金明哲，吳湘玉

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 病原生物學(xué)教研室，廣東 珠?！?19041)

B群鏈球菌(group Bstreptococcus,GBS)是一種常見的兼性厭氧革蘭陽性致病菌，有鞭毛、莢膜結(jié)構(gòu)，主要存在于健康人的直腸和生殖道內(nèi)，能夠引起新生兒敗血癥、新生兒腦膜炎，新生兒肺炎，以及在孕婦妊娠期間引發(fā)各種感染病癥[1-2]。美國疾控中心為預(yù)防孕婦和新生兒的GBS感染，規(guī)定孕婦分娩前必須預(yù)防性篩檢GBS，目前美國已在很大程度上有效地降低了孕婦圍產(chǎn)期GBS的感染率[3-4]。長期以來我國對(duì)GBS感染現(xiàn)狀重視不夠，近期國內(nèi)報(bào)道了一些感染GBS導(dǎo)致死亡的病例。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院對(duì)新生兒早發(fā)性血流感染的病原菌進(jìn)行了檢測(cè)，顯示GBS是導(dǎo)致新生兒敗血癥最常見的致病菌[5]。

目前用于GBS檢測(cè)的方法可以分為微生物學(xué)檢測(cè)方法(包括混合血瓊脂培養(yǎng)基和Granada培養(yǎng)基)，免疫學(xué)檢測(cè)方法(包括乳膠凝集法、免疫層析法)，分子生物學(xué)檢測(cè)法(包括全細(xì)胞熒光原位雜交法、核酸擴(kuò)增法)[6-7]。盡管培養(yǎng)法比較耗時(shí)，但由此獲得的純培養(yǎng)物可以進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和進(jìn)一步分型，故而培養(yǎng)法仍然是GBS快速檢測(cè)方法需研究的重要部分；而這類方法的核心通常都是利用GBS較為特異的生物學(xué)性狀，如產(chǎn)生溶血素和色素等重要特征[8-9]。本次研究就是利用GBS在含有血清和淀粉的培養(yǎng)基中可產(chǎn)生橘紅色類胡蘿卜素的特性[10]，運(yùn)用簡單的實(shí)驗(yàn)儀器、實(shí)驗(yàn)技術(shù)和肉眼觀察法，篩選GBS鑒別培養(yǎng)基的最佳配方，并通過干擾試驗(yàn)檢測(cè)其鑒別培養(yǎng)效果，為GBS的快速檢測(cè)提供一項(xiàng)簡單快速的方法選擇。

1　材料與方法

1.1菌株本研究使用的B群鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13813、大腸桿菌ATCC25922、白色念珠菌ATCC10231、表皮葡萄球菌ATCC12228、嗜酸乳桿菌ATCC4356、糞腸球菌ATCC29212、綠膿假單胞菌ATCC27853、陰道加德納菌ATCC14018等，均由珠海美華醫(yī)療器械有限公司惠贈(zèng)。

1.2試劑與儀器可溶性淀粉(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；技術(shù)瓊脂粉(廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司)；營養(yǎng)肉湯(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；精密試紙(上海三愛思試劑有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)。

1.3方法

1.3.1淀粉濃度對(duì)GBS鑒別培養(yǎng)基顯色反應(yīng)的影響按表1配方，精密稱取各試劑，加水至50.0 mL，混勻成淀粉含量不同的GBS鑒別培養(yǎng)基。

表1不同淀粉濃度的GBS鑒別培養(yǎng)基組成成分表

編號(hào)12345678910111213淀粉(g)0.000.250.500.751.001.251.501.752.002.252.502.753.00肉湯(g)0.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.9瓊脂(g)1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0淀粉濃度(%)0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0

將配制好的培養(yǎng)基，121.3 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，待培養(yǎng)基溫度降至50～60 ℃時(shí)，各加入用0.22 μm孔徑濾膜過濾的胎牛血清5.0 mL，各培養(yǎng)基血清終濃度為10%，用1.0 mol/L的NaOH和1.0 mol/L的HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 7.0。分裝，冷卻，制成GBS固體鑒別培養(yǎng)基。置于恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，確定無雜菌污染，備用。

