朱碧麗，吳序櫟，辛啟航，王孟環(huán)，胡小鵬，賀震旦，劉立忠

（1.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518060）（2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，廣東深圳 518060）（3.深圳新型天然保健品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060）

隨著生活水平的提高，越來越多的人患有肥胖[1]，代謝綜合征[2]、心臟病[3]和Ⅱ型糖尿病[4]，這些疾病的發(fā)生機(jī)制都與胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)[5]有關(guān)。2型糖尿病狀態(tài)下脂肪酸和甘油三酯在骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的累積，導(dǎo)致骨骼肌對胰島素的敏感性降低，是引起胰島素抵抗的重要原因[6]。由于在胰島素刺激下，體內(nèi)超過 70%的葡萄糖可被骨骼肌細(xì)胞攝取并利用[7]，所以骨骼肌是攝取葡萄糖的最主要組織。胰島素主要通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路進(jìn)行代謝調(diào)節(jié)[8]，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路是胰島素抵抗相關(guān)的一條信號通路，與胰島素抵抗相關(guān)的2型糖尿病有著不可分割的聯(lián)系[8～11]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作為能量調(diào)控器，在調(diào)節(jié)肝臟、脂肪和骨骼肌的糖脂代謝方面發(fā)揮著重要的作用，并且維持著能量供需平衡[12]。AMPK參與了體內(nèi)葡萄糖、脂肪酸和蛋白質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，因此在肥胖、糖尿病、代謝綜合征患者的代謝調(diào)節(jié)中，AMPK是關(guān)鍵靶點(diǎn)之一[13,14]。骨骼肌的胰島素敏感性降低是機(jī)體胰島素抵抗的主要原因，因此臨床上仍然需要能夠促進(jìn)骨骼肌攝取葡萄糖，降低血糖濃度，恢復(fù)機(jī)體的正常胰島素水平，并且副作用小的藥物治療胰島素抵抗及 2型糖尿病。

金線蓮苷(kinsenoside)是葡萄糖與五元內(nèi)酯環(huán)的手性碳以糖苷鍵形式連接形成的葡萄糖苷，是金線蓮的特質(zhì)性成分[15]。金線蓮(Anoectochilus roxburghii)即花葉開唇蘭，又名金蠶、金線蘭等，是蘭科開唇蘭屬的一種多年生的草本植物[16]，我國南方福建、臺灣、廣西、廣東、四川和云南等省都有豐富的資源[17]，它是我國傳統(tǒng)的珍貴藥材，有清熱解毒、滋補(bǔ)養(yǎng)陰降火和消炎減輕疼痛等功效[18]。在現(xiàn)代中藥研究中，金線蓮多用于糖尿病、高血脂、高血壓和腫瘤等疾病的治療[19]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道該屬植物含金線蓮苷的水提物有降血糖、降血脂、保護(hù)肝臟、止痛和消炎等廣泛的藥理活性[20,21]。隨著研究的深入，金線蓮的藥用價(jià)值日益凸顯，其治療效果引起廣泛的關(guān)注，有良好的開發(fā)前景。

