朱　繁　王麗霞　賈杏林　尹　佳　楊煥勝2,*　印遇龍2,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410125；3.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與人體健康實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410081)

仔豬早期隔離斷奶技術(shù)已在當(dāng)代養(yǎng)豬業(yè)得到廣泛應(yīng)用[1-4]，因?yàn)樽胸i早期斷奶不但可以縮短母豬的繁殖周期，增加母豬年分娩次數(shù)和分娩欄舍利用率，還能夠降低母源疾病向仔豬垂直傳播，改善仔豬健康狀況和提高生長(zhǎng)性能[2-5]。然而，早期斷奶仔豬消化系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，斷奶應(yīng)激常會(huì)導(dǎo)致仔豬消化功能紊亂、抗病能力減弱、生長(zhǎng)遲緩，甚至造成斷奶仔豬死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)是一種由53個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，主要由頜下腺、十二指腸布路納氏(Brunner)腺和胰腺等分泌并釋放至十二指腸液、唾液、胰液、血液和乳汁中[6-7]。EGF是一種在母乳中發(fā)現(xiàn)的含量最高且對(duì)仔豬腸道發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用的肽類物質(zhì)[7-9]。研究表明，EGF通過與腸黏膜受體結(jié)合能夠改善早期斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和生長(zhǎng)性能[9-15]。飼糧中添加外源EGF可降低斷奶仔豬腹瀉率[16]，提高免疫力[14]和生長(zhǎng)性能[16-17]，促進(jìn)腸道發(fā)育[12,18-19]。

然而，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)EGF對(duì)斷奶仔豬腸道氨基酸組成、血清游離氨基酸含量以及血清生化指標(biāo)的影響鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬血清游離氨基酸含量、腸道黏膜氨基酸組成和血清生化指標(biāo)的影響，旨在為EGF在生豬養(yǎng)殖中進(jìn)一步推廣和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)動(dòng)物和分組設(shè)計(jì)

選取體重為(6.40±0.44) kg的21日齡“杜×長(zhǎng)×大”斷奶仔豬42頭，隨機(jī)分成3組，每組14個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭仔豬。Ⅰ組(對(duì)照組)飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，Ⅱ組和Ⅲ組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加200和400 μg/kg EGF?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1，EGF預(yù)混劑以噴霧干燥卵黃抗體為載體，含量為4 000 mg/kg，由賽法特(長(zhǎng)沙)生物技術(shù)有限公司提供。

1.2　飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動(dòng)物房進(jìn)行，飼養(yǎng)前動(dòng)物房先后使用NaOH水溶液及菌毒敵消毒液浸泡消毒，然后用清水沖凈后徹底干燥。欄舍為封閉式漏縫地板，仔豬單欄飼養(yǎng)，自由采食，鴨嘴式飲水器自由飲水。每頭仔豬使用單獨(dú)的小桶盛裝飼料且以每天第1次喂料前與當(dāng)天飼料桶內(nèi)和料槽內(nèi)飼料的重量差作為當(dāng)天的采食量，每7 d稱量1次體重，用以計(jì)算平均日采食量、平均日增重和料重比。觀察仔豬的食欲精神狀況，保持圈內(nèi)自然通風(fēng)。試驗(yàn)期14 d。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet：VA 10 000 IU，VD 1 000 IU，VE 380 IU，VK32.0 mg，VB120.03 mg，VB212 mg，煙酸 nicotinic acid 40 mg，泛酸 pantothenic acid 25 mg，生物素 biotin 0.25 mg，葉酸 folic acid 1.6 mg，硫胺素 thiamine 3.0 mg，VB62.25 mg，F(xiàn)e (FeSO4) 150 mg，Zn (ZnSO4) 100 mg，Mn (MnSO4) 30 mg，Cu (CuSO4) 25 mg，I (KIO3) 0.5 mg，Co (CoSO4) 0.3 mg，Se (Na2SeO3) 0.3 mg，抗氧化劑 antioxidants 4.0 mg。

2)營(yíng)養(yǎng)水平為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values.

1.3　樣品采集

試驗(yàn)第7天和第14天各組隨機(jī)選取仔豬7頭，前腔靜脈采血10 mL后靜脈(頸靜脈)注射4%戊巴比妥鈉溶液[1]，仔豬麻醉后進(jìn)行屠宰取樣。仔豬屠宰后打開腹腔，取出胃腸道，按組織學(xué)把小腸劃分為十二指腸、空腸和回腸，迅速取空腸中段和回腸中段黏膜樣品，液氮速凍后于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。血液樣品室溫靜置2 h后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min分離血清。然后將血清樣品立即儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中，用以分析氨基酸含量及血清生化指標(biāo)。

1.4　測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1血清生化指標(biāo)

血清生化指標(biāo)使用試劑盒測(cè)定，所用試劑盒購(gòu)自湖南永和陽光生物科技股份有限公司，所用儀器為東芝全自動(dòng)生化分析儀(TBA-120FR)。