采用分區(qū)化線分離接種法，在不同淀粉濃度的GBS鑒別培養(yǎng)板上接種GBS菌種，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察顯色情況并記錄，確定顯色反應(yīng)最佳的可溶性淀粉濃度為1.0%～2.5%。

1.3.2血清濃度對(duì)GBS鑒別培養(yǎng)基顯色反應(yīng)的影響按表1配方比例配制淀粉濃度2.0%的GBS培養(yǎng)基350 mL，分裝7瓶，每瓶50 mL，編號(hào)1～7。121.3 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，待培養(yǎng)基溫度降至50～60 ℃時(shí)，分別向2～7號(hào)瓶加入過濾除菌的胎牛血清2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL，加血清之前先從2～7號(hào)瓶中吸棄欲加血清等量的培養(yǎng)基溶液，使加入血清后的各瓶培養(yǎng)基仍保持50 mL，1號(hào)瓶不加胎牛血清。用1.0 mol/L的NaOH和1.0 mol/L的HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 7.0。分裝，冷卻，制成不同血清濃度的GBS固體鑒別培養(yǎng)基。置于恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，確定無雜菌污染，備用。

采用分區(qū)化線分離接種法，在不同血清濃度的GBS鑒別培養(yǎng)板上接種GBS菌種，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察顯色情況并記錄，確定顯色反應(yīng)最佳的血清濃度為≥7.0%。

1.3.3pH對(duì)GBS鑒別培養(yǎng)基顯色反應(yīng)的影響按表1配方比例配制淀粉濃度2.0%的GBS培養(yǎng)基368 mL，121.3 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，待培養(yǎng)基溫度降至50～60 ℃時(shí)，加入過濾除菌的胎牛血清32 mL，血清終濃度為8.0%，分裝8瓶，每瓶50 mL，編號(hào)I～VIII。用1.0 mol/L的NaOH和1.0 mol/L的HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，I號(hào)瓶pH 6.4、II號(hào)瓶pH 6.7、III號(hào)瓶pH 7.0、IV號(hào)瓶pH 7.2、V號(hào)瓶pH 7.5、VI號(hào)瓶pH 7.7、VII號(hào)瓶pH 8.0、VIII號(hào)瓶pH 8.5，分裝，冷卻，制成不同pH的GBS固體鑒別培養(yǎng)基。置于恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，確定無雜菌污染，備用。

采用分區(qū)化線分離接種法，在不同pH的GBS鑒別培養(yǎng)板上接種GBS菌種，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察顯色情況并記錄，確定顯色反應(yīng)最佳的pH為7.2～7.7。

1.3.4雜菌對(duì)GBS鑒別培養(yǎng)基顯色反應(yīng)的影響按表1配方比例配制淀粉濃度2.0%的GBS培養(yǎng)基460 mL，121.3 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，待培養(yǎng)基溫度降至50～60 ℃時(shí)，加入過濾除菌的胎牛血清40 mL，血清終濃度為8.0%，用1.0 mol/L的NaOH和1.0 mol/L的HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.5。分裝，冷卻，制成GBS固體鑒別培養(yǎng)基。置于恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，確定無雜菌污染，備用。

分別將表皮葡萄球菌ATCC12228、糞腸球菌ATCC29212、陰道加德納菌ATCC14018、嗜酸乳桿菌ATCC4356、白色念珠菌ATCC10231、大腸桿菌ATCC25922、綠膿假單胞菌ATCC27853，單獨(dú)接種于GBS固體鑒別培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄顯色情況。

