趙玉紅，馬捷，李佳啟，王路

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）（2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090）

老山芹（Heracleum moellendorffii Hance），又稱為土當(dāng)歸、短毛白芷[1]和大葉芹等，學(xué)名東北牛防風(fēng)，傘形科牛防風(fēng)屬多年生宿根草本植物，是黑龍江省林區(qū)常見山野菜種類之一，生長(zhǎng)于我國(guó)東北和華北地區(qū)，朝鮮、俄羅斯等國(guó)河岸濕草地、草甸子、山坡林下及山地混雜林緣等陰濕環(huán)境[2]。老山芹是具有食用和藥用保健價(jià)值的春季山林野生蔬菜，在山野菜品種中占重要地位。其嫩莖葉口味鮮美，富含胡蘿卜素、維生素A、維生素C、維生素B2、維生素E、鐵、鈣、蛋白質(zhì)和多種氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分[3]及黃酮、香豆素、皂苷類化合物；全株可入藥，具有祛風(fēng)除濕、治療腰膝酸痛、頭痛及降血壓等功效。高陽(yáng)[4]等分析出老山芹根中親脂性化學(xué)成分主要為長(zhǎng)鏈醇、甾醇和香豆素類化合物。Zhang H L[5]等通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究了老山芹甲醇提取物降血糖主要成分為香豆素類。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是影響飲食中淀粉等主要碳水化合物消化、吸收的關(guān)鍵酶，α-葡萄糖苷酶抑制劑可以有效防治餐后高血糖，用于治療因碳水化合物代謝紊亂而引起的疾病[6]，α-淀粉酶抑制劑能有效抑制唾液淀粉酶和胰液淀粉酶活性，阻礙食物中碳水化合物的代謝，降低血糖和血脂水平[7]。

HepG2細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞株，來源于人肝胚胎瘤細(xì)胞，與肝細(xì)胞表型相似，與正常的葡萄糖受體細(xì)胞相比，具有正常肝細(xì)胞的基本生理特征[8]，能夠正常吸收葡萄糖，生成脂質(zhì)，合成RNA，并且保持了糖原合成酶的活性[9]。Panc-1細(xì)胞是人胰腺癌細(xì)胞株，源自于胰腺癌導(dǎo)管細(xì)胞，胰腺是人體第二大消化道實(shí)性器官，也是重要的內(nèi)分泌器官，胰腺具有分泌胰島素的功能，胰島素參與調(diào)節(jié)糖代謝，控制血糖平衡，可用于治療糖尿病。

近年來，對(duì)老山芹的研究主要是生長(zhǎng)發(fā)育方面，這種植物在細(xì)胞或動(dòng)物中的藥理活性研究較少，本實(shí)驗(yàn)以老山芹為原料，通過體外試驗(yàn)研究不同溶劑對(duì)老山芹活性物質(zhì)含量及抗氧化活性，并比較不同溶劑老山芹提取物抗氧化能力及對(duì)HepG2和Panc-1細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮老山芹（Heracleum moellendorffii Hance）購(gòu)于黑龍江嫩江農(nóng)場(chǎng)；α-葡萄糖苷酶：上海源葉生物科技公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）：上海源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶：上海源葉生物科技有限公司；人肝癌組織細(xì)胞系HepG2，人胰腺癌細(xì)胞系panc-1：黑龍江省哈爾濱醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)；DMEM培養(yǎng)液：美國(guó)Hyclone公司；無(wú)支原體新生胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）：上海源葉生物科技公司；二甲基亞砜：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；可溶性淀粉；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

ELx800NB型酶標(biāo)儀：美國(guó)BioTek公司；電熱恒溫水浴鍋 DK-S12：上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；pH計(jì)：Sartorius；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；CKX41倒置顯微鏡：OLYMPUS；二氧化碳培養(yǎng)箱：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；超清工作臺(tái)：YATAIKELONG；離心機(jī)：湖南星科科學(xué)儀器有限公司；25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶：美國(guó)Corning公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國(guó)Corning公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；-80 ℃低溫冰箱：美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 老山芹不同溶劑提取物的制備

水提物的制備：老山芹粉末在料液比1:60、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間3 h條件下進(jìn)行提取，抽濾后，收集濾液，將濾液進(jìn)行減壓蒸餾，然后將提取物干制研磨成粉末待用。

