汪　偉，孫文超，曹　亮，易馳喆，鄭　敏，魯會軍*，金寧一*

(1.軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130122；2.溫州大學病毒學研究所，浙江溫州 325035；3.廣西動物疫病預防控制中心，廣西南寧 530001)

犬圓環(huán)病毒(Canine circovirus，CanineCV)在分類學上屬于環(huán)狀病毒科(Circoviridae)環(huán)狀病毒屬(Circovirus)的成員，為無囊膜的單股環(huán)狀DNA 病毒，基因組的大小約為2063 bp。CaineCV基因組包括兩個主要的編碼框，分別編碼復制酶(Rep)蛋白和核衣殼(Cap)蛋白。CaineCV于2012年首次被報道后[1]，陸續(xù)在意大利和德國發(fā)現(xiàn)[2]。已有病例報道稱CaineCV是引起犬淋巴結(jié)肉芽腫和壞死性血管炎的致病因子，臨床癥狀主要表現(xiàn)為嘔吐、出血性腹瀉等[2]。目前，歐美各國均已經(jīng)對CaineCV開展相關(guān)研究，而我國對該病毒的研究比較滯后。2016年孫文超等[3-4]對我國CaineCV的流行狀況進行了首次報道。CanineCV 的ORF1編碼框全長912 bp，編碼由303個氨基酸組成的復制酶(Rep蛋白)，Rep蛋白主要參與病毒的復制，但對其功能和作用機制尚不明確。為了對CaineCV 的Rep蛋白進行深入研究，本研究以犬圓環(huán)病毒基因組為模板序列，設(shè)計了特異性引物，通過PCR 擴增出Rep基因的完整序列，連接至pET-28a載體上，通過大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)表達Rep蛋白，為制備Rep蛋白的亞單位疫苗和建立CanineCV的ELISA 檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

大腸埃希菌BL21、DH5α感受態(tài)細胞，2×TaqPCR MasterMix，TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒，均購自天根生化科技有限公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、瓊脂糖、氨芐青霉素、卡那霉素等，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD18-T載體，購自寶生物工程(大連)有限公司；CanineCV JZ98/2014毒株、pET-28a質(zhì)粒，本實驗保存。

1.2　方法

1.2.1引物設(shè)計以GenBank中收錄的CanineCV JZ98/2014毒株序列(登錄號：KT946839)為參考序列，設(shè)計引物擴增Rep基因的特異性引物。上游引物F(BamHⅠ)：5′-GCGGGATCCATGGCTCAAGCTCAGGTTGA-3′；下游引物R(XhoI)：5′- CCCTCGAGGTAGTTATACATGAAAGGGAAC -3′，目的片段大小為912 bp，引物序列由吉林庫美生物有限公司合成。

1.2.2基因組樣品的制備參照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說明書提取病毒基因組。

1.2.3PCR反應及基因克隆以提取的基因組樣品為模板進行PCR 。反應條件：95℃預變性3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物，回收純化后連入pMD18-T載體，4℃ 連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH-5α感受態(tài)細胞，37℃ 搖床培養(yǎng)45 min 后，涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)13 h。從平板上挑取單菌落至含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，少量提取質(zhì)粒后用XhoⅠ和BamHⅠ酶切鑒定，酶切結(jié)果正確樣品送吉林庫美生物有限公司測序。

1.2.4原核表達載體的構(gòu)建將測序正確的陽性質(zhì)粒及pET-28a原核表達載體分別經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物，4℃ 連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含有卡那霉素的LB 平板上培養(yǎng)13 h。從平板上挑取單菌落至含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，少量搖菌后小提，質(zhì)粒雙酶切鑒定后送吉林庫美生物有限公司測序，將測序正確的陽性質(zhì)粒命名為pET(28a)-Rep。

1.2.5重組蛋白的原核表達將pET(28a)-Rep 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)14 h 。從平板上挑取單菌落至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)12 h，保存至4℃冰箱作為母液備用。將母液按1∶500的比例接種到新鮮培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD 600 nm值在0.4～0.8之間，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后收取樣品。樣品加入buffer沸水浴5 min，SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色鑒定誘導表達產(chǎn)物。

