單洪波 史佳文 石 瑛

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150030

蛋白含量是馬鈴薯塊莖的重要品質(zhì)性狀, 也是重要的育種目標(biāo)之一[1]。張澤生等[2]對(duì)馬鈴薯蛋白的氨基酸組成深入研究證實(shí), 塊莖內(nèi)含有較高的必需氨基酸, 占其總量的47.90%左右。潘牧等[3]研究表明, 馬鈴薯蛋白的第一限制氨基酸為色氨酸, 且富含其他糧食作物所缺乏的賴氨酸, 可與大豆蛋白等谷類蛋白互補(bǔ)。通過(guò)對(duì)動(dòng)物與人類試驗(yàn)證明, 馬鈴薯蛋白富有較高的生物價(jià)值[4-5]。因此, 馬鈴薯塊莖蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白, 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高, 高蛋白含量馬鈴薯品種的選育能夠提升馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

傳統(tǒng)的馬鈴薯育種周期較長(zhǎng), 篩選效率較低, 并伴隨精確度低等諸多弊端, 分子標(biāo)記輔助選擇能極大地縮短育種年限, 提高育種效率。目前, 已有數(shù)十個(gè)馬鈴薯重要性狀被標(biāo)記, 例如抗病毒病、抗青枯病、抗晚疫病等抗病性狀[6-7]; 炸片顏色、薯肉顏色等品質(zhì)性狀[8]; 耐干旱、抗凍性等抗性性狀[9]。祁緣[10]通過(guò)BSA策略結(jié)合與QTL區(qū)域緊密連鎖的分子標(biāo)記DMC42144af、DMC42152bf, 將2個(gè)馬鈴薯晚疫病 AFLP標(biāo)記定位在第 9染色體上的一個(gè)QTL dPI09a置信區(qū)間內(nèi); 雷劍等[11]根據(jù) BSA混池方法開(kāi)發(fā)了與馬鈴薯青枯病抗性緊密連鎖的SRAP標(biāo)記; Rak等[12]利用多倍體模型全基因組關(guān)聯(lián)分析將薯片顏色 QTL定位到第2染色體的短臂上; Tiwari等[13]將源于二倍體馬鈴薯中的BR基因分子標(biāo)記用于馬鈴薯抗晚疫病性狀的篩選, 但在四倍體馬鈴薯材料的實(shí)際應(yīng)用中, 復(fù)雜的遺傳方式使目的性狀與標(biāo)記分離, 并伴隨篩選準(zhǔn)確率低等諸多問(wèn)題。有關(guān)塊莖蛋白含量的分子標(biāo)記研究較少, 鄔信康等[14]根據(jù)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)和脈沖電泳分析, 表明馬鈴薯蛋白多基因簇位于第 8染色體的 1.4 Mb的DNA片段上。隨著B(niǎo)SA混池方法與測(cè)序技術(shù)的不斷成熟, 高篩選效率與精準(zhǔn)度得到了極大的保障, 能夠?yàn)榉肿虞o助育種提供新的標(biāo)記資源。在四倍體水平上對(duì)馬鈴薯蛋白含量相關(guān)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與研究有利于加速馬鈴薯蛋白含量分子輔助育種進(jìn)程。

本研究以四倍體馬鈴薯蛋白含量分離群體為材料,利用BSA混池構(gòu)建與高通量簡(jiǎn)化基因組測(cè)序相結(jié)合(以下簡(jiǎn)稱BSA混池測(cè)序), 開(kāi)發(fā)四倍體馬鈴薯蛋白含量的分子標(biāo)記, 并經(jīng)極端高蛋白、極端低蛋白群體材料及四倍體馬鈴薯品種的驗(yàn)證, 獲得與四倍體馬鈴薯蛋白質(zhì)含量相關(guān)的分子標(biāo)記, 為分子輔助育種提供便利, 也為加快優(yōu)質(zhì)馬鈴薯品種的選育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 F1代分離群體 以蛋白含量 2.32%的高蛋白品種大西洋為母本, 蛋白含量1.31%的低蛋白品種定薯1號(hào)為父本, 雜交獲得 173份 F1代分離群體, 以親本和 F1代分離群體作為開(kāi)發(fā)蛋白含量分子標(biāo)記的試驗(yàn)材料。

