鞠守勇，陳其國

(武漢職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院，湖北武漢 430070)

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)是一種以細菌為食的自由生活的線蟲，廣泛存在土壤和堆肥中[1]。 1963年Sydney B首次把C.elegans作為模式生物用于研究動物發(fā)育和行為的模式動物，現(xiàn)已經(jīng)發(fā)展成為研究動物發(fā)育、神經(jīng)、衰老、毒理學、脂肪沉積和天然免疫等方面重要的模式生物[1]。近些年來，以C.elegans作為病原菌宿主模型來研究病原菌與宿主的相互作用逐漸成為了一個新的熱點，C.elegans作為病原菌宿主模型有很多優(yōu)勢，個體小，成蟲的長度大約1.5 mm；生長快，3 d～3.5 d就可以長成成蟲；繁殖快，成熟的線蟲每次可以獲得300個～350個子代個體；培養(yǎng)簡單，可以直接以要研究的細菌為食物[1]；基因組測序已經(jīng)完成；基因操作系統(tǒng)完善，突變體數(shù)量齊備，轉(zhuǎn)基因線蟲和RNAi技術(shù)成熟；表型易觀察等特征[2]。目前，C.elegans作為病原菌宿主模型，在病原菌的致病機制和宿主防御病原菌天然免疫等方面取得了一系列的進展。本文就近些年來利用線蟲作為宿主模型，在重要病原菌的致病機制和線蟲天然免疫信號通路取得的進展進行綜述。

1　以C.elegans為宿主模型研究病原菌致病機制

1999 年，Ausubel F M實驗室Tan M W等[3]開創(chuàng)了以銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)感染C.elegans為模型來研究致病菌的致病機制。目前，以C.elegans為模式宿主進行研究的病原菌有真菌、細菌、病毒等，有50多種(表1)。其中研究較深入的主要是一些人類病原菌，如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)[3]、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)[4]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[5-6]、黏質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)[7]、鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)[8]、鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)[9]等病原菌，還有一些農(nóng)業(yè)中具有重要應(yīng)用價值的殺線蟲微生物，如厚垣普奇尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)、淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)[10]、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)[11]等。

1.1　銅綠假單胞菌

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)在自然界分布廣泛，是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一，可以引起術(shù)后傷口感染，也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中耳炎等[3]。1999年Ausubel F M實驗室首先以C.elegans作為宿主模型來研究PA的致病機制，近年來研究發(fā)現(xiàn)PA殺線蟲的機制至少有4種方式。

1.1.1緩慢致死方式PA生長在C.elegans培養(yǎng)基(NGM)中，進入線蟲體內(nèi)后，在腸道里生長繁殖且形成生物膜，當PA在線蟲腸道中聚集到線蟲難以清除的數(shù)量后，PA就會在線蟲腸道中大量增生從而緩慢殺死線蟲[3]。

1.1.2快速致死方式研究發(fā)現(xiàn)，PA在營養(yǎng)豐富的高滲固體培養(yǎng)基中，毒殺線蟲的速度大大加快，進一步研究發(fā)現(xiàn)，PA在營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基中會分泌多種噻吩類物質(zhì)等小分子毒素，直接快速殺死線蟲；PA弱毒菌PAO1在腦心浸液固體培養(yǎng)基中產(chǎn)生小分子氰化氫神經(jīng)毒素快速殺死線蟲[12]。

1.1.3紅色死亡方式PA在缺乏磷的培養(yǎng)基中生長過程中，可以通過蛋白PhoB激活其磷酸攝入系統(tǒng)，誘導(dǎo)群體數(shù)量感應(yīng)系統(tǒng)(quorum-sensing pathways)，激活PA中的鐵載體蛋白，搶奪線蟲細胞中的Fe3+導(dǎo)致線蟲缺Fe3+死亡，因死亡線蟲的咽部和腸道組織內(nèi)往往觀察到紅色，這種死亡方式命名為“紅色死亡”[13]。

