陳　煉　吳成龍　張易祥　邵仙萍　陳書健　王春琳　葉金云*

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，應(yīng)用海洋生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211; 2.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州 313000)

維生素A是維持魚類生長所必需的脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)之一，它參與了細(xì)胞分化、骨骼發(fā)育、繁殖以及免疫等魚類的多個(gè)重要生理過程[1-2]。維生素A缺乏或者過量會(huì)對(duì)魚類生長產(chǎn)生不良影響[3]。若魚類飼料中缺乏維生素A或其前體——類胡蘿卜素，可能導(dǎo)致其出現(xiàn)視力障礙、眼眶和鰭部出血、鰓蓋變形以及死亡率增加等明顯的癥狀[2-4]。如果魚類攝食過量的維生素A，其肝臟和其他脂肪組織中則容易積累維生素A[5]，導(dǎo)致魚類脊柱損傷[6]、生長緩慢[7]以及繁殖能力下降[2]等。

近些年來，有關(guān)維生素A最適需求量已經(jīng)在草魚(CtenopharyngodonIdellus)[8]、玳瑁石斑(Epinephelustauvina)[9]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[4]、羅非魚(Oreochromisniloticus)[10]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[11]和大口黑鱸(Micropterussalmoides)[12]等魚類上報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，維生素A對(duì)魚類的視覺功能、上皮細(xì)胞分化、骨骼發(fā)育、脂質(zhì)代謝以及免疫功能都有重要的作用[1,12-15]。同其他脊椎動(dòng)物一樣，魚類自身不能合成維生素A[15]，且對(duì)維生素A的需求受品種、個(gè)體大小、年齡以及環(huán)境因子的影響[2]。因此，探究水產(chǎn)動(dòng)物飼料中適宜維生素A的含量對(duì)魚類生長、代謝和免疫功能具有重要的指導(dǎo)意義。

青魚(Mylopharyngodonpiceus)是我國傳統(tǒng)的“四大家魚”中唯一肉食性經(jīng)濟(jì)魚類，由于其具有增強(qiáng)體質(zhì)、延緩衰老、補(bǔ)氣養(yǎng)胃等營養(yǎng)價(jià)值而被廣泛養(yǎng)殖[16]。目前，關(guān)于青魚營養(yǎng)學(xué)物質(zhì)需求量的研究主要涉及脂肪[17]、糖[18-20]、蛋白質(zhì)和氨基酸[20]以及礦物質(zhì)[21]等，而對(duì)維生素這種微量元素需求量的探究仍然很缺乏。關(guān)于青魚飼料中添加適量維生素從而提高其生長和免疫的報(bào)道中主要包括維生素C[22]、維生素D[23]和維生素E[24]，而有關(guān)維生素A的相關(guān)報(bào)道甚少。本研究以青魚幼魚作為主要試驗(yàn)對(duì)象，研究了飼料中不同含量的維生素A對(duì)青魚幼魚生長、代謝、抗氧化能力的影響，同時(shí)探討不同維生素A含量對(duì)青魚幼魚免疫能力的影響，為青魚幼魚的人工配合飼料中維生素A添加量提供參考，為青魚營養(yǎng)全面和價(jià)格合理的人工配合飼料開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以無維酪蛋白和明膠為蛋白質(zhì)源，以糊精為糖源，以豆油和卵磷脂為脂肪源，同時(shí)添加氨基酸混合物、礦物質(zhì)預(yù)混料以及不含維生素A的維生素預(yù)混料等制成基礎(chǔ)飼料，飼料1～5中維生素A添加量分別為0、1 000、2 000、4 000、8 000、16 000 IU/kg，經(jīng)過高效液相色譜法(Agilent-1100，Agilent，美國)檢測(cè)后的實(shí)際含量分別為290、1 033、1 734、3 835、7 662和14 943 IU/kg。試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。使用萬能粉碎機(jī)將原粉碎，過篩，保證在40目以上，準(zhǔn)確稱取各種原料后進(jìn)行充分混勻，將混合均勻的飼料原料用雙螺桿擠條機(jī)加工制成直徑為1.5 mm的條狀，冷凍后切割為2～3 mm的顆粒，于40 ℃熱空氣烘箱中干燥烘干，最后將飼料裝在雙層的塑料袋中密封，置于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items飼料 Diets123456粗蛋白質(zhì) CP38.8138.5838.2538.8838.9238.36粗脂肪 EE4.985.095.104.935.115.09粗灰分 Ash2.582.652.592.612.652.67總能 Gross energy/(MJ/kg)14.9714.9314.8914.8314.8114.86

