劉杉杉，孫　偉，張　穩(wěn),2，賈長青,2，羅　杰,2，沈易華，郁建生,2，何　誠

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州銅仁 554300；2.民族中獸藥分離純化技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，貴州銅仁 554300；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci)能夠在家禽中引起家禽和鳥類的系統(tǒng)性疾病，該病原能夠引起鳥疫，或者被稱為衣原體病[1]。國內(nèi)外和本實(shí)驗(yàn)室均有研究表明,在禽群中鸚鵡熱衣原體血清陽性率極高[2-4]，而且與禽群接觸的飼養(yǎng)人員有鳥疫的相關(guān)癥狀出現(xiàn)[5]。鸚鵡熱衣原體不僅給養(yǎng)禽業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失，而且攜帶衣原體的禽群長期向體外排毒，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，需要研制一種價(jià)格低廉而且有效的疫苗防控鸚鵡熱衣原體的感染。

鸚鵡熱衣原體疫苗多是采用主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)基因進(jìn)行構(gòu)建的，有研究表明，采用MOMP基因構(gòu)建的疫苗對(duì)于雞群抵抗鸚鵡熱衣原體感染的保護(hù)屬于不完全保護(hù)，而且只能提供同型之間的保護(hù)[6]。衣原體保守的多型外膜蛋白D(polymorphic membrane protein D,PmpD)具有泛中和抗體活性，同時(shí)可以介導(dǎo)衣原體持續(xù)性感染的早期免疫刺激[6]。PmpD蛋白的N端(N-terminal fragment of PmpD,PmpD-N)蛋白可以移位到菌體表面，與細(xì)胞膜的其他成分非共價(jià)結(jié)合在一起，而且PmpD-N的中和抗體可以提供感染早期的免疫保護(hù)[7]。因此，含有PmpD-N蛋白的疫苗是一種有價(jià)值的鸚鵡熱衣原體候選疫苗。

高的抗體滴度不一定能夠有更好的免疫保護(hù)，而且或許有負(fù)面作用，尤其是在菌體分泌方面。在豚鼠和沙眼衣原體感染模型中，體液免疫和細(xì)胞免疫在清除感染和防止再次感染方面都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[8]。因此，能夠?qū)ⅪW鵡熱衣原體PmpD-N蛋白遞呈到細(xì)胞表面并且產(chǎn)生免疫的活載體疫苗是一個(gè)很好的選擇。

目前以火雞皰疹病毒(Herpesvirus of turkeys,HVT)為載體構(gòu)建的活載體疫苗有多種，包括新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、禽流感病毒和艾美耳球蟲重組的HVT疫苗，并且有很好的長效的保護(hù)效果。在這些重組的HVT疫苗中，Li Y等[9]研制的H7NA重組的活載體疫苗是利用了構(gòu)建了HVT全長的細(xì)菌人工染色體技術(shù)(bacterial artificial chromosome，BAC)系統(tǒng)，操作簡單，效果好，而且插入的目的基因非常穩(wěn)定。本試驗(yàn)旨在通過構(gòu)建含有巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)啟動(dòng)子的表達(dá)PmpD-N的重組質(zhì)粒得到真核表達(dá)盒，采用BAC系統(tǒng)構(gòu)建HVT重組子，轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得重組病毒，為下一步的動(dòng)物試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1試劑脂質(zhì)體Lipofectamine LTX試劑盒，Invitrogen公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，NEB公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，Qiagen公司產(chǎn)品；Pfx高保真聚合酶，天根公司產(chǎn)品；ExTaq酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2菌株、雞胚和血清鸚鵡熱衣原體CB7株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，經(jīng)繁殖后保存于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院何誠教授實(shí)驗(yàn)室；按常規(guī)方法取9日齡～10日齡SPF雞胚(購自北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)制備CEF，供轉(zhuǎn)染和增殖重組病毒用；PVAX1載體保存于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院何誠教授實(shí)驗(yàn)室；鸚鵡熱衣原體6BC陽性血清，將鸚鵡熱衣原體6BC株免疫雞后制備；雞HVT多抗購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；鼠PmpD-N多抗，將先前制備的純化后的PmpD-N重組蛋白與弗氏佐劑乳化后免疫Balb/c小鼠后獲得。