不同細(xì)菌在同一培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物不同，兩種不同代謝產(chǎn)物之間有可能發(fā)生反應(yīng)，為了明確觀察GBS鑒別培養(yǎng)基顯色反應(yīng)的各種可能干擾因素，現(xiàn)將上述七種在直腸和生殖道中常見的雜菌與GBS分別作單獨(dú)干擾試驗(yàn)和混合干擾試驗(yàn)，觀察在雜菌干擾情況下，GBS鑒別培養(yǎng)基對(duì)GBS的顯色反應(yīng)情況。分別將7種雜菌與B群鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13813混合于生理鹽水，制成混合菌懸液，編號(hào)1～7號(hào)管，分別為表皮葡萄球菌、糞腸球菌、陰道加德納菌、嗜酸乳桿菌、白色念珠菌、大腸桿菌和綠膿假單胞菌，8號(hào)管將7種雜菌和GBS混合于同一試管制成菌懸液。分別從1～8號(hào)管，無菌操作取混合菌懸液2～3環(huán)，分區(qū)劃線接種法接種于1.3.4項(xiàng)配制備用的GBS固體鑒別培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察顯色情況并記錄。

2　結(jié)果

2.1淀粉濃度對(duì)GBS鑒別培養(yǎng)基顯色反應(yīng)的影響如表2所示：在無淀粉的培養(yǎng)基中GBS菌落顯灰白色；淀粉濃度為0.5%時(shí)，GBS微顯黃色；淀粉濃度在1.0%～2.5%時(shí)，GBS菌落顯色效果最好，橙黃色，此階段的培養(yǎng)基透明度高；淀粉濃度高于3.0%時(shí)，隨著加入淀粉量的增加，培養(yǎng)基的透明度越發(fā)降低，顯色效果也越來越差。

表2淀粉濃度對(duì)GBS鑒別培養(yǎng)基顯色反應(yīng)的影響

編號(hào)12345678910111213淀粉濃度(%)0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0顯色反應(yīng)-++++++++++++++++++++++++

“-”代表灰白色,“+”代表淺黃色,“++”代表黃色,“+++”代表橙黃色。

2.2血清濃度對(duì)GBS鑒別培養(yǎng)基顯色反應(yīng)的影響如表3所示：在無血清時(shí)，GBS菌落顯灰白色；血清濃度為5.0%時(shí)，培養(yǎng)基中GBS菌落呈現(xiàn)淺黃色；血清濃度為6.0%時(shí)培養(yǎng)中GBS顯色程度加深，呈黃色；血清濃度為7.0%、8.0%、9.0%和10.0%時(shí)培養(yǎng)基中GBS顯色最明顯，呈明亮的橙黃色，且當(dāng)血清濃度大于7.0%時(shí)，GBS顯色程度不隨血清濃度的增加而更顯著。

表3血清濃度對(duì)GBS鑒別培養(yǎng)基顯色反應(yīng)的影響

編號(hào)1234567血清濃度(%)0.05.06.07.08.09.010.0顯色反應(yīng)-+++++++++++++++

“-”代表灰白色,“+”代表淺黃色,“++”代表黃色,“+++”代表橙黃色。

2.3pH對(duì)GBS鑒別培養(yǎng)基顯色反應(yīng)的影響如圖1所示：pH 6.4時(shí)，GBS菌落為灰白色；pH 6.7時(shí)，GBS菌落微顯黃色，似有還無；pH 7.0時(shí)，GBS菌落顯黃色；當(dāng)GBS鑒別培養(yǎng)基的pH為7.2～7.7時(shí)，培養(yǎng)中GBS顯色明顯加深，呈橙黃色；pH 8.0時(shí)，GBS菌落顯色較前減弱，呈淺黃色；當(dāng)pH 8.5時(shí)，GBS顯色進(jìn)一步減弱呈微黃色。

圖1　pH對(duì)GBS鑒別培養(yǎng)基顯色反應(yīng)的影響

2.4單一雜菌在GBS鑒別培養(yǎng)基上的顯色反應(yīng)如圖2所示：表皮葡萄球菌、糞腸球菌、陰道加德納菌、嗜酸乳桿菌、白色念珠菌、大腸桿菌在GBS鑒別培養(yǎng)基上的菌落顏色均呈灰白色或淺黃色，綠膿假單胞菌在GBS鑒別培養(yǎng)基上的菌落顏色呈淺綠色，上述幾種菌落顏色與此培養(yǎng)基上的典型GBS菌落的橙黃色有顯著性差異。