1)西格瑪化工，美國 Sigma Chemical, USA。

2)化學(xué)試劑國藥控股有限公司 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.。

3)氨基酸混合物為每千克飼料提供 Amino acid mixture supplied the following for per kg of diets：賴氨酸 lysine 2.7 g，蛋氨酸 methionine 1 g，精氨酸 arginine 10.3 g。

4)中糧食品營銷有限公司 Food Sales & Distribution Co., Ltd.。

5)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼料提供Mineral mixture provided the following for per kg of diets：NaCl 100 mg，MgSO4·7H2O 1 200 mg，Ca(H2PO4)2·H2O 3 g，F(xiàn)eSO4·H2O 80 mg，ZnSO4·H2O 50 mg，MnSO4·H2O 65 mg，CuSO4·5H2O 10 mg，CoCl2·6H2O (1%) 50 mg，KI 0.8 mg，Na2SeO30.8 mg，沸石 zoelite 6.45 g。

6)維生素預(yù)預(yù)混料為每千克飼料提供Vitamin premix provided the following for per kg of diets：硫胺素 thiamin 25 mg，核黃素 riboflavin 45 mg，吡哆醇 pyridoxine 20 mg，VB120.2 mg，VK310 mg，肌醇 inositol 800 mg，泛酸 pantothenic acid 60 mg，煙酸 niacin acid 100 mg，葉酸 folic acid 20 mg，生物素 biotin 10 mg，VD33 mg，α-生育酚 α-tocopherol 300 mg，抗壞血酸ascorbic acid 1 g，微晶纖維素 microcrystalline cellulose 2.45 g。

7)浙江一星飼料集團(tuán)有限公司ZhejiangYixingFeed Group Co., Ltd.。

8)誘食劑成分 Attractant composition：?；撬?taurine∶甜菜堿-鹽酸 betain-HCl∶甘氨酸 glycine=1∶3∶3。

9)計(jì)算值 Calculated values。

1.2　試驗(yàn)魚及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選取個(gè)體規(guī)格相近、體質(zhì)健壯的青魚幼魚540尾，初始體重為(5.35±0.16)g。將其隨機(jī)分成6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)青魚幼魚30尾。試驗(yàn)在馴化1周后進(jìn)行，馴化期間，每天投喂維生素A缺乏組(290 IU/kg組)飼料2次，分別在08:00和17:00，日投喂量為每組魚體重的3%。養(yǎng)殖期間每日觀察青魚幼魚的體征變化，記錄攝食情況和死亡率。飼養(yǎng)期為60 d，試驗(yàn)期間每天換1次水，每次換水量為1/3，所換的水來自人工蓄水池中至少曝氣1 d的水，且均是反復(fù)循環(huán)狀態(tài)的流動(dòng)水，水溫為26～33 ℃，光照與自然光照同步，pH在7.2左右，溶氧濃度為5.8 mg/L以上。

1.3　樣品采集以及分析

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，停止喂食24 h以排空腸道內(nèi)容物，統(tǒng)計(jì)各缸內(nèi)青魚幼魚總數(shù)，然后稱其總重量，并在其中隨機(jī)選取5條，稱量體重和體長并記錄，解剖取其血液和肝臟，并且稱取肝臟重量，然后迅速投入到液氮罐中，之后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存。