1.2　方法

1.2.1目的基因的擴(kuò)增以CB7 DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增pmpD-N基因。根據(jù)pmpD-N基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物酶切位點(diǎn)為KpnⅠ，下游引物酶切位點(diǎn)為EcoRⅤ，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下(酶切位點(diǎn)用斜體字標(biāo)出)：上游引物：5′-CGGGGTACCGCCGCCACCATGGGATCCAATGTGTTGATTTCTGGAA-3′;下游引物：5′-AAAGATATCTCAAACAGCCCCACCTGTAGGAGCA-3′。

1.2.2pmpD-N真核表達(dá)盒的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅤ雙酶切后回收并純化，定向插入表達(dá)載體PVAX1的多克隆位點(diǎn)KpnⅠ和EcoRⅤ處，得到重組表達(dá)載體PVAX1-pmpD。

1.2.3表達(dá)pmpD-N基因的重組火雞皰疹病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建采用ExTaq酶擴(kuò)增PVAX1-pmpD的真核表達(dá)盒。上游引物：5′-GTTCCGCGTTAATTAACTTACGGTA-3′，下游引物：5′-TGTTAATTAAGGTTCGCTTGCTGT-3′。引物中均包含了PacⅠ酶切位點(diǎn)(斜體字標(biāo)注)，預(yù)期擴(kuò)增片段為大約2 000 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)PacⅠ酶切，插入本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的含有UL45和UL46的pGEM-T載體中構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體，并命名為pHVT-CMV-pmpD-BGH。

1.2.4HVT重組病毒的獲得采用內(nèi)切酶PvuⅡ和NruⅠ對(duì)轉(zhuǎn)移載體pHVT-CMV-pmpD-BGH進(jìn)行酶切，獲得帶有同源臂和真核表達(dá)盒的部分，并與實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的帶有g(shù)alK篩選標(biāo)記的重組HVT BAC進(jìn)行同源重組。具體步驟參照文獻(xiàn)[10]。將同源重組后獲得的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代雞胚成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的具體步驟參照Lipofectamine LTX試劑盒說明書。轉(zhuǎn)染后4 d收毒，進(jìn)行一次盲傳。產(chǎn)生病變的為陽性，命名為rHVT-CMV-pmpD。

1.2.5HVT重組病毒的鑒定

1.2.5.1HVT重組病毒的Western blot鑒定收集HVT重組病毒，用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解后，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，混勻，煮沸10 min，進(jìn)行Western blot分析，一抗采用自己制備的雞6BC多抗(1∶100稀釋)，二抗采用的是HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG(1∶5 000稀釋)。

1.2.5.2HVT重組病毒的IFA鑒定將第3代HVT重組病毒感染細(xì)胞，3 d后，進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)鑒定，一抗采用自己制備的鼠PmpD-N多抗(1∶100稀釋)，二抗采用的是FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG(1∶600稀釋)。

1.2.5.3HVT重組病毒的定位檢測(cè)將HVT重組病毒第3代細(xì)胞毒接種含有爬片的長至約80%的CEF細(xì)胞中，3 d后用PBS洗2次，采用Confocal進(jìn)行定位檢測(cè)，一抗采用1∶100稀釋的鼠PmpD-N多抗和雞HVT多抗，二抗為1∶600稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG和568標(biāo)記的羊抗雞IgY，最后用1∶5 000 稀釋的DAPI(終濃度為0.5 μg/mL)染色細(xì)胞核。