1.2.6Wstern blot鑒定誘導表達產(chǎn)物SDS-PAGE 電泳后，凝膠通過半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含50 mL/L小牛血清的脫脂乳封閉2 h后，加入鼠源Anti-His標簽抗體孵育2 h后TBST洗3次，加入HPR 標記的羊抗鼠二抗孵育2 h后TBST洗3次，AEC顯色。

2　結(jié)果

2.1　Rep基因的PCR擴增

以CanineCV基因組作為模板，PCR擴增出Rep基因的全長序列，條帶大小約為900 bp，與預期相符。將目的條帶連接在pMD18-T載體上后送測序，將測序正確的陽性質(zhì)粒命名為T-Rep (圖1)。

2.2　重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將T-Rep質(zhì)粒以及pET-28a載體分別經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，瓊脂糖電泳鑒定正確。膠回收純化后4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。將菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上，培養(yǎng)12 h后挑菌。挑取單菌落用液體LB培養(yǎng)12 h后小提，雙酶切鑒定為陽性。測序結(jié)果顯示目的基因已正確連接在pET-28a載體上，將測序正確的陽性質(zhì)粒命名為pET(28a)-Rep(圖2)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.基因組樣品；2.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1.Genomic sample;2.Nagetive control

圖1Rep基因的PCR擴增

Fig.1PCR amplification of Rep gene

M.DNA 標準DL 2 000;1.質(zhì)粒

M.DNA Marker DL 2 000;1.Plasmids

圖2pET(28a)-Rep質(zhì)粒雙酶切鑒定

Fig.2Idetification of pET(28a)-Rep plasmids by double enzyme digestion

2.3　原核表達產(chǎn)物的鑒定

在轉(zhuǎn)有重組質(zhì)粒pET(28a)-Rep的大腸埃希菌BL21感受態(tài)細胞中加入終濃度0.5 mmol/L IPTG，置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)，7 h后取樣進行SDS-PAGE電泳。將菌液超聲裂解，取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析鑒定，通過與空載體和0 h的誘導產(chǎn)物對比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有pET(28a)-Rep質(zhì)粒的重組菌能正確表達帶有His標簽的Rep蛋白，條帶大小約為35 ku，與預期相符。重組蛋白主要集中在沉淀中，表明重組蛋白主要以包涵體的形式表達(圖3)。

2.4　原核表達產(chǎn)物的Wstern blot鑒定

在SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，用Anti-His標簽抗體檢測帶有His標簽的重組Rep蛋白的反應原性。結(jié)果表明重組菌的表達產(chǎn)物能與Anti-His標簽抗體發(fā)生特異性結(jié)合，表明帶有His標簽的重組Rep蛋白得到正確表達(圖4)。

M.蛋白分子質(zhì)量標準;1.pET-28a誘導前產(chǎn)物； 2.pET-28a誘導后產(chǎn)物；3.重組菌誘導產(chǎn)物沉淀； 4.重組菌誘導產(chǎn)物上清

M.Protein molecular weight Marker;1.pET-28a pre-induced products;2.pET-28a induced products;3.Precipitate of the recombinant bacteria induced products;4.Supernatant of the recombinant bacteria induced products

圖3重組Rep蛋白表達形式分析

Fig.3SDS-PAGE analysis of recombinant Rep proteins

M.蛋白分子質(zhì)量標準;1.pET-28a誘導前產(chǎn)物；2.pET-28a誘導后產(chǎn)物；3.重組菌誘導前產(chǎn)物；4.重組菌誘導后產(chǎn)物

M.Protein molecular weight Marker;1.pET-28a pre-induced products;2.pET-28a induced products;3.Recombinant bacteria pre-induced products;4.Recombinant bacteria induced products