1.1.4液體死亡方式2013年Kirienko N V等[14]在液體環(huán)境下用PA毒殺線蟲時，發(fā)現(xiàn)PA在線蟲體內(nèi)沒有進行增殖，也沒有激活PA的群體數(shù)量信號系統(tǒng)，熒光鐵載體多肽和雙組份系統(tǒng)也沒有被激活，整個PA毒殺過程中也不產(chǎn)生噻吩類化合物；PA在液體環(huán)境下作用于線蟲的過程中，線蟲啟動缺氧應(yīng)答因子HIF-1防御PA， PA在液體中毒殺線蟲的具體機制還有待于進一步研究。

PA不但可以產(chǎn)生毒素殺死線蟲，而且可以成功躲避線蟲天然免疫系統(tǒng)，PA可以通過自身的GacA雙組份調(diào)控系統(tǒng)和LasR、RhlR群體數(shù)量感應(yīng)系統(tǒng)分泌出一些物質(zhì)，誘導(dǎo)線蟲分泌胰島素類似蛋白INS-7，INS-7可以與DAF-2受體蛋白結(jié)合，從而抑制FOXO轉(zhuǎn)錄因子DAF-16進入細胞核中，不能激活免疫防御相關(guān)基因thn-2、lys-7和spp-1等，成功定植線蟲腸道[15]。

1.2　糞腸球菌

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis，Ef)是人體腸胃中的條件性致病菌，嚴重時可以引起人心臟內(nèi)膜炎，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對多種藥物具有抗性的菌株[16]。Ef殺線蟲的主要機制是在線蟲的腸道中大量增殖，從而引起腸道腫脹，殺死線蟲個體；Ef毒殺線蟲的關(guān)鍵致病因子主要是溶細胞素(Cyl)，其中群體感應(yīng)系統(tǒng)fsr/gelE-sprE也參與了對線蟲的感染，Ef侵染線蟲后，線蟲增加體內(nèi)的活性氧(reactive oxy gen species，ROS)來抵御細菌的感染[4]。

1.3　黏質(zhì)沙雷菌

黏質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens，Sm)是一種廣宿主條件致病菌，可以感染植物、無脊椎動物和脊椎動物等，近年來，由于抗生素抗性菌株的出現(xiàn)，Sm對人類健康的威脅越來越嚴重[7]。以C.elegans為宿主模型研究發(fā)現(xiàn)，Sm可以成功逃避線蟲口器的咀嚼，定植于線蟲腸道，6 d后導(dǎo)致腸道腫脹而死，少量細菌也可以定植于線蟲的生殖器[17]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，線蟲可以大量表達一些類似免疫蛋白抵御Sm，例如TGF-β信號通路調(diào)控的溶菌酶、凝集素等[18]。

1.4　金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，Sa)可以引起人傷口的嚴重感染，產(chǎn)生毒素，進入人體腸道后引起腸炎、嘔吐、發(fā)熱、腹瀉等癥狀[19]。Sa可在線蟲腸道中聚集，破壞腸道上皮組織，最終導(dǎo)致線蟲死亡[20]，通過構(gòu)建Sa的插入突變體，發(fā)現(xiàn)Sa毒力調(diào)控基因agr和sarA缺失后，對線蟲的毒力明顯降低，進一步研究表明，毒力調(diào)控基調(diào)控子和下游基因V8蛋白酶、α-溶血素對Sa感染線蟲必須的[19]；初期感染的線蟲轉(zhuǎn)移到無毒細菌后，線蟲可以排出腸道中定植的Sa恢復(fù)健康[20]；線蟲通過β-連環(huán)蛋白Bar-1調(diào)控下游基因egl-5抵御Sa的侵染[21]。