1.1.2 供試品種 選取54個(gè)四倍體馬鈴薯品種作為蛋白含量分子標(biāo)記的驗(yàn)證材料(表1)。

表1 馬鈴薯品種信息Table1 Information of potato varietie s

1.2 分離群體及四倍體品種蛋白含量的測(cè)定

2016—2017年連續(xù) 2年將分離群體種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽(yáng)農(nóng)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)基地, 每份材料種植7株, 于收獲期收獲材料, 選取每份材料3株進(jìn)行樣品處理。將粉碎并通過(guò)40～60目/寸網(wǎng)篩的試樣0.1 g置洗滌干凈且烘干的消化管中, 加入1 mL水和5 mL濃硫酸放置過(guò)夜。

將消化管放入通風(fēng)櫥中的消煮爐上, 設(shè)置溫度為400～450℃, 每隔 15 min加3～4滴催化劑過(guò)氧化氫。待樣品消化至澄清透明且無(wú)雜質(zhì), 取下放涼, 同時(shí)做空白試驗(yàn)。

將消化好的樣品經(jīng)凱氏定氮儀檢測(cè), 得到全氮含量,換算成蛋白含量。

1.3 DNA的提取與極端分離后代DNA混池的構(gòu)建

采用 CTAB法提取馬鈴薯材料基因組 DNA, 用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

分別構(gòu)建極端高蛋白含量和極端低蛋白含量后代的DNA混池, DNA的提取方法與質(zhì)量檢測(cè)方法同上。

1.4 標(biāo)記開(kāi)發(fā)

建庫(kù)、簡(jiǎn)化基因組測(cè)序由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司幫助完成, 根據(jù)測(cè)序結(jié)果獲得了極端高蛋白與極端低蛋白混池間的差異片段, 參照馬鈴薯基因組序列網(wǎng)站(http://solanaceae.plantbiology.msuedu/pgsc_download.sht ml)對(duì)差異片段內(nèi)的差異標(biāo)簽的位點(diǎn)利用在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer)進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。將Tm值設(shè)定在55℃～60℃之間, 引物預(yù)擴(kuò)增片段大小設(shè)定在400～900 bp之間。將設(shè)計(jì)好的引物送至博仕生物工程有限公司進(jìn)行合成。

以高蛋白馬鈴薯品種大西洋和低蛋白馬鈴薯品種定薯1號(hào)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 選擇僅能在親本之一中擴(kuò)增出條帶或者在雙親中擴(kuò)增出不同條帶的引物用于開(kāi)發(fā)SCAR標(biāo)記。最后對(duì)極端分離群體材料進(jìn)行標(biāo)記驗(yàn)證。通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量與特異性檢測(cè)。PCR體系為20 μL, 含8.2 μL ddH2O、10 μLTaq-Plus PCR Forest Mix (2×)、0.4 μL 引物 F (10 μmol L–1)、0.4 μL 引物 R (10 μmol L–1)、1 μL DNA (100 ng μL–1)。PCR擴(kuò)增條件設(shè)定為預(yù)變性95℃ 3 min; 變性95℃ 30 s, 退火58℃ 30 s, 延伸72℃ 50 s, 35個(gè)循環(huán); 終延伸72℃ 10 min。

1.5 標(biāo)記的檢測(cè)

分別以馬鈴薯F1代分離群體的74份高蛋白群體材料、42份低蛋白群體材料及54個(gè)四倍體馬鈴薯品種的基因組DNA作為模板, 以分子標(biāo)記SCAR8-107為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理

根據(jù)分子標(biāo)記檢驗(yàn)結(jié)果, 將與高蛋白含量親本和低蛋白含量親本帶型一致的基因型分別記作1和0, 通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS的Pearson’s雙側(cè)檢驗(yàn)對(duì)分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與蛋白含量的鑒定結(jié)果進(jìn)行雙側(cè)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白含量的測(cè)定