本課題以大鼠骨骼肌細(xì)胞為模型，研究在正常及胰島素抵抗情況下，金線蓮苷對細(xì)胞攝取葡萄糖的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示金線蓮苷可通過激活A(yù)kt和AMPK來增加細(xì)胞對葡萄糖的攝取，進(jìn)而改善胰島素抵抗的情況。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大鼠骨骼肌細(xì)胞系L6myc，由Dr.Amira Klip友情提供；金線蓮苷，深圳大學(xué)賀震旦教授課題組提供；必需基本培養(yǎng)(簡稱α-MEM)，Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，簡稱PBS），Notlas公司；胰蛋白酶，Gibco公司；雙抗，Cell Signaling Technology公司；葡萄糖(Glucose)，Sigma公司；胰島素(insulin)，諾和諾德公司；抗體，Cell Signaling Technology公司；ECL發(fā)光液試劑盒(Enhanced Chemiluminescence)，Bio-Rad公司；分離膠緩沖液(Resolving Gel Buffer pH 8.8)，Bio-Rad公司；積沉膠緩沖液(Stacking Gel Buffer pH 6.8)，Bio-Rad公司；十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecyl Sulphate，簡稱SDS)，Bio-Rad公司；過硫酸銨(Ammonium Persulphate，簡稱 APS)，Amresco公司；四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，簡稱TEMED)，Amresco公司；Trizma堿(Trizma Base，簡稱Triz)，Vetec公司；吐溫20(Tween-20)，Sangon Biotech公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Purelab Ultra超純水儀，ELGA公司；小型垂直電泳儀，美國Bio-Rad公司；CO2培養(yǎng)箱，廣東丹利科技有限公司；超凈工作臺，浩瀚技術(shù)有限公司；小型臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；化學(xué)發(fā)光成像儀，Clinx Science Instruments公司；搖床，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；紫外分光光度計(jì)，Thermo Fisher Scientific公司；漩渦混合器，江蘇金怡儀器科技有限公司；水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 L6骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)

將 L6myc肌母細(xì)胞從液氮中取出后，迅速置于37 ℃水浴中，充分融化。轉(zhuǎn)移至含 10%的血清和含1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)瓶中，充分分散細(xì)胞并將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中（37 ℃、5%CO2）培養(yǎng)。過夜后，更換新鮮的培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞的生長情況，一般每兩天傳一次代。L6myc肌母細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中的密度達(dá)到60%～70%后，消化傳代(104cells/mL)，并置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（α-MEM，2%胎牛血清，l%雙抗），每兩天換一次培養(yǎng)基。6～7 d后90%以上的細(xì)胞融合為多核、長樹枝狀或手狀的肌管細(xì)胞時(shí)，可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞處理

L6myc肌母細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟肌管細(xì)胞后，用于實(shí)驗(yàn)。金線蓮苷（kinsenoside）以不同濃度（10 nM，100 nM，1 μM）分別作用細(xì)胞1 h和24 h，以胰島素和黃連素小檗堿為對照，確定金線蓮苷對骨骼肌細(xì)胞的最適濃度和時(shí)間。采用高糖高胰島素（HGI）誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗。

1.3.3 蛋白免疫印跡分析

于細(xì)胞中加入 RIPA(使用前加入 1%protease inhibitor cocktail，2‰NaF和2‰PMSF)裂解液，刮取細(xì)胞至冰上裂解30 min后4 ℃，14000 r/min高速離心15 min，將上清液吸取至EP管中。進(jìn)行BCA蛋白定量，各取20 μg蛋白樣品于SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行電轉(zhuǎn)。5%BSA封閉1 h后分別加入一抗4 ℃孵育過夜。第二天TBST洗膜三次后二抗孵育1 h，TBST洗膜三次后進(jìn)行ECL法學(xué)發(fā)光液顯影，曝光。結(jié)果用ImageJ軟件對圖像進(jìn)行灰度掃描處理并進(jìn)行量化分析，以GAPDH作為內(nèi)參，用灰度值的比值表示相應(yīng)樣品所檢測蛋白質(zhì)的相對含量。

1.3.4 2-NBDG法檢測葡萄糖攝取

2-脫氧葡萄糖（2-DG）是天然D型葡萄糖衍生物，通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白進(jìn)入細(xì)胞。2-DG第2位氧原子被熒光基團(tuán)NBD取代即形成2-DG的熒光類似物，即熒光標(biāo)記2-脫氧葡萄糖（2-NBDG）。2-NBDG激發(fā)波長為460 nm，發(fā)射波長為540 nm，能夠被熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀等儀器探測。細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件處理后，用常溫PBS潤洗后以2-NBDG于培養(yǎng)箱中孵育30 min。PBS潤洗兩次后進(jìn)行讀數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用 ImageJ軟件對圖像進(jìn)行灰度掃描處理并進(jìn)行量化分析和GraphPad Prism 5軟件對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。與對照組相比較，顯著水平設(shè)定為*p＜0.05 和#p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 L6骨骼肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的形態(tài)學(xué)觀察