A:表皮葡萄球菌；B：糞腸球菌；C：陰道加德納菌；D：嗜酸乳桿菌；E：白色念珠菌；F：大腸桿菌；G：綠膿假單胞菌；H：GBS。圖2　單一雜菌在GBS鑒別培養(yǎng)基上的顯色反應(yīng)結(jié)果

2.5雜菌干擾試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：圖中標(biāo)號(hào)1～6，分別是表皮葡萄球菌、糞腸球菌、陰道加德納菌、嗜酸乳桿菌、白色念珠菌、大腸桿菌，這6種雜菌的單獨(dú)干擾試驗(yàn)，在1～6號(hào)培養(yǎng)基上都能觀察到明顯的橙黃色菌落；7號(hào)培養(yǎng)基是綠膿假單胞菌的干擾試驗(yàn)，因綠膿假單胞菌分泌銅綠色素，故在7號(hào)培養(yǎng)基1區(qū)細(xì)菌密集生長處，GBS的顯色被干擾，不易發(fā)現(xiàn)，但在7號(hào)培養(yǎng)基3區(qū)還是能觀察到GBS的橙黃色單個(gè)菌落；8號(hào)培養(yǎng)基，七種在人類直腸和生殖道中常見的雜菌和GBS都有生長，在8號(hào)培養(yǎng)基1區(qū)細(xì)菌密集生長處，GBS的顯色也被綠色干擾，不易發(fā)現(xiàn)橙黃色，但在8號(hào)培養(yǎng)基3區(qū)同樣能觀察到GBS的橙黃色單個(gè)菌落。

圖3　雜菌干擾試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)國內(nèi)GBS感染主要集中于孕婦、新生兒兩類群體，而在非孕婦成年人群體中引發(fā)感染相對(duì)較少。由于GBS在攜帶者體內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)任何癥狀，只有通過必要的檢測(cè)，才能判斷人體內(nèi)是否攜帶有這種細(xì)菌，因此對(duì)于孕婦而言，對(duì)其進(jìn)行GBS篩檢顯得尤為重要。目前GBS快速檢測(cè)法也有抗原檢測(cè)法和核酸檢測(cè)法，但這兩種方法對(duì)儀器設(shè)備以及操作人員有嚴(yán)格的技術(shù)要求[11-13]，不易推廣。因此簡便快速的GBS鑒別培養(yǎng)法成為GBS篩檢研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

本研究根據(jù)GBS與淀粉反應(yīng)呈現(xiàn)類胡蘿卜素的特性，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的可溶性淀粉、不同濃度的血清及不同的pH值，培養(yǎng)繁殖B群鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，觀察培養(yǎng)基的顯色反應(yīng)，從而確定當(dāng)可溶性淀粉濃度在1.0%～2.5%，血清濃度≥7.0%，pH為7.2～7.7時(shí)，GBS固體鑒別培養(yǎng)基上的B群鏈球菌顯色反應(yīng)最明顯，呈現(xiàn)的特異性顏色為橙黃色。由于臨床中待檢的GBS標(biāo)本中一定會(huì)有直腸或生殖道中的其他雜菌污染，所以用直腸和生殖道中常見的雜菌進(jìn)行干擾試驗(yàn)，觀察干擾菌是否影響GBS在鑒別培養(yǎng)基上的顯色反應(yīng)，以此檢測(cè)GBS鑒別培養(yǎng)基的特異性鑒別作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表皮葡萄球菌、糞腸球菌、陰道加德納菌、嗜酸乳桿菌、白色念珠菌、大腸桿菌、綠膿假單胞菌等直腸和生殖道中常見的雜菌，在GBS鑒別培養(yǎng)基上的菌落顏色分別呈現(xiàn)灰白色或淺黃色或淺綠色，與GBS菌落的橙黃色有顯著性差異；且雜菌與GBS混合培養(yǎng)后，在可觀察分散菌落處，GBS的橙黃色菌落仍可被輕松地觀察到，不會(huì)被其他雜菌干擾。

綜上所述，由本研究可知：可溶性淀粉濃度1.0%～2.5%，血清濃度≥7.0%，pH為7.2～7.7的GBS固體鑒別培養(yǎng)基適用于B群鏈球菌的檢測(cè)，且操作簡便、特異性高。