1.4.2血清游離氨基酸含量

取600 μL血清注入1.5 mL離心管中，隨后加入等體積8%磺基水楊酸，充分混勻，4 ℃沉淀過夜。取出離心管10 000 r/min、4 ℃離心10 min。使用移液槍將上清吸出至新的1.5 mL離心管中，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至上樣瓶中，然后使用日立L-8900型氨基酸分析儀測(cè)定血清游離氨基酸含量。

1.4.3黏膜水解氨基酸

黏膜樣品經(jīng)液氮研磨成粉末后取0.1 g裝入安瓿瓶中，然后向安瓿瓶中加入10 mL濃度為6 mol/L的鹽酸。隨后用酒精噴燈將安瓿瓶封口，置于110 ℃烘箱中24 h，使樣品充分酸水解。然后將安瓿瓶中水解液移至100 mL容量瓶中，用雙蒸水沖洗安瓿瓶數(shù)次，用雙蒸水定容至容量瓶至刻度線，充分搖勻。取1 mL定容后樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后加入上樣瓶中，然后使用日立L-8900型氨基酸分析儀測(cè)定氨基酸含量。

1.5　數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，經(jīng)F檢驗(yàn)組間差異顯著后再用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以分析EGF對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)、血清游離氨基酸和黏膜水解氨基酸含量的影響。P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為差異有顯著的趨勢(shì)。

2　結(jié)　果

2.1　飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和血清生化指標(biāo)的影響

由表2可知，飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬平均日增重、平均日采食量和料重比沒有顯著影響(P>0.05)。

表2　飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

由表3可知，斷奶后7 d，飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬血清尿酸和免疫球蛋白A(IgA)含量有顯著影響(P<0.05)。與Ⅰ組相比，Ⅱ組斷奶仔豬血清尿酸含量顯著升高(P<0.05)，Ⅱ組、Ⅲ組斷奶仔豬血清IgA含量顯著降低(P<0.05)。斷奶后14 d，飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬血清肌酐含量、谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶值有顯著影響(P<0.05)。與Ⅰ組相比，Ⅱ組斷奶仔豬血清肌酐含量顯著降低(P<0.05)；與Ⅰ組和Ⅱ組相比，Ⅲ組斷奶仔豬血清谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶值顯著降低(P<0.05)。各組之間其余指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)。

表3　飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

2.2　飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬血清游離氨基酸含量的影響

由表4可知，斷奶后7 d，Ⅲ組斷奶仔豬血清?；撬?、丙氨酸、瓜氨酸和組氨酸含量顯著高于Ⅱ組(P<0.05)，但Ⅲ組與Ⅰ組、Ⅱ組與Ⅰ組之間沒有顯著差異(P>0.05)。與Ⅰ組和Ⅲ組相比，Ⅱ組斷奶仔豬血清絲氨酸、谷氨酸和精氨酸含量顯著降低(P<0.05)，血清天冬氨酸和脯氨酸含量有降低趨勢(shì)(P<0.10)，各組之間其他血清氨基酸含量無顯著差異(P>0.05)。斷奶后14 d，Ⅱ組斷奶仔豬血清血清瓜氨酸含量與Ⅰ組和Ⅲ組相比有升高趨勢(shì)(P<0.10)，各組之間其他血清氨基酸含量無顯著差異(P>0.05)。

表4　飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬血清游離氨基酸含量的影響

2.3　飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬空腸和回腸黏膜水解氨基酸含量的影響

由表5可知，斷奶后7 d，飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜水解氨基酸含量無顯著影響(P>0.05)。斷奶后14 d，Ⅱ組斷奶仔豬空腸黏膜纈氨酸含量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)；與Ⅰ組和Ⅲ組相比，Ⅱ組斷奶仔豬空腸黏膜絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、組氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸含量有升高趨勢(shì)(P<0.10)；各組之間其他氨基酸含量無顯著差異(P>0.05)。

表5　飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜水解氨基酸含量的影響

由表6可知，斷奶后7 d，飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜水解氨基酸含量無顯著影響(P>0.05)。斷奶后14 d，Ⅱ組斷奶仔豬回腸黏膜半胱氨酸含量顯著高于Ⅰ組和Ⅲ組(P<0.05)，且Ⅱ組回腸黏膜組氨酸含量也有高于Ⅰ組和Ⅲ組的趨勢(shì)(P<0.10)，各組之間其他氨基酸含量無顯著差異(P>0.05)。