圖1 骨骼肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphological observation of skeletal muscle cells

細(xì)胞復(fù)蘇后對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，觀察細(xì)胞形態(tài)。L6骨骼肌細(xì)胞在接種的6～8 h會(huì)輕微貼壁，此時(shí)細(xì)胞還未完全展開，呈單個(gè)圓形或梭形，見圖1(a)。24 h后細(xì)胞完全展開，細(xì)胞數(shù)有所增加，見圖1(b)。48 h后細(xì)胞密度增加，細(xì)胞出現(xiàn)排列現(xiàn)象，見圖1(c)。在2%FBS誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的作用下，第3～4 d細(xì)胞有規(guī)律地平行排列，細(xì)胞與細(xì)胞之間相互融合，見圖1(d)。第6 d時(shí)85%以上的細(xì)胞融合成肌管細(xì)胞。肌管為光滑長條形，許多細(xì)胞核聚集在一起，位于肌管的中央，肌管之間多呈平行排列，見圖1(e)。肌管細(xì)胞為成熟的骨骼肌細(xì)胞，所以本研究以分化好的肌管細(xì)胞為模型進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。

2.2 金線蓮苷作用細(xì)胞可顯著激活 Akt和AMPK

圖2 金線蓮苷對Akt和AMPK活性和表達(dá)的影響Fig.2 Effects of kinsenoside on the activity and expression of Akt and AMPK

圖3 Western Blot圖像量化分析Fig.3 Quantitative analysis of Western Blot

Akt與AMPK是胰島素信號通路和AMPK信號通路中的重要靶點(diǎn)，參與細(xì)胞對葡萄糖的攝取，它們的活性高低與細(xì)胞攝取葡萄糖密切相關(guān)。金線蓮苷（kinsenoside，Kin）以不同濃度（10 nM，100 nM，1 μM，100 μM）分別作用細(xì)胞1 h和24 h，同時(shí)以胰島素（insulin，Ins）作用 10 min和黃連素小檗堿（berberine，BBR）作用1 h作為對照組。結(jié)果顯示，與對照組相比，金線蓮苷濃度為100 μM，作用1 h和24 h對Akt(與對照組相比，1 h降低15.50%，p＞0.05；24 h降低26.55%，p＞0.05)和AMPK(與對照組相比，1 h增加24.37%，p＞0.05；24 h降低2.79%，p＞0.05)均無顯著激活作用，說明高濃度的金線蓮苷可能會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。當(dāng)10 nM、100 nM和1 μM金線蓮苷作用細(xì)胞1 h后，與對照組相比，Akt活性分別增加了 56.46%(p＜0.05)、19.79%(p＞0.05)、1.88%（p＞0.05）。說明只有10 nM金線蓮苷顯著激活了Akt；10 nM、100 nM和1 μM金線蓮苷作用1 h后，與對照組相比，AMPK 活性分別增加了 15.54%(p＞0.05)、71.39%(p＜0.05)、94.70%(p＜0.05)，說明100 nM 和1 μM的金線蓮苷激活A(yù)MPK作用較好；當(dāng)10 nM、100 nM金線蓮苷作用細(xì)胞24 h后，與對照組相比，Akt的活性分別增加了 34.53%(p＜0.05)、5.53%(p＞0.05)，而 1μM金線蓮苷作用后Akt活性降低了6.20%(p＞0.05)，說明10 nM激活A(yù)kt的效果最好。當(dāng)10 nM、100 nM和1 μM金線蓮苷作用24 h后，與對照組相比，AMPK的活性分別增加了 149.92%(p＜0.05)、114.26%(p＜0.05)、147.84%(p＜0.05)，說明三個(gè)濃度的金線蓮苷都可顯著激活A(yù)MPK，見圖2和圖3（圖3是對圖2中各蛋白條帶的定量分析結(jié)果）。結(jié)果顯示，10 nM金線蓮苷作用細(xì)胞24 h后對Akt和AMPK同時(shí)激活的作用最為顯著，以后的試驗(yàn)中均采用此條件處理細(xì)胞。