酸提物的制備：老山芹粉末在提取溫度70 ℃、料液比1:60、pH值3、提取時(shí)間2.5 h條件下進(jìn)行提取，結(jié)束后，冷卻至室溫，抽慮分離，并減壓蒸餾至原體積的一半，然后按3倍體積加入95%乙醇進(jìn)行沉淀，靜置30 min后有絮狀沉淀析出；經(jīng)離心、乙醇洗滌，將沉淀干制研磨成粉末待用。

堿提物的制備：老山芹粉末在提取溫度60 ℃、料液比1:40、pH值12，提取時(shí)間2 h條件下進(jìn)行提取，冷卻至室溫，抽濾分離，調(diào)節(jié)pH值至7.0，進(jìn)行減壓濃縮，然后按3倍體積加入95%乙醇進(jìn)行沉淀，靜置30 min后有絮狀沉淀析出；經(jīng)離心、乙醇洗滌，將沉淀干制研磨成粉末待用。

醇提物的制備：老山芹粉末在乙醇濃度80%、料液比1:15、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間2 h條件下進(jìn)行提取，離心抽濾分離濾液，將濾液進(jìn)行減壓蒸餾，然后干制研磨成粉末待用。

1.3.2α-葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定

α-葡萄糖苷酶抑制率參照[10～12]的方法，略加修改，取2 mg/mL的老山芹提取物100 μL，加入α-葡萄糖苷酶溶液50 μL，于37 ℃水浴10 min后，10 mg/mL的底物PNPG溶液50 μL，于37 ℃水浴15 min后，立即加入1 mol/L的Na2CO3溶液100 μL終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為405 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1，另取100 μL磷酸鹽緩沖溶液代替酶解液，測(cè)定其吸光值A(chǔ)0，再測(cè)定只有酶解液反應(yīng)體系額吸光值A(chǔ)2，每組試驗(yàn)做5次平行。按式（1）計(jì)算抑制率。

1.3.3α-淀粉酶抑制率測(cè)定

α-淀粉酶抑制率參照[13,14]的方法，略加修改，取2 mg/mL 的老山芹提取物100 μL，加入50 μL 的α-淀粉酶溶液，于37 ℃水浴10 min后，加入1.0%的可溶性淀粉溶液50 μL，于37 ℃水浴5 min后，立即加入DNS溶液100 μL終止反應(yīng)，再加入1000 μL PBS，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為540 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1，另3取100 μL磷酸鹽緩沖溶液代替酶解液，測(cè)定其吸光值A(chǔ)0，再測(cè)定只有酶解液反應(yīng)體系額吸光值A(chǔ)2，每組試驗(yàn)做5次平行。按式（1）計(jì)算抑制率。

1.3.4 多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸比色法[15]，略加修改。取適宜濃度的老山芹提取物，加蒸餾水至2.0 mL，加1 mL 6%苯酚混勻，沿管壁加入5 mL濃硫酸，震蕩混勻，靜置20 min。以試劑空白調(diào)零，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.5 總酚含量測(cè)定

采用福林酚-肖卡法[16]，略加改動(dòng)。取100 μL老山芹提取物置于10 mL容量瓶中，加水7 mL，搖勻，加入500 μL福林酚試劑，充分搖勻，1 min后加入20%Na2CO3溶液1.5 mL搖勻，最后加入900 μL蒸餾水，25 ℃恒溫水浴避光反應(yīng)1 h。在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.3.6 黃酮含量測(cè)定

采用文獻(xiàn)[16]的方法，略加改動(dòng)。取500 μL老山芹提取物加入30%的乙醇至5 mL，加入300 μL 5%的亞硝酸鈉，搖勻，6 min后加入300 μL 10%的硝酸鋁，搖勻靜置6 min后加入4 mL 1.0 mol/L的NaOH，反應(yīng)15 min后，510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.3.7 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

參考董竹平等[15]的方法略加改動(dòng)。取不同梯度濃度稀釋樣品1.5 mL和ABTS溶液1.5 mL，加入同一試管中，混勻后室溫下避光反應(yīng)6 min，在734 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)1，空白A0以等體積蒸餾水代替ABTS溶液，對(duì)照組A2以等體積的蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水空白調(diào)零，清除率按式（2）計(jì)算，平行測(cè)定3次。

1.3.8 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]的方法，略加改動(dòng)。取2.0 mL適宜濃度樣品與2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH混合，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值A(chǔ)1。空白組用無(wú)水乙醇代替樣品測(cè)定吸光值 A0，對(duì)照組用無(wú)水乙醇代替DPPH測(cè)定吸光值 A2，清除率按式（2）計(jì)算，平行測(cè)定3次。