1.5　蘇云金芽胞桿菌

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)典型的特征在芽胞后期形成一種伴胞晶體蛋白(crystal proteins，Cry)，大多數(shù)晶體蛋白具有毒殺特定的昆蟲、線蟲等害蟲的特點，該特征使Bt廣泛用于防治農(nóng)業(yè)害蟲、林業(yè)害蟲、儲藏害蟲和衛(wèi)生害蟲[22]。2000年美國加州大學Aroian R實驗室首先利用C.elegans為宿主模型來研究Bt殺蟲機制[23]；通過EMS誘變線蟲篩選到了對Cry5B有抗性的基因，從而發(fā)現(xiàn)了Cry5B在線蟲的新受體是無脊椎動物所特有的糖脂，同時也在昆蟲中發(fā)現(xiàn)糖脂可以與Cry蛋白相互作用[24]。隨后發(fā)現(xiàn)線蟲抵御Cry5B蛋白的多個信號通路,包括P38/MAPK、C-JNK/MAPK信號通路，未折疊蛋白應(yīng)答(unfolded protein response (UPR) )通路，Daf-2/Daf-16信號通路等[25]，同時還發(fā)現(xiàn)線蟲低氧應(yīng)答機制(low oxygen response)、囊泡運輸修復(fù)系統(tǒng)也參與了對Cry5B穿孔毒素的防御[25]。有趣的是含有Cry5B的野生Bt菌株YBT-1518在環(huán)境中毒素Cry5B處于沉默狀態(tài)，當YBT-1518進入到線蟲體內(nèi)后，會大量表達原本沉默的毒素Cry5B，進一步研究發(fā)現(xiàn)，新型sRNA BtsR1負調(diào)控了Cry5Ba導(dǎo)致其在非宿主環(huán)境下沉默，該表型可掩蓋Bt的毒性以欺騙線蟲的拒食行為，使Bt更易被線蟲取食，當Bt被取食進入宿主后該沉默現(xiàn)象解除，Cry5Ba大量表達并迅速殺死線蟲，使Bt取得生存優(yōu)勢，該新發(fā)現(xiàn)揭示了一種新型的病原菌逃避宿主趨避防御行為的策略[26]。

表1　秀麗隱桿線蟲的病原菌

續(xù)表1

項目 Item秀麗隱桿線蟲病原菌Pathogens of C.elegans毒殺機制Pathogenic mechanism人類病原菌Human pathogen? Streptococcus mitis(Viridans group)侵染腸道;毒素Gut infection;toxin是Yes Streptococcus oralis侵染腸道;毒素Gut infection;toxin是Yes 革蘭陽性細菌G+ bacteriaStreptococcus pneumoniae侵染腸道;毒素Gut infection;toxin是Yes Streptococcus pyogenes(Group A)侵染腸道;毒素Gut infection;toxin是Yes Streptoverticillium albireticuli侵染腸道;毒素Gut infection;toxin是Yes

2　秀麗隱桿線蟲抵御病原菌的天然免疫通路

C.elegans不但是研究病原菌致病機制的理想宿主模型，同時也是研究宿主天然免疫信號通路的理想模型[27]。近幾年，利用建立的病原菌C.elegans模型，在C.elegans抵御病原菌的天然免疫信號通路方面取得了一系列的進展， 發(fā)現(xiàn)C.elegans主要通過3條天然免疫信號通路抵御病原菌侵染，分別是絲裂原蛋白激酶(MAPK) 信號通路、DAF-2/DAF-16 信號通路和TGF-β信號通路 (圖1)。

圖1　C.elegans主要的三條天然免疫信號通路

2.1　絲裂原蛋白激酶信號通路

絲裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路在動物和植物中極其保守，也是線蟲中研究較深入的天然免疫信號通路。該通路包含三條不同激酶信號傳導(dǎo)方式，即細胞因子抑制的抗炎藥物結(jié)合蛋白激酶 (cytokine-suppressive anti-inflammatory drug-binding protein kinase)P38/MAPK、細胞外調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulation kinase)ERK/MAPK、氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase)C-JNK/MAPK。在研究PA的致病機制時，發(fā)現(xiàn)P38/MAPK信號通路突變體更加容易導(dǎo)致線蟲致死，對PA表現(xiàn)為敏感。ERK/MAPK可以抵御革蘭陽性細菌細小棒狀桿菌、蘇云金芽胞桿菌等，C-JNK/MAPK對蘇云金芽胞桿菌中的Cry蛋白有防御作用[28]。