2.3 正常情況下金線蓮苷促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的攝取

圖4 金線蓮苷對細(xì)胞攝取葡萄糖的作用Fig.4 The effect of kinsenoside on the glucose uptake of cells

與蛋白檢測結(jié)果相對應(yīng)，葡萄糖吸收實(shí)驗(yàn)顯示，以胰島素（Ins）和黃連素小檗堿（BBR）為參照，10 nM金線蓮苷（Kin）作用細(xì)胞1 h即可增加細(xì)胞對葡萄糖的吸收（與對照組相比，增加19.32%，p＞0.05），但不顯著；作用24 h后可顯著增加細(xì)胞對葡萄糖的攝?。ㄅc對照組相比，增加43.35%，p＜0.05），見圖4。結(jié)合圖2的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)10 nM金線蓮苷短期作用（1 h）只能顯著激活A(yù)kt(與對照組相比，增加54.46%，p＜0.05)，雖然 AMPK 的活性也有增加的趨勢，但不顯著，此時(shí)金線蓮苷引發(fā)的細(xì)胞對葡萄糖的攝取有輕微的增加（與對照組相比，增加 19.32%，p＞0.05）。當(dāng)10 nM金線蓮苷作用24 h后，可有效激活A(yù)kt和AMPK，同時(shí)顯著增加細(xì)胞對葡萄糖的攝?。ㄅc對照組相比，增加 43.35%，p＜0.05）。這說明金線蓮苷促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖需要同時(shí)激活A(yù)kt和AMPK，但是以AMPK活化為主，以Akt活化為輔。

2.4 胰島素抵抗情況下金線蓮苷對 Akt和AMPK的作用

圖5 不同處理?xiàng)l件下Akt和AMPK活性與表達(dá)Fig.5 Activity and expression of Akt and AMPK under different treatments

圖6 Western Blot圖像量化分析結(jié)果Fig.6 Quantitative analysis of Western Blot

正常情況下，胰島素（Ins，I）可激活 Akt(與對照組相比，增加 434.73%，p＜0.05)。高糖高胰島素（High glucose high insulin，HGI）誘導(dǎo)細(xì)胞胰島素抵抗后，與對照組比較，雖然經(jīng)胰島素長時(shí)間處理后Akt本底活性較高，但是胰島素再刺激不能顯著激活 Akt，與對照組相比，對胰島素的敏感性（胰島素加入后 Akt的活性變化/胰島素加入前 Akt的活性變化）降低了2.84倍，p＜0.05。說明胰島素抵抗的細(xì)胞模型誘導(dǎo)成功。但金線蓮苷（Kin，K）在正常和胰島素抵抗情況下都可激活A(yù)kt(與對照組相比，分別增加了59.77%，p＜0.05 和79.05%，p＜0.05)和AMPK(與對照組相比，分別增加了91.48%，p＜0.05和128.35%，p＜0.05)。更為重要的是，金線蓮苷可以改善胰島素抵抗的情況，恢復(fù)了胰島素對Akt的激活作用，與胰島素抵抗組相比，細(xì)胞對胰島素敏感性增加了1.17倍，p＜0.05。見圖5和圖6（圖6是對圖5中各蛋白條帶的定量分析結(jié)果）。結(jié)合圖2和圖5的Western Blot結(jié)果，發(fā)現(xiàn)胰島素不但不能激活A(yù)MPK，甚至對AMPK的活性有下調(diào)的作用。因?yàn)橐葝u素引發(fā)的是合成代謝，促進(jìn)糖原、脂肪和蛋白的合成。而AMPK激活的是分解代謝，促進(jìn)糖原、脂肪和蛋白的分解。因此在正常情況下，胰島素刺激細(xì)胞后所引發(fā)的合成代謝占據(jù)優(yōu)勢，對AMPK的活性有一定的抑制作用。但是在胰島素抵抗的情況下，胰島素信號通路受阻，而AMPK的激活不受影響，這時(shí)激活A(yù)MPK后不但促進(jìn)葡萄糖攝取，還可在一定程度上改善胰島素抵抗的作用[22]。

