熊方永,　蔡云楓,　張　英,　丁健樺

(東華理工大學(xué)化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院, 江西 南昌 330013)

快速、準(zhǔn)確、低溶劑消耗、綠色環(huán)保的分析方法研究一直是分析領(lǐng)域發(fā)展的重要趨勢[1,2]。雖然分析儀器的不斷發(fā)展提高了樣品分析的速度和靈敏度,但大部分分析儀器都無法直接測定樣品基體中的待測物。傳統(tǒng)的或目前采用較多的樣品前處理方法如液液萃取[3]、微萃取[4,5]、吸附類材料富集[6-8]、微流體[9]等,或需要長時(shí)間、重復(fù)性的循環(huán)操作,容易造成樣品本身的破壞;或使用大量有機(jī)溶劑,造成環(huán)境污染;或無法適應(yīng)現(xiàn)代分析儀器分析速度快、靈敏度高的要求[10,11]。因此,研究找到更加簡單、快速、環(huán)保、適應(yīng)性強(qiáng)的樣品富集方法是非常必要的。

2007年Keene等[12]提出氣泡可以對有機(jī)物產(chǎn)生富集作用。最初,有研究者[13,14]發(fā)現(xiàn),在香檳和其他酒飲料中的氣泡可對某些有機(jī)物產(chǎn)生富集。在此基礎(chǔ)上,Keene等[12]研究發(fā)現(xiàn),海洋破裂氣泡中有機(jī)物的濃度可以比海洋中有機(jī)物的濃度高2～3個(gè)數(shù)量級。隨后,研究者們陸續(xù)建立各種裝置模型研究氣泡富集現(xiàn)象[15-17]。這種富集效果主要是由于有機(jī)物的高表面活性使其在液相體系中被逐漸富集到氣-液界面(氣泡)上,然后氣泡在液面破裂,產(chǎn)生的微小液滴(氣溶膠)便富含高濃度有機(jī)物[18-21]?？梢?氣泡富集技術(shù)是可以用于有機(jī)物選擇性富集的一種簡單、省時(shí)、無污染、低成本的方法[22]。

抗生素在畜禽養(yǎng)殖中應(yīng)用非常廣泛[23]。當(dāng)動(dòng)物食用添加抗生素的飼料后,絕大部分抗生素以原藥或代謝產(chǎn)物的形式排出體外,隨地表徑流匯入江河或滲入地下[24],從而引發(fā)土壤、水體等一系列環(huán)境污染問題,間接威脅到人類的健康。因此,對環(huán)境中抗生素的檢測尤為必要。目前進(jìn)行抗生素檢測時(shí)較常使用的樣品前處理方法有固相萃取[25]、液相微萃取[26]、和超臨界萃取[27]等。這些前處理方法雖然各有優(yōu)點(diǎn),但是大都需要使用特定的試劑或材料,成本較高,甚至對環(huán)境還有一定的污染。本文則選擇了廣譜類抗生素土霉素作為研究對象,建立了氣泡富集-高效液相色譜檢測地表水樣中微量土霉素的方法。相比于其他樣品前處理方法,本法采用的氣泡富集法不但裝置簡單,成本低廉易操作,且不使用任何有機(jī)溶劑,避免了環(huán)境污染,同時(shí)該方法富集倍數(shù)高,靈敏度高,能滿足地表水樣中微量土霉素的定性定量分析要求,是一種值得推廣的新型樣品處理方法。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與材料

土霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院);地表水樣(取自南昌市某地);甲醇和乙腈(色譜級,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);三氟乙酸(分析純試劑,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

100 μm孔徑毛細(xì)管(美國安捷倫公司);氮?dú)?、二氧化碳、乙?99.999%,南昌國滕氣體有限公司)。實(shí)驗(yàn)室用水為二次蒸餾水。

1.2　儀器和裝置

Agilent-1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司); KQ5200DB數(shù)控超聲清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司)。

自制氣泡富集裝置(具體見2.1節(jié))。

1.3　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10.0 mg土霉素標(biāo)準(zhǔn)品,于50 mL燒杯中溶解,用超純水定溶于100 mL棕色容量瓶中,得到100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,避光保存,待用。

1.4　氣泡富集操作步驟

將待測樣品溶液放入氣泡富集裝置的下段開口的長管玻璃管中,溶液底部距溶液表面的液面高度為100 cm,長口處通入壓強(qiáng)為10 kPa的二氧化碳?xì)怏w,由此產(chǎn)生的氣溶膠液滴通過距液面高度為3 cm玻璃片收集,并引流到另一個(gè)玻璃管中。收集10 min,得到350 μL左右的待測溶液,再用于色譜分析。

1.5　色譜條件

色譜柱為Accurasil-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm,美國美瑞泰克科技有限公司);流動(dòng)相為乙腈+0.02%(v/v)三氟乙酸+甲醇,流速為1.5 mL/min;柱溫為25 ℃;紫外檢測波長為350 nm。