1.2.5.4HVT重組病毒的蝕斑檢測(cè)為更直觀地觀察HVT重組病毒的病變形態(tài)和檢測(cè)HVT重組病毒的毒價(jià)，將需要檢測(cè)的代次按照10-3、10-4、10-5三個(gè)稀釋度接種CEF細(xì)胞4 d后，進(jìn)行蝕斑試驗(yàn)檢測(cè)，一抗采用1∶100稀釋的雞HVT多抗，二抗則采用1∶4 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗雞IgY，最后用AEC試劑盒進(jìn)行染色。

1.2.5.5重組病毒的一步生長曲線將構(gòu)建好的HVT重組病毒和野生型HVT同時(shí)接種CEF細(xì)胞，接種劑量均為400 PFU，接種后不同時(shí)間收集感染細(xì)胞，用蝕斑檢測(cè)方法對(duì)不同時(shí)間的病毒含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5.6重組病毒對(duì)HD11細(xì)胞產(chǎn)生NO和IL-6的影響將400 PFU的重組HVT和野生型HVT同時(shí)接種于長成單層的HD11巨噬細(xì)胞，分別于接種后的1、2、4 d收集細(xì)胞上清，用NO檢測(cè)試劑盒(碧云天)，按照說明書進(jìn)行NO含量的檢測(cè)；同時(shí)提取不同時(shí)間收集的細(xì)胞RNA，用相對(duì)定量測(cè)定IL-6的含量，內(nèi)參基因采用GAPDH基因[11]。

2　結(jié)果

2.1　HVT重組病毒的獲得

將同源重組獲得的陽性克隆大提質(zhì)粒，參照Lipofectamine LTX試劑盒轉(zhuǎn)染原代CEF細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后4 d收毒，進(jìn)行一次盲傳。結(jié)果表明，構(gòu)建的HVT重組病毒產(chǎn)生了明顯病變，且病變形態(tài)與野生型HVT基本一致(圖1)。

A.野生型的HVT感染CEF產(chǎn)生的病變；B.rHVT-CMV-pmpD重組病毒感染CEF產(chǎn)生的病變

A.Cytopathic effect of parental HVT on CEF cells; B.Cytopathic effect of rHVT-CMV-pmpD on CEF cells

圖1HVT重組病毒感染CEF產(chǎn)生的病變(100×)

Fig.1Cytopathic effect of recombinant HVT on CEF cells(100×)

2.2　HVT重組病毒的Western blot鑒定

HVT重組病毒感染的細(xì)胞經(jīng)裂解后，用Western blot進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，HVT重組病毒在大約43 ku處出現(xiàn)目的條帶(圖2)，大小與預(yù)期相符。

2.3　HVT重組病毒的IFA鑒定

將第3代HVT重組病毒的細(xì)胞毒接種CEF細(xì)胞，3 d后用IFA進(jìn)行鑒定。IFA鑒定結(jié)果表明，HVT重組病毒感染CEF后出現(xiàn)明顯熒光，而對(duì)照細(xì)胞無熒光(圖3)。

2.4　HVT重組病毒的定位檢測(cè)

為檢測(cè)HVT重組病毒各部分蛋白(HVT蛋白和PmpD-N蛋白)的表達(dá)，將HVT重組病毒第3代細(xì)胞毒接種于長至爬片上的CEF細(xì)胞中，3 d后用Confocal進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,HVT重組病毒的PmpD-N蛋白在胞漿、胞核和細(xì)胞表面均有表達(dá)，HVT蛋白的表達(dá)主要在胞漿和胞核(圖4A)；HVT感染的細(xì)胞，蛋白主要表達(dá)在胞核及其周圍(圖4B)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.rHVT-CMV-pmpD重組病毒感染的CEF；2.野生型HVT感染的CEF

M.Protein molecular weight Marker；1.CEF infected with rHVT-CMV-pmpD;2.CEF infected with parental HVT