1.3.9 FRAP總抗氧化能力測(cè)定

參考李昌勤等[18]的方法，略加修改。取20 μL樣品加入96孔板中，加入180 μL FRAP工作液，混勻，在37 ℃水浴條件下反應(yīng)5 min，于593 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。空白組以同體積蒸餾水代替樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總抗氧化能力。

1.3.10 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代

在離心管中加入4 mL含有10% FBS的培養(yǎng)液，然后將HepG2和Panc-1細(xì)胞從液氮罐中迅速取出，放入37 ℃的溫水的水浴鍋中，使其融化至無(wú)冰碴。移入離心管中，吹打均勻后，離心機(jī)l000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入4 mL培養(yǎng)液，將細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶中，放置到條件為37 ℃、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中，按1:3比例進(jìn)行傳代[19]。

1.3.11 MTT試驗(yàn)

選取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞經(jīng) 0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化后，用含10%新生牛血清DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，每孔按照5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板內(nèi)，待細(xì)胞完全貼壁后，實(shí)驗(yàn)組以每孔100 μL分別加入1000 μg/mL、500 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、1 μg/mL含藥的培養(yǎng)液，每組復(fù)6孔，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，按1:9體積每孔加入5 g/L MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），使結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光值，以吸光值反應(yīng)細(xì)胞活性和數(shù)量的多少[20,21]。

1.3.12 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.2制圖，采用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)置p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 老山芹不同溶劑提取物的 α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率

圖1是老山芹適宜條件下不同溶劑提取物的酶抑制率。由圖1可得，適宜提取條件下α-淀粉酶抑制率最高的是堿提物，抑制率為 42.15%，最低為醇提物37.03%，水提物和酸提物α-淀粉酶抑制率依次是38.97%、37.71%；適宜條件下α-葡萄糖苷酶抑制率最高的是堿提物，抑制率為 67.78%，最低為醇提物43.51%，水提物和酸提物α-葡萄糖苷酶抑制率依次是55.38%、63.90%，由此可得pH對(duì)提取物的酶抑制率有較大影響。

圖1 老山芹不同溶劑提取物酶抑制率Fig.1 The enzyme inhibition rate of extracts from Heracleum moellendorffii Hance by different solvents

2.2 老山芹不同溶劑提取物對(duì) α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的影響

圖2 老山芹不同溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的影響Fig.2 Effects of extracts from Heracleum moellendorffii Hance by different solvents on the inhibitory rates of α-glucosidase and α-amylase

圖2是四種老山芹不同溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的影響。

由圖2可知，老山芹不同溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均有抑制作用，隨著提取物濃度的增大，對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用均呈增大趨勢(shì)，當(dāng)α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到50%時(shí)，四種提取物濃度由大到小為水提物＞醇提物＞酸提物＞堿提物，其中堿提物IC50值為0.47 mg/mL，低于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖IC50值[22]；α-淀粉酶抑制率達(dá)到50%時(shí)，四種提取物濃度由大到小為酸提物＞水提物＞醇提物＞堿提物，其中堿提物IC50值為2.17 mg/mL，比很多中藥提取物對(duì)α-淀粉酶抑制作用大[23]。堿提物對(duì)兩種酶抑制率IC50值均最低。

由圖1、2可得，適宜條件下堿提物的酶抑制率最大且堿提物酶抑制率IC50值最小，因此在四種提取物中堿提物降血糖效果最好。

2.3 老山芹不同溶劑提取物活性物質(zhì)含量

圖3 老山芹不同溶劑提取物活性物質(zhì)含量Fig.3 The content of active ingredients in extracts from Heracleum moellendorffii Hance by different solvents

圖3為老山芹不同溶劑提取物多糖、總酚、黃酮的含量。由圖3可知，老山芹不同溶劑提取物中，多糖含量最高的是堿提物，為58.09 mg/g，含量最小的是酸提物，為51.48 mg/g，水提物和醇提物多糖含量依次為57.93 mg/g、57.42 mg/g；多酚含量最高的是醇提物，為11.48 mg/g，含量最小的是堿提物，為6.95 mg/g，水提物和酸提物多酚含量依次為10.76 mg/g、9.32 mg/g；黃酮含量最高的是醇提物，為3.96 mg/g，含量最小的是堿提物，為1.67 mg/g，水提物和酸提物黃酮含量依次為2.19 mg/g、2.03 mg/g。由此可得，醇提物中活性物質(zhì)含量較高，酸提物中活性物質(zhì)含量較少。