本法采用梯度洗脫,洗脫梯度見表1。

2　結(jié)果與討論

2.1　氣泡富集裝置的構(gòu)建

自行搭建的氣泡富集裝置(見圖1)主要包括氣泡產(chǎn)生和氣泡收集兩部分。其中氣泡產(chǎn)生部分由一個(gè)下端開口的敞口玻璃管組成,在緊挨開口上面用孔徑100 μm的毛細(xì)管插入橡膠活塞,制作出均勻分布的多孔材料隔層,氣體從玻璃管下端開口處通入,通過隔層中毛細(xì)管孔進(jìn)入玻璃管所盛的待測溶液中,產(chǎn)生氣泡;氣泡收集部分則由一塊玻璃片和一個(gè)敞口容器組成,溶液中待測組分會(huì)富集在氣泡產(chǎn)生部分產(chǎn)生的氣泡表面,并隨氣泡上升到液面,氣泡破裂后產(chǎn)生氣泡液滴,通過玻璃片收集產(chǎn)生的氣泡液滴并引流到敞口玻璃管,累積到一定量再用于色譜分析。

表 1 　測定土霉素的洗脫梯度

圖 1 　氣泡富集裝置Fig. 1 　Device of bubble enrichment

2.2　氣泡富集條件的優(yōu)化

2.2.1氣體種類的選擇

氣體種類是影響氣泡富集效果的一個(gè)重要因素,不同的氣體所產(chǎn)生的氣泡與溶液中待測組分接觸所達(dá)到的富集效果不同。

根據(jù)氣體自身的穩(wěn)定性,本文選擇3種氣體:氮?dú)狻⒍趸?、乙?水中的溶解度:二氧化碳>乙烯>氮?dú)?。氣體由于氣壓通過氣液分離界面,產(chǎn)生的氣泡與溶液中待測組分接觸后從液面破裂,通過玻璃片收集氣泡從液面破裂產(chǎn)生的氣泡液。裝置的氣壓為10 kPa,液面高度為100 cm,玻璃片中心距液面高度為3 cm,收集氣泡時(shí)間為10 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用氮?dú)狻⒍趸?、乙烯時(shí)對應(yīng)的土霉素峰面積分別為91、125、103,故二氧化碳對土霉素富集效果最好。這可能是因?yàn)榈獨(dú)?、乙烯不溶于?而二氧化碳微溶于水,當(dāng)通入二氧化碳時(shí),待測有機(jī)物更容易在二氧化碳帶動(dòng)下富集到氣-液界面(氣泡)上,伴隨氣泡在液面破裂,產(chǎn)生的氣溶膠含有更高濃度的待測有機(jī)物。本文采用二氧化碳作為通入的氣體。

2.2.2氣體壓力的優(yōu)化

從氣液分離界面通入的二氧化碳?xì)鈮菏怯绊懜患Ч囊粋€(gè)重要因素。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),若氣壓過小,氣體幾乎不能通過氣液分離界面,不能產(chǎn)生氣泡;若氣壓過大,會(huì)產(chǎn)生劇烈的鼓動(dòng)氣泡,影響富集效果。

設(shè)置二氧化碳?xì)鈮捍笮》謩e為5、10、20、30、50 kPa,每個(gè)氣壓重復(fù)測7次,其余條件同2.2.1節(jié)。如圖2所示,氣壓在0～10 kPa時(shí),峰面積逐漸增加,氣壓超過10 kPa以后,峰面積迅速減小,10 kPa時(shí)峰面積最大,富集效果最好。

圖 2 　氣壓對富集的影響(n=7)Fig. 2 　Impact of the air pressure on the enrichment (n=7)

2.2.3液面高度的優(yōu)化

溶液底部距溶液表面的高度是影響富集效果的一個(gè)重要因素。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),液面高度過高時(shí),溶液底部壓力越大,需要的氣體壓力越大,同時(shí)氣泡上升到液面過程中,易與其他氣泡結(jié)合,形成直徑更大的氣泡,影響富集效果;液面高度過低時(shí),氣泡與溶液中待測組分的接觸不夠充分,影響富集效果。

圖 3 　液面高度對富集的影響(n=7)Fig. 3 　Impact of the liquid level height on the enrichment (n=7)

在以上優(yōu)化條件下,設(shè)置液面高度分別為10、30、50、100、150 cm,每個(gè)高度重復(fù)測7次,其余條件同2.2.1節(jié)。如圖3所示,液面高度為10～100 cm時(shí)，峰面積逐漸增加,100 cm以后峰面積開始減小,液面高度為100 cm時(shí)峰面積最高,富集效果最好。

2.2.4玻璃片中心距液面高度

玻璃片與水平面成30°角,其中心距液面的高度是影響氣泡液收集的一個(gè)重要因素。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),玻璃片距液面過高時(shí),氣泡從液面破裂產(chǎn)生的氣泡液接觸不到玻璃片,從而無法收集樣品;玻璃片距液面過低時(shí),玻璃片易與氣泡破裂帶動(dòng)的水花接觸,從而稀釋收集的氣泡液,影響富集。