圖2HVT重組病毒的Western blot鑒定

Fig.2Identification of recombinant HVT by Western blot

A.rHVT-CMV-pmpD重組病毒感染CEF；B.正常細(xì)胞對(duì)照

A.CEF infected with rHVT-CMV-pmpD; B.Normal CEF control

圖3rHVT-CMV-pmpD重組體表達(dá)的IFA鑒定

Fig.3Identification of recombinant rHVT-CMV-pmpD by IFA

A.rHVT-CMV-pmpD重組病毒感染CEF;B.野生型HVT感染CEF

A.CEF infected with rHVT-CMV-pmpD;B.CEF infected with parental HVT

圖4 HVT重組病毒的定位鑒定

Fig.4Identification of recombinant HVT by confocal

2.5　HVT重組病毒的蝕斑檢測(cè)

HVT重組病毒和野生型HVT同時(shí)接種細(xì)胞，進(jìn)行蝕斑檢測(cè)，并用AEC試劑盒進(jìn)行染色，結(jié)果表明，HVT重組病毒和野生型HVT產(chǎn)生的蝕斑形態(tài)基本一致(圖5)。野生型HVT和rHVT-CMV-pmpD第4代的細(xì)胞毒毒價(jià)基本一致，分別為1×106PFU/mL和8×105PFU/mL。

A.野生型的HVT感染CEF產(chǎn)生的蝕斑;B.rHVT-CMV-pmpD重組病毒感染CEF產(chǎn)生的蝕斑(100×)

A.Plaques of parental HVT in CEF cells;B.Plaques of rHVT-CMV-pmpD in CEF cells(100×)

圖55野生型HVT和重組HVT感染CEF細(xì)胞后產(chǎn)生的病變(100×)

Fig.5Cytopathic effects of parental HVT and rHVT-CMV-pmpD on CEF cells(100×)

2.6　HVT重組病毒的一步生長曲線

將HVT重組病毒和野生型HVT同時(shí)接種CEF細(xì)胞，用蝕斑法對(duì)不同時(shí)間收集的感染細(xì)胞進(jìn)行病毒含量的檢測(cè)。結(jié)果表明，HVT重組病毒和野生型HVT的增殖速度相近，48 h時(shí)開始有明顯升高，經(jīng)過72 h～96 h的對(duì)數(shù)增長期后，開始出現(xiàn)明顯下降(圖6)。

圖6　rHVT-CMV-pmpD和野生型HVT的一步生長曲線

2.7　HVT重組病毒對(duì)HD11細(xì)胞產(chǎn)生NO和IL-6的影響

將400 PFU的HVT重組病毒和野生型HVT同時(shí)接種于HD11巨噬細(xì)胞后，不同時(shí)間的NO和IL-6含量檢測(cè)結(jié)果表明，HVT重組病毒組產(chǎn)生的NO始終顯著高于野生型HVT組(圖7)；HVT重組病毒組從第2天開始產(chǎn)生的IL-6始終顯著高于野生型HVT組(圖8)。

圖7　rHVT-CMV-pmpD對(duì)HD11細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響

圖8　rHVT-CMV-pmpD對(duì)HD11細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的影響

3　討論

在活載體疫苗構(gòu)建領(lǐng)域，HVT是一種常用的疫苗載體，現(xiàn)在更有已經(jīng)上市的梅里亞公司生產(chǎn)的HVT和雞傳染性法氏囊病二聯(lián)苗[12]。本研究中利用HVT載體的優(yōu)勢(shì)，將鸚鵡熱衣原體的PmpD-N蛋白進(jìn)行遞呈，構(gòu)建了基于CMV啟動(dòng)子表達(dá)鸚鵡熱衣原體PmpD-N蛋白的重組HVT，并在體外對(duì)其相關(guān)特性進(jìn)行了研究，以期免疫動(dòng)物體后可以激發(fā)高水平的細(xì)胞免疫和體液免疫，進(jìn)而獲得高水平的免疫效果。