2.4 老山芹不同溶劑提取物抗氧化活性

老山芹不同溶劑提取物的DPPH法、ABTS法的IC50值和鐵離子還原能力見表1。由表1可知，老山芹不同溶劑提取物中，以DPPH法為指標(biāo)反應(yīng)出抗氧化活性由大到小為醇提物＞水提物＞堿提物＞酸提物，以ABTS法為指標(biāo)反應(yīng)出抗氧化活性由大到小為醇提物＞水提物＞堿提物＞酸提物，以FRAP法FeSO4當(dāng)量為指標(biāo)反應(yīng)出抗氧化活性由大到小為醇提物＞水提物＞堿提物＞酸提物，因此四種老山芹不同溶劑提取物中醇提物的抗氧化活性最高，李昌勤等[18]研究的中藥女貞子相比，以DPPH法和ABTS法為指標(biāo)，四種老山芹提取物IC50值均小于女貞子提取物，以FRAP法FeSO4當(dāng)量為指標(biāo)，醇提物FeSO4當(dāng)量高于女貞子提取物，其他三種提取物略低于女貞子提取物，因此可得出醇提物抗氧化活性高于女貞子提取物，其他三種提取物抗氧化活性與女貞子提取物相當(dāng)。由圖3和表1可知，活性物質(zhì)含量高的醇提物抗氧化活性也高，活性物質(zhì)含量較少的酸提物抗氧化活性也較低。

表1 老山芹不同溶劑提取物抗氧化活性Table 1 The antioxidant activity of extracts from Heracleum moellendorffii Hance by different solvents

2.5 老山芹不同溶劑提取物對(duì) HepG2細(xì)胞存活率的影響

圖4 老山芹不同溶劑提取物HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of extracts from Heracleum moellendorffii Hance by different solvents on the survival rate of HepG2 cells

由圖 4可知，用老山芹不同溶劑提取物處理HepG2細(xì)胞，隨著濃度的增大，細(xì)胞存活率逐漸降低，低濃度1 μg/mL條件下，酸提物處理過的細(xì)胞存活率最高，細(xì)胞存活率為131.80%，堿提物處理過的細(xì)胞存活率最低，細(xì)胞存活率為 122.61%，醇提物和水提物細(xì)胞存活率依次為 135.35%、131.80%；在高濃度1000 μg/mL條件下，堿提物細(xì)胞存活率最高，細(xì)胞存活率為93.40%，乙醇提物細(xì)胞存活率最低，細(xì)胞存活率為 72.46%，酸提物和水提物細(xì)胞存活率依次為92.94%、84.77%，與Yang Gao等[24]研究的老山芹甲醇提取物相比，四種老山芹不同溶劑提取物在低濃度條件下均有促進(jìn)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

2.6 老山芹不同溶劑提取物對(duì) panc-1細(xì)胞存活率的影響

圖5 老山芹不同溶劑提取物panc-1細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Effects of extracts from Heracleum moellendorffii Hance by different solvents on the survival rate of panc-1 cells

由圖 5可知，用老山芹不同溶劑提取物處理panc-1細(xì)胞，隨著濃度的增大，細(xì)胞存活率均呈下降趨勢(shì)，低濃度1 μg/mL條件下醇提物細(xì)胞存活率最高為111.94%，堿提物細(xì)胞存活率最低為96.11%，酸提物和水提物細(xì)胞存活率依次為103.53%、103.33%；高濃度1000 μg/mL條件下，酸提物細(xì)胞存活率最高為96.90%，水提物細(xì)胞存活率最低為76.43%，堿提物和醇提物細(xì)胞存活率依次為84.49%、81.45%，與Ding Xiaoge等[25]研究的三葉青提取物相比，三葉青提取物能顯著地抑制panc-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，老山芹不同溶劑提取物在低濃度條件下可以促進(jìn)panc-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，高濃度條件下才會(huì)抑制生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

通過對(duì)四種提取方法得到老山芹提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的比較可知，堿提物對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用比其余三種提取物較顯著，且堿提物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用比對(duì)α-淀粉酶抑制作用顯著，因此，四種提取物中堿提物的降血糖效果最好。四種提取物中醇提物的活性物質(zhì)含量較高且抗氧化活性較好，酸提物的活性物質(zhì)含量較少且抗氧化活性較差。通過四種提取物對(duì)HepG2和panc-1細(xì)胞存活率的影響可知，隨著提取物濃度增大細(xì)胞存活率均呈降低的趨勢(shì)，四種提取物在低濃度1 μg/mL條件下均可促進(jìn)HepG2和panc-1細(xì)胞生長(zhǎng)，在高濃度1000 μg/mL條件下均抑制HepG2和panc-1細(xì)胞生長(zhǎng)。