)用，以及無硝產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1　材　料

1.1.1材料與試劑.

1)肉料及試劑.雞肉，購自四川玉冠農(nóng)業(yè)股份有限公司；TSB(胰酪胨大豆蛋白肉湯)、MOX(改良牛津瓊脂)、BHI(腦心浸出液肉湯)，購自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂、亞硝酸鈉，購自成都金山化工有限公司；乙酸鈉—雙乙酸鈉(SD4)，購自武漢豐竹林化學(xué)科技有限公司.

2)天然抑菌劑.T4NW S、DV和CS，由蘇州聞達(dá)食品有限公司提供，其主要成分為檸檬、甜橙、葡萄柚、石榴提取物，以及發(fā)酵糖粗提物等.

3)供試菌種.單增李斯特菌為4株菌(ATCC 19114、ATCC 19115、ATCC 19116、ATCC 19117)的混合物，由上海慧耘生物科技有限公司提供.

1.1.2儀器與設(shè)備.

實(shí)驗(yàn)所用的儀器與設(shè)備包括：TU-1800型紫外—可見分光光度計(jì)(北京普析儀器公司)；AL-104型精密電子天平(上海梅特勒—托利多儀器設(shè)備有限公司)；300ES-12型半自動(dòng)切片機(jī)(順菱切片機(jī)有限公司)；XW-80A型渦旋振蕩器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；PHS-3C-01型pH計(jì)(上海三信儀表廠)；HC-2518型高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司).

1.2　方　法

1.2.1實(shí)驗(yàn)組設(shè)置.

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的篩選及各商業(yè)化天然植物提取物的推薦使用量，并與傳統(tǒng)經(jīng)典研制與配伍(NaNO2異VC-Na+SD4)、天然微生物發(fā)酵產(chǎn)物(Nisin)進(jìn)行組合搭配設(shè)置的實(shí)驗(yàn)組如表1所示.

表1　實(shí)驗(yàn)組設(shè)置

1.2.2雞肉腸制備.

本實(shí)驗(yàn)用雞肉腸產(chǎn)品配方如表2所示.

表2　雞肉腸產(chǎn)品配方

雞肉腸產(chǎn)品制作工藝與常規(guī)工業(yè)化低溫雞肉腸產(chǎn)品相同，即：原料解凍后切塊，入斬拌機(jī)絞制并加入輔料細(xì)斬為乳化肉糜，灌裝入腸衣后入自動(dòng)蒸煮煙熏箱蒸煮，蒸煮至腸體中心溫度75 ℃，冷卻后產(chǎn)品切片，真空包裝并在4 ℃條件下低溫冷藏.

1.2.3菌株的活化與保藏.

分別將單增李斯特菌(ATCC 19114、ATCC 19115、ATCC 19116及ATCC 19117)菌株的凍干粉于BHI液體培養(yǎng)基中活化(37 ℃，16～18 h)，后轉(zhuǎn)至TSA平板上培養(yǎng)出單菌落(37 ℃，24 h)，并同時(shí)用MOX平板涂布檢測(cè)其純度，挑取TSB平板上生長(zhǎng)的單菌落接種于斜面TSB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h，之后取出置于低溫(4 ℃)條件下保藏備用.

1.2.4接種菌懸液的制備.

實(shí)驗(yàn)時(shí)，將斜面保藏的單增李斯特菌菌株用一定量的0.85%的生理鹽水沖洗，之后各吸取1 mL該菌株的菌懸液配置成混合菌懸液，用渦旋混合器混勻，并計(jì)數(shù).接種時(shí)，經(jīng)梯度稀釋使最終接種菌懸液的濃度調(diào)至約5 lg(CFU/g).

1.2.5接種、包裝及貯藏.

將按“1.2.2”項(xiàng)下方式制得的低溫雞肉腸切片后，立即進(jìn)行定量包裝，25g/包，約4片，然后吸取250 μL菌懸液接種于切片兩面(接觸包裝袋的一面除外)，使最終接種濃度約為2～3 lg(CFU/g)，最后將接種好的樣本抽真空后置于7 ℃冷藏柜中貯藏.每組樣本制備3份，每次每組抽取3個(gè)樣本檢測(cè).