試驗(yàn)飼料和全魚粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分和水分含量檢測(cè)方法如下：采用凱氏定氮法(Kjeltec-2200,FOSS，丹麥)測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量；采用索氏抽提法(SoxtecTM-2043,FOSS，丹麥)測(cè)定粗脂肪含量；采用105 ℃恒溫烘干失重法測(cè)定水分含量；采用馬弗爐550 ℃ 14 h灼燒法測(cè)定粗灰分含量。飼料以及全魚中的維生素A含量采用高效液相色譜法檢測(cè)，每個(gè)樣品測(cè)定2次。

肝臟α淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶等消化酶以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶(GST)等抗氧化相關(guān)酶活性的檢測(cè)均采用南京建成生物工程研究所商品化檢測(cè)試劑盒。肝臟丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)，血清溶菌酶(LYZ)活性及補(bǔ)體3(C3)和補(bǔ)體4(C4)含量也是采用南京建成生物工程研究所商品化檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

1.4　組織總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)

1.4.1引物設(shè)計(jì)

采用Primer5.0和Oligo7.0軟件共同設(shè)計(jì)LYZ、干擾素α(INFα)、鐵調(diào)素(HEPC)、天然抗性相關(guān)巨噬蛋白(NRAMP)、C3和補(bǔ)體9(C9)等非特異性免疫基因的實(shí)時(shí)定量PCR引物(表2)。所有引物均由上海博尚生物科技有限公司合成。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為管家基因，驗(yàn)證各組織表達(dá)穩(wěn)定性。

1.4.2總RNA的提取

血細(xì)胞總RNA采用TRIZOL試劑(Invitogen)提取，并用1%瓊脂糖變性膠來檢測(cè)總RNA的提取質(zhì)量。利用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)，以3 μg總RNA為模板，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s反轉(zhuǎn)合成cDNA。cDNA保存在-20 ℃用于基因檢測(cè)。

1.4.3實(shí)時(shí)定量PCR

實(shí)時(shí)定量PCR過程參考Wu等[25]。反應(yīng)在實(shí)時(shí)定量PCR儀(cfx96,Bio-Rad，美國)上進(jìn)行，體系總體積是25 μL，其中包括1 μL的cDNA溶液，12.5 μL 2×SYBR Green Ⅰ Realtime PCR Master Mix(TaKaRa，日本)，正向引物0.2 μmol/L和反向引物0.2 μmol/L，補(bǔ)充加入雙蒸水至25 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，59℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)相對(duì)定量采用2-ΔΔCt法[26]。

表2　實(shí)時(shí)定量PCR引物

1.5　計(jì)算公式

試驗(yàn)魚的增重率(weight gain rate,WGR)、特定生長率(specific growth rate,SGR)、成活率(survival rate,SR)、飼料轉(zhuǎn)化效率(feed conversion ratio,FCR)、肝體比(hepatosomatic index,HSI)、蛋白質(zhì)效率(protein efficiency ratio,PER)、肥滿度(condition factor,CF)計(jì)算公式如下：

WGR(%)=100×(終末均重-
初始均重)/初始均重；
SGR(%/d)=100×(ln終末均重-
ln初始均重)/試驗(yàn)天數(shù)；
SR(%)=100×試驗(yàn)結(jié)束魚尾數(shù)/
試驗(yàn)開始魚尾數(shù)；
FCR=魚體增重(濕重)/飼料攝取量；
HSI=100×肝重/體重；
CF=100×末體重/末體長3；
PER=100×體重增加量(g)/
飼料蛋白質(zhì)攝取量(g)。

1.6　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)所獲得各項(xiàng)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差(one-way ANOVA)分析，差異顯著時(shí)，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1　維生素A對(duì)青魚幼魚生長性能和體組成的影響