測(cè)量獲得蛋白含量大于2.0%的高蛋白材料74份, 蛋白含量小于1.5%的低蛋白材料42份以及介于1.5%～2.0%之間的中蛋白含量材料57份(表2); 經(jīng)對(duì)分離群體蛋白含量的測(cè)定得到了分離群體的蛋白含量分布圖, 可以看出極端材料較少, 中等蛋白含量材料較多, 并且曲線大致呈正態(tài)分布(圖1)。說(shuō)明馬鈴薯蛋白含量為數(shù)量性狀。

圖1 群體蛋白含量分布Fig. 1 Distribution of group protein content

表2 群體蛋白含量的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination of group protein content

2.2 蛋白含量基因區(qū)段引物的設(shè)計(jì)與檢測(cè)

根據(jù)前期測(cè)序的結(jié)果, 在第 8染色體上 1.151～1.248 Mb區(qū)間內(nèi)得到了目的性狀的差異片段, 此片段與控制馬鈴薯高蛋白含量相關(guān)聯(lián), 區(qū)間大小在 97 kb,在該區(qū)段共設(shè)計(jì)引物34對(duì)(表3), 分別以高蛋白親本品種大西洋與低蛋白親本品種定薯1號(hào)的基因組DNA為模板對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性檢測(cè)(圖 2)。在該區(qū)段設(shè)計(jì)的引物中, 引物8-107展現(xiàn)出在差異蛋白含量親本中的特異性, 即在高蛋白含量親本擴(kuò)增有條帶, 低蛋白親本無(wú)擴(kuò)增條帶。

表3 引物信息Table 3 Primer information

圖2 部分引物在親本定薯1號(hào)和大西洋的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 PCR products of some primers in parents Dingshu 1 and Atlantic

2.3 分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證

將在雙親中擴(kuò)增出差異條帶的引物, 通過(guò) 25份極端高蛋白與 25份極端低蛋白后代驗(yàn)證發(fā)現(xiàn), 親本擴(kuò)增出現(xiàn)差異的引物8-107在極端高蛋白與極端低蛋白后代中擴(kuò)增結(jié)果一致。即引物8-107在極端高蛋白材料中的擴(kuò)增結(jié)果與親本大西洋一致, 均擴(kuò)增出條帶, 而引物 8-107在極端低蛋白材料中的擴(kuò)增結(jié)果與親本定薯1號(hào)保持一致, 均未擴(kuò)增出條帶(圖3)。因而, 本試驗(yàn)中, 篩選的引物8-107被選取用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究, 命名引物 8-107為SCAR8-107。

2.4 標(biāo)記SCAR8-107在分離群體高蛋白和低蛋白子代中的檢測(cè)

圖3 引物8-107標(biāo)記在部分極端高蛋白與極端低蛋白分離后代中的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 PCR amplification results of primers 8-107 in partial extremely high protein and extremely low protein progenies

在四倍體馬鈴薯F1代的173份分離群體中, 存在74份高蛋白材料、42份低蛋白材料以及 57份中蛋白材料,以其中的74份高蛋白群體材料和42份低蛋白群體材料作為SCAR8-107標(biāo)記檢測(cè)的目的材料。在標(biāo)記為陽(yáng)性的(有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)的70份材料中有67份為高蛋白含量材料,分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果與表型的對(duì)應(yīng)度達(dá)到了 95.71%。在標(biāo)記為陰性的(無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)的46份材料中有38份為低蛋白材料, 分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果與表型的對(duì)應(yīng)度達(dá)到了82.61%。共116份后代材料的分子標(biāo)記與蛋白含量表型鑒定的結(jié)果總體的對(duì)應(yīng)度達(dá)到了90.51% (圖4和表4)。將蛋白含量的測(cè)定結(jié)果與分子標(biāo)記的鑒定結(jié)果進(jìn)行SPSS雙側(cè)相關(guān)性分析, 相關(guān)系數(shù)(r)為0.794, 達(dá)到了極顯著水平。

2.5 標(biāo)記SCAR8-107在四倍體品種中的檢測(cè)