3　討　論

3.1　飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和血清生化指標(biāo)的影響

血液是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，是機(jī)體與外界環(huán)境以及體內(nèi)各組織之間物質(zhì)交換的媒介[20]。由于本試驗(yàn)的目的主要偏重于EGF對(duì)斷奶仔豬生理代謝的影響，試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量較小，雖然各組之間在生長(zhǎng)性能上具有一定的差異，但是并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。尿酸是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，先由嘌呤核苷酸水解成鳥嘌呤和腺嘌呤，隨后經(jīng)脫氨作用而生成黃嘌呤，再氧化形成尿酸[21]。豬體內(nèi)含有的尿酸酶能將尿酸氧化成為尿囊素，隨尿液排出體外，使血液中的尿酸含量始終維持穩(wěn)定水平。在本次試驗(yàn)當(dāng)中，200 μg/kg EGF組斷奶7 d后仔豬血清中尿酸含量有短暫升高的情況，而400 μg/kg EGF組無此情況，說明EGF對(duì)斷奶仔豬血清尿酸含量與添加劑量有關(guān)。由于EGF由小肽構(gòu)成，不能被動(dòng)物體吸收，主要作用于動(dòng)物腸道黏膜。因此，飼糧中添加EGF可能通過調(diào)節(jié)仔豬腸道消化吸收或代謝功能影響機(jī)體嘌呤代謝，從而調(diào)節(jié)尿酸生成。筆者查閱前人對(duì)EGF的研究結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)EGF影響機(jī)體尿酸生成的試驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)有必要進(jìn)一步闡明飼糧中添加EGF影響尿酸生成的內(nèi)在機(jī)制。血液肌酐是檢測(cè)腎功能的常用指標(biāo)，其含量可反映腎小球?yàn)V過能力。與對(duì)照組相比，飼糧中添加400 μg/kg EGF能夠顯著降低斷奶后14 d仔豬血清肌酐含量，表明飼糧中添加EGF可能會(huì)提高仔豬腎小球?yàn)V過能力。血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶值是反映肝功能的指標(biāo)，當(dāng)干細(xì)胞受到損傷時(shí)，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶值會(huì)升高，飼糧中添加400 μg/kg EGF能夠顯著降低血清谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶值，表明飼糧中添加EGF可能對(duì)肝臟具有保護(hù)作用。血清IgA含量是反映仔豬免疫能力的指標(biāo)[22]，與對(duì)照組相比，飼糧中添加200或400 μg/kg EGF能夠顯著降低斷奶7 d仔豬血清IgA含量，表明EGF可能降低仔豬免疫反應(yīng)。因此，飼糧中添加EGF能夠調(diào)節(jié)仔豬機(jī)體代謝、肝腎功能和免疫能力，但是EGF的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

表6　飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜水解氨基酸含量的影響

續(xù)表6項(xiàng)目Items時(shí)間Time/d組別 GroupsⅠⅡⅢP值P-value苯丙氨酸70.54±0.080.50±0.080.54±0.070.639Phe140.56±0.060.63±0.120.55±0.090.256賴氨酸 70.91±0.170.87±0.100.93±0.110.794Lys141.04±0.121.13±0.250.98±0.180.864組氨酸 70.33±0.050.30±0.040.32±0.060.468His140.33±0.040.37±0.060.31±0.050.063精氨酸 70.81±0.140.78±0.080.87±0.210.588Arg140.91±0.130.95±0.210.82±0.120.106

3.2　飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬血清游離氨基酸及黏膜水解氨基酸含量的影響

血液中氨基酸的含量受多種因素影響，如環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)以及疾病等。由于血清游離氨基酸直接參與機(jī)體氨基酸的代謝及蛋白質(zhì)沉積，所以其含量可用來反映動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)狀況[23]。腸道是一個(gè)高營(yíng)養(yǎng)需求的組織，其能量消耗、蛋白質(zhì)和氨基酸需求相對(duì)于組織重量遠(yuǎn)高于機(jī)體平均水平。一方面，腸道上皮細(xì)胞的快速更新需要大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成細(xì)胞組分；另一方面，小腸上皮吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需要消耗大量能量。飼糧中添加EGF能夠調(diào)節(jié)仔豬腸道上皮細(xì)胞更新，從而增加腸道絨毛高度和隱窩深度。本試驗(yàn)結(jié)果表明：斷奶后14 d，200 μg/kg EGF組空?qǐng)龊突啬c黏膜大部分水解氨基酸含量高于對(duì)照組和400 μg/kg EGF組，而200 μg/kg EGF組血清大部分氨基酸含量低于對(duì)照組和400 μg/kg EGF組。因此，飼糧中添加低劑量EGF可能通過改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)增加黏膜氨基酸沉積，進(jìn)而降低了血液氨基酸含量。進(jìn)一步需要研究腸道氨基酸代謝與腸道上皮細(xì)胞更新之間的關(guān)系，以及飼糧中添加EGF對(duì)斷奶仔豬氨基酸需要量的影響。

4　結(jié)　論

飼糧中添加高劑量EGF能夠降低血清IgA等生化指標(biāo)含量，而飼糧中添加低劑量EGF能夠降低血清和小腸黏膜部分氨基酸含量。