1.2.6指標(biāo)檢測(cè).

1)單增李斯特菌的檢測(cè).將保藏于4 ℃條件下的樣品捏碎，轉(zhuǎn)移至無菌的均質(zhì)袋中，加入225 mL無菌水，用均質(zhì)器拍打5 min，使雞肉腸中的單增李斯特菌充分的洗脫下來.檢測(cè)時(shí)，使用0.85% NaCl和0.1%蛋白胨混合的蛋白胨水進(jìn)行梯度稀釋，選擇合適的稀釋度用移液槍吸取100 μL于MOX選擇性培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻，37 ℃下培養(yǎng)48 h，對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行計(jì)數(shù).

2)水分活度測(cè)定.水分活度測(cè)定參照GB/T 5009.238-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品水分活度的測(cè)定》方法，直接采用水分活度儀測(cè)定.

3)亞硝酸鹽殘留量測(cè)定.亞硝酸鹽殘留量測(cè)定參照GB 5009.33-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》方法，具體步驟為：取5 g勻漿樣品加入12.5 mL飽和硼砂溶液，加入300 mL 、70 ℃水溶解，100 ℃水浴15 min后冷卻至室溫，加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入5 mL乙酸鋅溶液后定容至500 mL，放置30 min后過濾，40 mL濾液于50 mL比色管中加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液，靜置5 min后加入1 mL鹽酸奈乙二胺溶液，加水至刻度，靜置15 min后，于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光值.

4)食鹽含量測(cè)定.食鹽含量測(cè)定參照GB/T 5009.42-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食鹽指標(biāo)的測(cè)定》方法，具體步驟為：稱取25 g樣品溶于500 mL水中，取25 mL濾液定溶于250 mL，再取25 mL混合液加入25 mL水后使用鉻酸鉀指示液進(jìn)行硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定.

5)pH值測(cè)定.pH值測(cè)定方法為，取10 g樣品加入90 mL蒸餾水(pH值為7.0)中，攪拌均勻后靜置，插入電極帶度數(shù)穩(wěn)定后讀取數(shù)值.pH計(jì)電極用4.0和7.0的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行校正.

6)質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定.質(zhì)構(gòu)實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12]的方法，具體步驟為：選取低溫雞肉腸的中部進(jìn)行測(cè)定，將其切割成3 cm高的柱體，以P/36R-圓柱形平底探頭進(jìn)行質(zhì)構(gòu)剖面分析(TPA)，測(cè)試前速率為2 mm/s，測(cè)試速率為1 mm/s，測(cè)試后速率為10 mm/s，壓縮距離為15 mm，啟動(dòng)形式為auto-5 g，數(shù)據(jù)獲取速率為200 pps，每個(gè)處理組樣品測(cè)定3次，記錄測(cè)試結(jié)果.以測(cè)試開始到結(jié)束的力變形曲線上最大峰值力值作為硬度指標(biāo)，二次壓縮和一次壓縮高度之比為彈性指標(biāo).

2　結(jié)果與分析

2.1　天然植物提取物等抑菌劑對(duì)雞肉腸單增李斯特菌的影響

各實(shí)驗(yàn)組單增李斯特菌檢測(cè)結(jié)果見表3.

表3　各實(shí)驗(yàn)組單增李斯特菌生長(zhǎng)菌落數(shù)lg(CFU/g)