2.2　類胰島素受體/DAF-2/DAF-16信號通路

類胰島素受體(insulin-like)/DAF-2/DAF-16信號通路是在研究線蟲壽命中發(fā)現(xiàn)的，DAF-2的缺失突變體比正常的線蟲壽命更長，Daf-2蛋白與胰島素受體相似，通過調(diào)節(jié)線蟲體內(nèi)FOXO家族轉(zhuǎn)錄因子DAF-16的細胞核定位參與線蟲的天然免疫、調(diào)節(jié)線蟲的壽命、應(yīng)激以及線蟲休眠狀態(tài)(Dauer)的啟動等[29]；Daf-2蛋白受體活化后會使DAF-16保留在細胞質(zhì)中，當有拮抗劑INS-1與Daf-2結(jié)合(或Daf-2功能缺失)等情況下，DAF-16不能被磷酸化就會進入到細胞核中，并且激活一系列免疫、壽命相關(guān)基因的表達[29]。正向遺傳學的研究發(fā)現(xiàn)Daf-2下游通過age-1/aap-1編碼的磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)激活絲氨酸/蘇氨酸激酶(例如PDK-1、SGK -1、AKT-1、AKT-2等)，使轉(zhuǎn)錄因子DAF-16磷酸化，阻止其從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)，抑制一系列基因的轉(zhuǎn)錄，其中在此通路上的任何缺失都會使轉(zhuǎn)錄因子DAF-16不能被磷酸化，使DAF-16從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能[29]。Daf-2突變體對多種不同的病原菌均表現(xiàn)出抗性，研究發(fā)現(xiàn)DAF-16轉(zhuǎn)移到細胞核中后啟動了多種抗菌基因的表達[30]。大多數(shù)p38/MAPK通路下游的病原菌誘導(dǎo)的免疫基因是由DAF-16/FOXO阻遏的[29]。另外，研究表明DAF-16的核定位調(diào)節(jié)參與多種反應(yīng)基因，因此DAF-2/DAF-16通路可能僅僅是一個應(yīng)激反應(yīng)的而不是一個特定的免疫應(yīng)答[30]。

2.3　轉(zhuǎn)化生長因子信號通路

該通路參與到線蟲的生長發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路參與了線蟲抵御黏質(zhì)沙雷菌和銅綠假單胞菌的侵染[2]。TGF-β 受體具有蛋白絲氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域，TGF-β受體激活后可催化轉(zhuǎn)錄因子Smad發(fā)生絲氨酸磷酸化，磷酸化的Smad 子形成同源寡聚體或異源寡聚體后，進入細胞核調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄速度[2]。TGF-β通路調(diào)控多個免疫相關(guān)的基因：溶菌酶基因(如lys-1、lys-7、lys-8)、凝集素基因、神經(jīng)細胞分泌蛋白DBL-1基因(dbl-1)等，這些基因表達產(chǎn)物由腸上皮細胞分泌進入腸腔發(fā)揮作用[2]。

2.4　其他防御反應(yīng)

除了以上的3個重要的天然免疫信號通路，還發(fā)現(xiàn)線蟲的損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)可以激活線蟲免疫反應(yīng)，DAMPs指宿主自身細胞被病原菌破壞從而釋放內(nèi)源性分子，即內(nèi)源性危險信號，從而啟動自身的免疫防御機制[30-31]。近幾年來發(fā)現(xiàn)的線蟲防御病原菌的DAMPs主要用細胞內(nèi)線粒體監(jiān)視通路(mitochondrial surveillance pathway)[31]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白應(yīng)答(unfolded protein response，UPR)通路和自噬(autophagy)等[32]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子也參與線蟲防御病原菌的反應(yīng)，例如BAR1/βcatenin、EGL5 、bZIP轉(zhuǎn)錄因子zip2、FSHR1[33]等。

3　小結(jié)與展望

C.elegans具有個體小，生長快，培養(yǎng)簡單，基因操作手段成熟，特別是具有海量的突變體庫，表型易觀察等特征，自從1999年開始以C.elegans為宿主模型來研究PA與宿主的相互作用以來，已經(jīng)在病原菌致病分子機制和宿主防御病原菌天然免疫方面取得了不錯進展。同時，這個領(lǐng)域的研究還處于剛剛起步階段，今后一段時期，C.elegans將在病原菌與宿主相互作用的眾多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，例如，發(fā)現(xiàn)各種病原菌的毒素及毒力因子，尋找病原菌毒素受體，宿主防御病原菌的天然免疫信號通路及宿主識別病原菌機制等方面，這些相應(yīng)分子機制的揭示有助于更好的預(yù)防和治療病原菌引起的人畜傳染病。