圖4重組Rep蛋白Western blot鑒定

Fig.4Identification of recombinant Rep protein by Western blot

3　討論

自2012年Kapoor等首次報道犬圓環(huán)病毒以來，歐美各國陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并報道了CanineCV并開展了相關(guān)研究，而我國一直未見相關(guān)報道。直到2016年，孫文超等人首次從犬血清中樣品檢測出CanineCV病毒，遺傳進化分析表明我國發(fā)現(xiàn)的CanineCV毒株與歐美各國發(fā)現(xiàn)的毒株位于不同的進化分支。Li L等[5]從感染犬細小病毒的病犬糞便樣品中用RT-qPCR方法成功檢測到CanineCV病毒，進一步研究表明感染CanineCV可引起病犬淋巴肉芽腫、壞死性血管炎以及出血性腹瀉等臨床癥狀，但目前尚無直接證據(jù)表明CanineCV能獨立引發(fā)上述臨床癥狀。Decaro N等[2]通過病理學剖檢和電鏡檢查發(fā)現(xiàn)，CanineCV與圓環(huán)病毒屬的其他成員相似，均以淋巴細胞為主要侵害細胞[6]。已報道的CanineCV的基因組長度均為2 063 bp，包含有3個閱讀框，其中含有912 bp 堿基最大的閱讀框ORF1編碼病毒的Rep蛋白，其分子量大小約為33 ku，目前的研究表明，Rep蛋白主要與病毒的復制有關(guān)，但Rep蛋白的具體功能和作用機制有待進一步研究。

已有研究表明Rep蛋白較為保守，通過對豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)Rep蛋白的功能的分析，可作為研究CanineCV Rep蛋白功能及作用機制的參考。在PCV2上的研究表明Rep蛋白是由PCV2基因組的最大編碼框ORF1 編碼，在病毒轉(zhuǎn)錄過程中ORF1轉(zhuǎn)錄本mRNA第417-799 nt 處發(fā)生了剪接，產(chǎn)生了一個截斷的Rep' 蛋白，兩者在病毒的復制過程中發(fā)揮協(xié)同作用[7-8]。兩種蛋白的N端序列中含有與CanineCV 滾環(huán)復制相關(guān)的3個保守序列Ⅰ(FTLUI)、Ⅱ(HLQG)、Ⅲ(YCSK) 以及1個結(jié)合dNTPs的P環(huán)結(jié)構(gòu)，這些序列的缺失或突變均會影響病毒的增殖。Cheung A K等[9-10]研究表明Rep和Rep'與細胞核中的dsDNA復制原點結(jié)合后， 使其頸環(huán)結(jié)構(gòu)展開，暴露出九聚體序列，隨后Rep/Rep'識別并切割該序列，以滾環(huán)方式進行基因組復制。對PCV2 Rep啟動子區(qū)類干擾素刺激反應元件(vISRE)進行點突變，發(fā)現(xiàn)突變株增殖能力相對親本株大幅度下降和對干擾素刺激的反應，這表明Rep啟動區(qū)域vISRE可能在干擾素促進病毒增殖過程中發(fā)揮調(diào)控作用[11]。張鑫[12]通過構(gòu)建Cap蛋白和Rep蛋白的真核表達質(zhì)粒，通過共轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)Cap蛋白和Rep蛋白存在共定位現(xiàn)象，推測Rep蛋白與Cap蛋白在病毒復制過程發(fā)揮協(xié)同用。目前在PCV2上的研究表明，PCV2感染后可以誘導Cap蛋白和Rep蛋白的產(chǎn)生，其中Cap蛋白包含主要的抗原中和表位，具有良好的免疫原性，但是存在體外表達難度大、表達量低的缺點，其次針對PCV2的疫苗產(chǎn)生的抗體主要針對Cap蛋白，不利于臨床檢測區(qū)分疫苗免疫與自然感染之間的鑒別診斷問題。現(xiàn)有的研究表明Rep蛋白也可以誘導中和抗體的產(chǎn)生，且可以在體外高效表達。Rep蛋白的這些特點有利于研制針對Rep蛋白的亞單位疫苗和ELISA檢測試劑盒[13-14]。

自2012年首次報道CanineCV后，歐美各國已逐步開展對CanineCV的研究，然而至今對其臨床癥狀、病理特征、致病機制及檢測手段尚無明確報道。本試驗以CanineCV基因組為模板，成功擴增出病毒的Rep蛋白序列，并將其連接在pET-28a載體上，構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pET(28a)-Rep。SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果表明帶有His標簽的重組Rep蛋白能以包涵體的形式在重組菌中獲得高效表達。該重組蛋白可用于制備Rep蛋白的抗體，為制備CanineCV的ELISA檢測試劑盒及CanineCV的防控奠定了基礎(chǔ)。