數(shù)據(jù)顯示，在前12 d貯藏期內(nèi)，空白對(duì)照組C1中的單增李斯特菌增長(zhǎng)了3.7 lg(CFU/g)，在第26 d達(dá)到8.7 lg(CFU/g)，貯藏期單增李斯特菌生長(zhǎng)繁殖最快，與他添加有植物提取物或抑菌劑的組別呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01).添加“亞硝酸鈉+SD4+異抗壞血酸鈉"的C2組在53 d檢測(cè)期內(nèi)單增李斯特菌的增量至第6周增長(zhǎng)無顯著變化(P>0.05)，至第7周也上升甚微，為各組中抑菌效能最佳組別.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加了1%DV的T1組，在53 d的檢測(cè)期內(nèi)單增李斯特菌的增長(zhǎng)量小于0.5 lg(CFU/g)，顯示出其對(duì)單增李斯特菌具有顯著(P<0.05)的抑菌效果；添加了0.5% CS+0.5% DV的T3組和添加0.6% T4NW S+0.5% CS的T2組，兩者在53 d檢測(cè)期內(nèi)的單增李斯特菌增量分別為2.1 lg和1.3 lg(CFU/g)；而僅添加2 mg/kg Nisin的T4組中，單增李斯特菌在前19 d貯藏期的增長(zhǎng)量為0.9 lg(CFU/g)，在第26 d檢測(cè)時(shí)達(dá)到2.9 lg(CFU/g)，與其余各實(shí)驗(yàn)組比較生長(zhǎng)繁殖較快，呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，僅低于對(duì)照C1組；而在添加有1 mg/kg Nisin+0.5% DV的T5組中，整個(gè)檢測(cè)期內(nèi)(53 d)其單增李斯特菌增長(zhǎng)量為2.1 lg(CFU/g)，相較于T4組雖然減少了Nisin的添加量，但由于加入了DV，不同組合間的協(xié)同效應(yīng)也開始顯現(xiàn)，其效果也遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單純添加1 %DV 的T1組和只添加1 mg/kg Nisin的T4組.總體來看，對(duì)單增李斯特菌抑制效果最好的仍然是傳統(tǒng)的“亞硝酸鈉+SD4+異抗壞血酸鈉"經(jīng)典組合C2組，產(chǎn)品貯藏至第7周仍然只有3.7 lg(CFU/g)，抑菌效果能夠完全替代其作用的是0.6% T4NW S+0.5% CS組合的T2組，其次是1.0% DV的T1組和0.5% CS+0.5% DV的T3組.只添加2 mg/kg Nisin的T4組對(duì)單增李斯特菌的抑制在添加有植物提取物的各組中效果最差，但仍然呈現(xiàn)對(duì)單增李斯特菌較好地抑制效應(yīng).有研究表明，Nisin單獨(dú)使用時(shí),對(duì)單增李斯特菌的最小抑菌濃度為200 μg /mL[13]，但并不是濃度越高抑菌效果越好，在達(dá)到一定濃度后，其效果逐步穩(wěn)定在一定范圍[14].

2.2　天然植物提取物等抑菌劑對(duì)雞肉腸aw、NaCl、NaNO2等的影響

本實(shí)驗(yàn)中的雞肉腸產(chǎn)品理化指標(biāo)如表4所示.

表4　雞肉腸理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

數(shù)據(jù)顯示，實(shí)驗(yàn)各組pH 6.39～6.48，aw0.97～0.99，NaCl 1.75～1.89，未呈現(xiàn)顯著差異(P>0.05).亞硝殘留添加有“亞硝酸鈉+SD4+異抗壞血酸鈉"經(jīng)典組合的C2組為58.61 mg/kg，其余各組為0.表明除C2組的亞硝殘留外，添加物未對(duì)雞肉腸產(chǎn)品理化指標(biāo)產(chǎn)生影響.

2.3　天然植物提取物等抑菌劑對(duì)雞肉腸pH值的影響

實(shí)驗(yàn)中，各組別雞肉腸產(chǎn)品貯藏期pH值測(cè)定結(jié)果見表5.