表2顯示，飼料中維生素A含量為290 IU/kg，青魚幼魚的WGR和SGR顯著低于其他各組(P<0.05)。隨著飼料中維生素A含量的增加，WGR、SGR和PER都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，并在維生素A為3 835 IU/kg時(shí)達(dá)到最高值。隨著飼料維生素A含量的增加，HSI呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，之后又逐漸升高；飼料維生素A含量為290 IU/kg時(shí)，HSI與1 033 IU/kg組相比較比差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他各組(P<0.05)。飼料維生素A含量的不同對(duì)CF沒有造成顯著影響(P>0.05)。隨著飼料中維生素A含量的增加，F(xiàn)CR呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，在維生素A含量為7 662 IU/kg時(shí)獲得最低值，但在飼料中維生素A含量為1 734～14 943 IU/kg的各組之間沒有顯著差異(P>0.05)。隨著飼料中維生素A含量的增加，SR先升高后降低，且在飼料維生素A含量為1 033～14 943 IU/kg的各組間差異不顯著(P>0.05)，同時(shí)在維生素A含量為7 662 IU/kg時(shí)獲得最高SR。

維生素A含量對(duì)青魚幼魚體組成的水分、粗脂肪和粗灰分含量沒有顯著影響(P>0.05)。隨著飼料中維生素A含量的增加，青魚幼魚的粗蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且在飼料維生素A含量為7 662 IU/kg時(shí)，達(dá)到最高值，顯著高于290 IU/kg組(P<0.05)。

通過折線模型分析，得到青魚幼魚WGR(y)與飼料中維生素A含量(x)效應(yīng)折線關(guān)系為：y=0.104 3x+156.54，R2=0.953 5；y=-0.005 9x+404.12，R2=0.970 5。由此得出，青魚幼魚的維生素A需求量為2 246.64 IU/kg(圖1)。

表3　維生素A對(duì)青魚幼魚生長性能和體組成的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same row with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2　維生素A對(duì)青魚幼魚肝臟代謝酶活性和抗氧化能力的影響

表4顯示，肝臟中的α淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶活性都隨著飼料中維生素A含量的升高而出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，α淀粉酶和彈性蛋白酶活性均在3 835 IU/kg組達(dá)到最高值，胰蛋白酶和糜蛋白酶活性均在7 662 IU/kg組獲得最大值。且這4種代謝酶活性在3 835 IU/kg組和7 662 IU/kg組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

表5顯示，隨著飼料維生素A含量的增加，肝臟CAT、GPx、GR活性和T-AOC都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)；飼料維生素A含量為3 835 IU/kg時(shí)，肝臟T-AOC達(dá)到最大值。飼料維生素A含量為7 662 IU/kg時(shí)，肝臟CAT、GPx和GR活性獲得最高值。肝臟SOD活性隨著飼料維生素A含量的增加呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢(shì)，并在14 943 IU/kg組達(dá)到最高值，與290、1 033、1 734 IU/kg組差異顯著(P<0.05)。肝臟GST活性和MDA含量隨著飼料維生素A含量的增加均呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，并在3 835 IU/kg組達(dá)到最低值。在3 835 IU/kg組和7 662 IU/kg組間，肝臟中抗氧化指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。

圖1　飼料維生素A含量與青魚幼魚增重率的關(guān)系

2.3　維生素A對(duì)青魚幼魚非特異性免疫能力的影響

表6顯示，血清中LYZ活性及C3和C4含量都隨著飼料維生素A含量的升高而出現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)，其中血清LYZ活性和C3含量在3 835 IU/kg組達(dá)到最高值，血清C4含量在7 662 IU/kg組獲得最大值。