在54個(gè)馬鈴薯品種中, 蛋白含量大于2.0%的高蛋白含量的品種有10個(gè), 占總材料的18.51%; 蛋白含量小于1.5%的低蛋白含量品種有20個(gè), 占總材料的37.03% (表1)。利用開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記SCAR8-107對(duì)54個(gè)馬鈴薯品種檢測(cè)表明, 在標(biāo)記為陽(yáng)性的14個(gè)品種中, 有9個(gè)為高蛋白含量, 分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果與蛋白含量的對(duì)應(yīng)度達(dá)到了71.42%; 在標(biāo)記為陰性的23個(gè)品種中, 有17個(gè)為低蛋白含量, 分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果與蛋白含量的對(duì)應(yīng)度達(dá)到了73.91% (圖5和表5)。54個(gè)品種的標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果和蛋白含量的測(cè)定結(jié)果的總體的對(duì)應(yīng)度達(dá)到了 72.97%。將分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與蛋白含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行SPSS雙側(cè)相關(guān)性分析, 相關(guān)系數(shù)(r)為0.694, 達(dá)到極顯著水平。結(jié)果表明, 分子標(biāo)記SCAR8-107能夠很好地篩選不同馬鈴薯品種的蛋白含量, 此標(biāo)記能應(yīng)用于馬鈴薯蛋白含量的分子標(biāo)記輔助育種。

圖4 SCAR8-107標(biāo)記在部分高蛋白(A)與低蛋白(B)分離后代中的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 4 PCR amplification results of SCAR8-107 marks in partial high protein (A) and low protein (B) progenies

表4 F1群體部分樣品的蛋白含量表型鑒定與標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 4 Identification of phenotype for protein content and statistics of marker test results in partial samples of F1

表5 部分品種蛋白含量表型鑒定與標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 5 Identification of protein phenotype and statistics of marker test results in partial varieties

圖5 SCAR8-107標(biāo)記在部分高蛋白(A)與低蛋白(B)品種中的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 5 PCR amplification results of SCAR8-107 marks in partial high protein (A) and low protein (B) varieties

3 討論

開(kāi)發(fā)并獲得與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記是分子標(biāo)記輔助育種的重要基礎(chǔ), 隨著 AFLP、SSR、SRAP、RAPD等技術(shù)的發(fā)展, 分子標(biāo)記輔助育種的研究進(jìn)程也得到了極大的推動(dòng), Takagi等[15]采用當(dāng)?shù)仄贩N“Hitomebore”進(jìn)行 EMS誘變處理, 產(chǎn)生耐鹽性的突變體(hst1), 運(yùn)用BSA策略與野生親本進(jìn)行全基因組重測(cè)序, 結(jié)合Mutmap分析法, 找到了水稻耐鹽基因(OSRR22), 僅用2年時(shí)間就培育出耐鹽性的水稻新品種; 路洪鳳等[16]采用 BSA混樣策略, 通過(guò)全基因組掃描SNP, 分析差異頻率, 檢測(cè)F2群體早花性狀的QTL, 找到了一個(gè)位于早花的QTL Ef1.1中的候選基因。由于四倍體馬鈴薯減數(shù)分裂的復(fù)雜性以及分子標(biāo)記輔助育種復(fù)雜程度與通量的雙重限制, 導(dǎo)致難以應(yīng)用于規(guī)模較大的分子標(biāo)記輔助育種。本研究利用 BSA混池測(cè)序的方法對(duì)四倍體馬鈴薯進(jìn)行了 SCAR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證。該技術(shù)能夠極大地避免片段大小選擇的過(guò)程,使標(biāo)簽在基因組中的分布更加均勻, 適用于四倍體馬鈴薯等遺傳性多樣、基因組復(fù)雜的染色體片段的挖掘與分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。BSA (Bluk Segregant Analysis)集群分離分析法是一種利用極端性狀進(jìn)行功能基因定位的方法, 比較群體在多態(tài)位點(diǎn)(SNP)的等位基因頻率(AF)是否具有顯著差異。因此, BSA混池測(cè)序的方法在技術(shù)層面上解決了四倍體馬鈴薯標(biāo)記開(kāi)發(fā)困難的問(wèn)題, 實(shí)用性、篩選效率及準(zhǔn)確性都極可靠, 對(duì)四倍體馬鈴薯遺傳育種研究和品種選育都有著重大意義。