表5　4 ℃條件下低溫雞肉腸樣品pH值

表5數(shù)據(jù)顯示，在樣品貯藏的初期，各處理組樣品的pH值均在6.22～6.45之間，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組樣品中的pH值均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),其中不添加防腐抑菌劑的空白對(duì)照組下降最大，而添加了天然抑菌劑T4N和T10的組和空白處理組的下降趨勢(shì)相近，添加T4N的組下降趨勢(shì)甚至比空白處理組的下降趨勢(shì)更加迅速.pH值下降相對(duì)較慢的是添加了傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑實(shí)驗(yàn)組和植物提取物的T10組和DV組，這2種抑菌劑均顯示出可有效減緩低溫雞肉腸產(chǎn)品pH值的下降，DV組在產(chǎn)品貯藏的前期能有效減緩樣品pH值的下降，但在第35 d之后，其作用有所減弱.

2.4　天然植物提取物等抑菌劑對(duì)雞肉腸質(zhì)構(gòu)特性的影響

實(shí)驗(yàn)中，各組別雞肉腸產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)測(cè)定結(jié)果見表6.

表6　添加抑菌劑對(duì)低溫雞肉腸質(zhì)構(gòu)的影響

表6數(shù)據(jù)顯示，在低溫雞肉腸產(chǎn)品貯藏初始，不同的防腐抑菌劑添加已對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特性產(chǎn)生了影響.與不添加抑菌劑的空白對(duì)照相比，天然抑菌劑T10、DV、以及T10+DV均在一定程度上提高了產(chǎn)品的硬度，但差異不是很顯著(P<0.05)，而各組的彈性差異則不顯著(P>0.05).

3　結(jié)　論

本研究選擇T4NW S、DV和CS天然植物提取物來替代硝鹽在肉制品中的抑菌作用，以低溫雞肉腸產(chǎn)品為對(duì)象，單增李斯特菌為靶向抑制菌株，通過微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)(MCT)對(duì)其抑菌效能進(jìn)行了分析，并與經(jīng)典化學(xué)防腐劑組合(1.56 mg/kg亞硝酸鈉+3.5% SD4+5.5 mg/kg異抗壞血酸鈉)及乳酸鏈球菌素Nisin進(jìn)行了比較.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)單增李斯特菌抑制效果最好的是傳統(tǒng)的“亞硝酸鈉+SD4+異抗壞血酸鈉"經(jīng)典組合，但植物提取物在不同程度上可替代硝鹽顯著的抑菌作用，能夠完全替代其作用的是0.6% T4NW S+0.5% CS，其次是1.0% DV，以及0.5% CS+0.5% DV.盡管只添加2 mg/kg Nisin對(duì)單增李斯特菌的抑菌效果最差，但仍然呈現(xiàn)出較顯著的抑制效應(yīng).不同提取物產(chǎn)品還顯現(xiàn)出互作效應(yīng)(柵欄效應(yīng))，例如1 mg/kg Nisin+0.5% DV的組合，抑菌效果就遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單獨(dú)添加1.0% DV或2 mg/kg Nisin的產(chǎn)品.

進(jìn)一步的產(chǎn)品特性分析顯示，植物提取物可完全替代傳統(tǒng)硝鹽的發(fā)色作用，其中T10組呈現(xiàn)較佳色澤，其a*值甚至略高于添加硝鹽組.同時(shí)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組產(chǎn)品pH值均有所下降，但添加了植物提取物的產(chǎn)品下降度更低，尤其是DV和T10+DV組顯著更佳.各組別aw、NaCl等無顯著差異.NaNO2的殘留，除添加了亞硝酸鈉的產(chǎn)品接近60 mg/kg外，其余各組均未檢出.硬度和彈性等的質(zhì)構(gòu)檢測(cè)各組未呈現(xiàn)特別顯著的差異.

雞肉腸是典型的低溫肉制品，貯運(yùn)過程中單增李斯特菌的控制是低溫肉制品面臨的難題.為保證產(chǎn)品微生物穩(wěn)定性和產(chǎn)品安全性，硝鹽類添加劑的應(yīng)用就顯得特別重要，這對(duì)于綠色、有機(jī)產(chǎn)品的開發(fā)，以及推行清潔標(biāo)簽化，往往成為難以逾越的障礙，而替代硝鹽的天然植物提取物的應(yīng)用，為解決此難題提供了可能.