在以上優(yōu)化的條件下,設(shè)置玻璃片中心距液面高度分別為1、2、3、4、5 cm,每個(gè)高度重復(fù)測7次,其余條件同2.2.1節(jié)。如圖4所示,玻璃片中心距液面高度在1～3 cm時(shí),峰面積逐漸增加,3～5 cm時(shí)峰面積迅速減小,高度為3 cm時(shí)峰面積最高,富集效果最好。

圖 4 　玻璃片中心距液面高度對富集的影響(n=7)Fig. 4 　Impact of the distance between the center of the glass and the liquid level on the enrichment (n=7)

2.2.5收集時(shí)間的優(yōu)化

收集時(shí)間是影響富集效果的一個(gè)因素。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),時(shí)間過短,收集到的氣泡液體積達(dá)不到檢測要求,需要稀釋后定容檢測;耗時(shí)過長,則原樣品溶液濃度降低,氣泡液濃度降低,影響富集效果。

圖 5 　收集時(shí)間對富集和氣泡液體積的影響(n=7)Fig. 5 　Impact of collection time on the enrichment and the amount of bubble collected (n=7)

在以上優(yōu)化的條件下,設(shè)置收集時(shí)間分別為3、5、10、20 min。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測7次。如圖5所示,收集時(shí)間為0～20 min時(shí),隨著時(shí)間的增加,收集到的氣泡液體積越加,在0～10 min內(nèi)峰面積有上升的趨勢,10～20 min時(shí)峰面積開始下降。故選擇收集時(shí)間為10 min。

2.3　土霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和精密度

分別取1.3節(jié)制備好的標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成0.01、0.05、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、25.00、50.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在1.5節(jié)的色譜條件下進(jìn)行測定,得到土霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。土霉素在0.01～50.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性回歸方程為A=4.65C-0.72(式中A為峰面積;C為質(zhì)量濃度,mg/L),相關(guān)系數(shù)為0.999 8。取1.00 mg/L的土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液,在上述色譜條件下重復(fù)測定11次,峰面積的RSD為4.8%。根據(jù)公式[28]LOD=3cσ/S計(jì)算檢出限LOD,其中c為標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(mg/L),σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差,S為凈相應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度的平均值。結(jié)果LOD為0.038 mg/L?？梢?本文建立的色譜檢測方法的靈敏度和精密度均能達(dá)到溶液中微量土霉素檢測的要求。

2.4　富集倍數(shù)

取質(zhì)量濃度1 mg/L的土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液6份,其中3份不經(jīng)氣泡富集處理,直接在1.5節(jié)的色譜條件下平行測定3次,另外3份在優(yōu)化的氣泡富集方法和1.5節(jié)的色譜條件下平行測定3次,各取平行測定的平均值,得到如圖6所示的色譜圖。方法的SD為2.25,富集倍數(shù)為37.06?？梢?本法對土霉素具有較好的富集效果,有效提高了檢測的靈敏度,且整個(gè)萃取過程綠色環(huán)保。

圖 6 　氣泡富集前后的色譜圖Fig. 6 　Chromatograms before and after bubble enrichment

2.5　實(shí)際樣品分析

取地表水樣品,采用以上優(yōu)化的氣泡富集方法和1.5節(jié)的色譜條件對其進(jìn)行分析檢測,結(jié)果均未檢出土霉素。取該地表水樣加入適量土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液,制成0.005 mg/L的模擬樣品溶液,平行取3份100 mL模擬樣品溶液。分別加入0.000 5 mg土霉素標(biāo)準(zhǔn)品,此時(shí)溶液濃度為0.01 mg/L。對該3份溶液采用氣泡富集法富集后進(jìn)行HPLC分析,計(jì)算加標(biāo)回收率。土霉素檢測的平均加標(biāo)回收率可達(dá)101.9%,說明本法準(zhǔn)確度高。

由于模擬樣品中土霉素的質(zhì)量濃度(0.005 mg/L)低于其HPLC分析之線性回歸方程的線性范圍下限(0.01 mg/L),無法直接測定其濃度。而經(jīng)過的氣泡富集處理則可以檢測出來,說明本法提高了土霉素檢測的靈敏度。根據(jù)文獻(xiàn)[29],地表水中土霉素含量在0.01 mg/L以內(nèi),因此本法也能滿足環(huán)境水樣中土霉素的測定需求。

3　結(jié)論

氣泡富集法是新型樣品預(yù)處理方法,操作簡便、快速、綠色環(huán)保,是有機(jī)物提取富集的有效方法。該方法裝置簡單,適應(yīng)性強(qiáng),氣泡富集預(yù)處理方法有廣闊的應(yīng)用前景。不但能與HPLC結(jié)合用于水溶液中土霉素的富集和測定,還有望與氣相色譜、質(zhì)譜、光譜等技術(shù)聯(lián)用,用于其他有機(jī)物質(zhì)的檢測。為了更好地推動(dòng)氣泡富集法的實(shí)際應(yīng)用,其富集機(jī)理和規(guī)律的研究還有待進(jìn)一步的探索和研究。