重組HVT的構(gòu)建方法主要有經(jīng)典的同源重組方法和BAC技術(shù)構(gòu)建兩種。采用經(jīng)典的同源重組法構(gòu)建的步驟比較繁瑣，尤其是重組病毒的篩選比較困難，更重要的是最后獲得的重組病毒的穩(wěn)定性不好。而BAC技術(shù)構(gòu)建的重組HVT過程操作簡單，構(gòu)建的HVT穩(wěn)定性好。BAC通常采用的反向篩選方法包括neo-sacB、ccdB、rpsL-neo和galK。缺失了半乳糖操縱子的大腸埃希菌能夠采用基于galK基因的篩選。galK首先插入到BAC載體，重組病毒通過半乳糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。galK編碼半乳糖激酶，是半乳糖利用所必須的。半乳糖激酶使2-脫氧-半乳糖(DOG)磷酸化，DOG進(jìn)一步代謝產(chǎn)生有毒性的末端產(chǎn)物。galK通過同源重組的方法被外源基因替代后，由于失去了galK基因，因此可以通過含DOG和甘油的培養(yǎng)基篩選。未發(fā)生重組的病毒，由于仍含有g(shù)alK基因，因此在DOG培養(yǎng)基上產(chǎn)生了有毒的代謝產(chǎn)物。因此，galK可通過正向和反向篩選，而且背景很低，是一種非常便捷有效的篩選方法[10]。本研究在進(jìn)行反向篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，在DOG培養(yǎng)基上一般只長出10個(gè)左右菌落，鑒定后的陽性菌落大約有3個(gè)～7個(gè)，陽性率約30%～70%，這對(duì)于同源重組來說陽性率是很高的。

構(gòu)建的疫苗若要激發(fā)更好的免疫保護(hù)，則需要構(gòu)建的重組病毒可以將目的蛋白遞呈到細(xì)胞表面，因此本研究采用Confocal研究目的蛋白和HVT的定位。Confocal試驗(yàn)表明，HVT載體能將PmpD-N蛋白遞呈到細(xì)胞表面，為下一步的激發(fā)免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。蝕斑試驗(yàn)進(jìn)一步表明，構(gòu)建的重組HVT(rHVT-CMV-pmpD)與野生型HVT相比，病毒的病變狀態(tài)、蝕斑大小以及增殖速度都未發(fā)生改變。

巨噬細(xì)胞是吞噬細(xì)胞的一種，在動(dòng)物體內(nèi)參與先天性免疫和細(xì)胞免疫。骨髓中的前體細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)后成為單核細(xì)胞，隨后分化成巨噬細(xì)胞，進(jìn)而遷移到各種組織中。巨噬細(xì)胞在監(jiān)測(cè)、吞噬、攝取抗原、分泌各種促炎性細(xì)胞因子以及控制和消除感染中發(fā)揮了重要作用[13]。禽巨噬細(xì)胞在抵抗微生物的感染和病毒、細(xì)菌以及寄生蟲感染等方面發(fā)揮了核心作用。研究表明，禽巨噬細(xì)胞接觸病原和PAMPs后，能夠激活產(chǎn)生前炎性細(xì)胞因子和趨化因子以及抗微生物的ROS和NO，而ROS和NO是抗微生物的軍火庫，可以控制和清除病原[14]。HD11細(xì)胞系是AEV轉(zhuǎn)化禽巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系后獲得的，有吞噬能力，能夠表達(dá)Fc受體和巨噬細(xì)胞表面抗原[15]。HD11細(xì)胞作為雞的巨噬細(xì)胞廣泛應(yīng)用于體外免疫功能的研究。本研究中，HD11細(xì)胞用于闡明重組病毒rHVT-CMV-pmpD對(duì)巨噬細(xì)胞的功能的影響。研究表明rHVT-CMV-pmpD能夠明顯刺激巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子IL-6和NO的產(chǎn)生，對(duì)于殺死外界病原、促進(jìn)免疫應(yīng)答有至關(guān)重要的作用。另外，重組HVT疫苗誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活性增強(qiáng)是否通過激活Toll-like受體而發(fā)揮效應(yīng)，以及重組HVT活載體疫苗能否很好地產(chǎn)生免疫保護(hù)，還需要進(jìn)一步深入研究。