2.5 金線蓮苷可改善胰島素引發(fā)的細(xì)胞對葡萄糖的攝取

圖7 各個(gè)處理因素下葡萄糖的攝取情況Fig.7 Glucose uptake under various treatment factors

對于正常細(xì)胞來說，胰島素（Ins，I）和金線蓮苷（Kin，K）都可促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的攝取（與對照組相比，分別增加72.30%，p＜0.05、39.03%，p＜0.05）。金線蓮苷與胰島素共同作用細(xì)胞后，可引發(fā)更多的葡萄糖吸收，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示金線蓮苷與胰島素共同作用細(xì)胞時(shí)展示的是協(xié)同效應(yīng)（與胰島素促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖攝取相比，增加 64.70%，p＜0.05）。高糖高胰島素（HGI）誘導(dǎo)胰島素抵抗后，胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取的作用明顯減弱（與胰島素促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖攝取相比，增加 25.70%，p＞0.05），但是金線蓮苷仍然可以很好地促進(jìn)葡萄糖攝?。ㄅc對照組相比，增加59.00%，p＜0.05），并且金線蓮苷與胰島素共同作用后，可進(jìn)一步增強(qiáng)胰島素的作用（與胰島素促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖攝取相比，增加88.70%，p＜0.05），見圖7。這里，葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)與上述的蛋白檢測結(jié)果相一致。高糖高胰島素誘導(dǎo)胰島素抵抗后，本底的Akt活性增加，所以導(dǎo)致胰島素抵抗細(xì)胞比正常細(xì)胞在基礎(chǔ)水平上具有較多的葡萄糖吸收。金線蓮苷處理胰島素抵抗的細(xì)胞后，不但增強(qiáng)了Akt的活性，還進(jìn)一步增加了胰島素對Akt的活化作用，同時(shí)還顯著地激活了AMPK，所以無論正常細(xì)胞還是胰島素抵抗細(xì)胞，經(jīng)金線蓮苷處理后都可顯著增加對葡萄糖的攝取。

3 結(jié)論

胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)全身性的代謝紊亂[23]。骨骼肌的胰島素敏感性受損是機(jī)體胰島素抵抗的主要原因。金線蓮苷是金線蓮的主要成分之一，已被證明具有增強(qiáng)胰島素敏感性的作用，但其具體的分子機(jī)制尚不清楚。在本研究中，利用金線蓮提取物金線蓮苷作用骨骼肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在細(xì)胞正常情況下，金線蓮苷可以增加AMPK和Akt的活性，并且可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞對葡萄糖的攝?。辉谝葝u素抵抗的細(xì)胞中，金線蓮苷可顯著改善胰島素對Akt的激活作用。在正常及胰島素抵抗情況下，金線蓮苷都可顯著激活 AMPK，從而促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖。推測體內(nèi)金線蓮苷降糖機(jī)制如下：金線蓮苷作用細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶Akt與AMPK被激活，進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 4(GLUT4)向細(xì)胞膜遷移，并鑲嵌在細(xì)胞膜上，協(xié)助葡萄糖從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，這樣就降低了血糖濃度，減少了糖毒性，從而改善了胰島素抵抗。本研究為應(yīng)用金線蓮苷治療胰島素抵抗和Ⅱ型糖尿病提供了理論基礎(chǔ)。