分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)能極大地縮短育種年限并且提高育種中目的性狀的準(zhǔn)確性[17]。迄今為止, 抗晚疫病、熟性、抗病毒病、抗青枯病、薯型、炸片顏色、薯肉顏色等十幾個(gè)馬鈴薯重要性狀相繼被標(biāo)記[9,18-23]。但關(guān)于馬鈴薯蛋白質(zhì)含量緊密連鎖的標(biāo)記開(kāi)發(fā)的報(bào)道極少, 因此, 四倍體馬鈴薯蛋白含量分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)對(duì)于四倍體馬鈴薯分子輔助育種有著重要的意義。本研究開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記SCAR8-107在四倍體馬鈴薯品種以及四倍體分離群體 F1代材料中 PCR檢測(cè)結(jié)果與蛋白含量的表型鑒定結(jié)果對(duì)應(yīng)度分別達(dá)到了72.97%和90.51%, 統(tǒng)計(jì)學(xué)上達(dá)到了極顯著水平, 分子標(biāo)記 SCAR8-107與馬鈴薯蛋白含量性狀緊密相關(guān), 可以很好地鑒別四倍體馬鈴薯分離群體子代及馬鈴薯品種的蛋白質(zhì)含量, 對(duì)其進(jìn)行蛋白含量的篩選與輔助選擇。另外, SCAR標(biāo)記在實(shí)際應(yīng)用中更簡(jiǎn)單、有效、更穩(wěn)定, 可以快速穩(wěn)定的鑒定大量的馬鈴薯材料[23]。

分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性是分子輔助選擇的關(guān)鍵, 直接決定著育種的成敗[24]。本研究中, 分子標(biāo)記 SCAR8-107在四倍體分離群體與四倍體品種中有著極高的篩選率, 但是仍有小部分的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與表型的鑒定結(jié)果不一致。存在少量的極端材料與對(duì)應(yīng)的親本擴(kuò)增不一致, 推測(cè)這些極端單株為重組單株, 或因?yàn)閰⒄斩扼w馬鈴薯DM 序列而設(shè)計(jì)的引物, 存在檢測(cè)不完全準(zhǔn)確的問(wèn)題; 其次由于馬鈴薯蛋白含量為數(shù)量性狀, 受許多的微效基因控制, 而這些微效基因也會(huì)影響標(biāo)記的關(guān)聯(lián)度, 本研究尚處前期階段, 只開(kāi)發(fā)了一個(gè)準(zhǔn)確的分子標(biāo)記, 隨著后續(xù)研究的開(kāi)展, 更多相關(guān)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā), 分子標(biāo)記的檢測(cè)將更為精準(zhǔn)可靠。另外馬鈴薯蛋白質(zhì)的含量受組合×地點(diǎn)互作影響顯著[25], 地點(diǎn)的變化也可能導(dǎo)致馬鈴薯蛋白質(zhì)含量細(xì)微變化, 不同品種不同耕作區(qū)域內(nèi)在蛋白質(zhì)含量上也會(huì)產(chǎn)生一定差異。本研究所開(kāi)發(fā)出的SCAR8-107標(biāo)記在用于檢測(cè)的過(guò)程中, 所展現(xiàn)出的微小準(zhǔn)確性的差異可能也受到此原因的影響。此外, 群體規(guī)模較小、氣候原因及表型測(cè)定時(shí)蛋白質(zhì)的損耗也有可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響,因此, 要繼續(xù)利用多年多點(diǎn)田間種植馬鈴薯材料進(jìn)行蛋白含量分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā), 在運(yùn)用分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇時(shí), 要同時(shí)選用多個(gè)與蛋白含量緊密連鎖的分子標(biāo)記同步選擇, 結(jié)果將更為精確可靠。

更正：發(fā)表于本刊 2018, 44(6): 852–858，艾麗娟等 “大豆籽粒硬實(shí)加性和上位性 QTL定位”一文中的圖 3更正為：

圖3 檢測(cè)到的加性QTL及上位性互作QTL在連鎖群上的分布Fig. 3 Location of additive QTLs and epistatic effects QTLs on linkage groups