圖2顯示，血細(xì)胞中LYZ基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并在3 835 IU/kg組達(dá)最高，顯著高于其他各組(P<0.05)，但在1 734、7 662和14 943 IU/kg組間無顯著差異(P>0.05)。INFα基因表達(dá)量在1 734 IU/kg組到達(dá)最高值，與3 835和7 662 IU/kg組沒有顯著差異(P>0.05)，顯著高于其他各組(P<0.05)。HEPC基因的表達(dá)量在飼料維生素A含量為1 734～14 943 IU/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)，但在1 734 IU/kg組達(dá)到最高值，且與290和1 033 IU/kg組差異顯著(P<0.05)。NRAMP基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，并在1 734 IU/kg組獲得最高值，顯著高于其他各組(P<0.05)。C3基因表達(dá)量在1 734 IU/kg組到達(dá)最高值，但與3 835和7 662 IU/kg組間無顯著差異(P>0.05)，顯著高于其他各組(P<0.05)。290 IU/kg組C9基因表達(dá)量顯著低于其他各組(P<0.05)，并在7 662 IU/kg組到最高值，但在1 734、7 662和14 943 IU/kg組之間無顯著差異(P>0.05)。

表4　維生素A對(duì)青魚幼魚肝臟代謝酶活性的影響

表5　飼料中添加維生素A對(duì)青魚幼魚肝臟抗氧化能力的影響

續(xù)表5項(xiàng)目Items飼料維生素A含量 Dietary vitamin A content/(IU/kg)2901 0331 7343 8357 66214 943過氧化氫酶 CAT/(U/mg prot)17.79±1.21a21.77±2.10b26.85±2.39c29.64±2.11cd32.45±1.80d27.19±1.27c谷胱甘肽過氧化物酶 GPx/(U/mg prot)341.56±26.06a387.62±34.09ab469.33±23.21bc558.34±66.74d572.75±70.15d515.21±33.00cd谷胱甘肽還原酶 GR/(U/g prot)113.20±11.29a148.00±20.92ab148.30±19.86ab177.02±18.48bc211.40±27.93c162.79±24.18b谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶 GST/(U/mg prot)3 127.95±73.95c2 940.60±124.74abc2 825.24±66.31ab2 716.00±130.51a2 729.37±196.69a3 038.70±198.52bc丙二醛 MDA/(nmol/mg prot)13.22±1.80c10.54±0.88b8.46±0.93ab7.97±1.29a8.53±0.84ab9.30±1.24ab總抗氧化能力 T-AOC/(U/mg prot)2.59±0.30a3.16±0.24b3.64±0.35bc3.98±0.36c3.92±0.27c3.69±0.14bc

表6　維生素A對(duì)青魚幼魚血清免疫指標(biāo)的影響

3　討　論

3.1　維生素A對(duì)青魚幼魚生長性能和體組成的影響

本研究結(jié)果顯示，維生素A是促進(jìn)青魚幼魚生長的必需營養(yǎng)素，能夠顯著影響青魚幼魚的WGR、SGR、HSI、PER、FCR和SR等指標(biāo)，這與在其他魚類中研究結(jié)果一致[4,8,12,27-28]。本研究以WGR為指標(biāo)，采用折線模型分析，得出青魚幼魚的維生素A需求量為2 246.64 IU/kg，這與玳瑁石斑[9]和虹鱒[29]、大口黑鱸[12]、花鱸(Lateolabraxjaponicus)[30]和團(tuán)頭魴[4]等肉食性魚類對(duì)飼料維生素A的需求量接近。同時(shí)青魚幼魚的維生素A需求量顯著高于史氏鱘魚(Acipenserschrencki)[28]，但顯著低于牙鲆(Paralichthysolivaceus)[31]和雜交羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)[32]，這表明維生素A的需求量差異可能與魚類品種不同有關(guān)[12]。另外本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)維生素A含量僅為290和1 033 IU/kg時(shí)，青魚幼魚的生長受到顯著抑制，這與在大口黑鱸[12]、建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)[3]和牙鲆[31]中的研究結(jié)果相似。與適量維生素A組(3 835 IU/kg組)相比，過量維生素A(14 943 IU/kg)顯著抑制青魚幼魚的生長，這與在牙鲆[33]、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[27]和美國紅魚(Sciaenopsocellatus)[34]中的研究結(jié)果一致。上述研究結(jié)果進(jìn)一步證明了飼料中維生素A缺乏或過量均會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖青魚出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象[3]。但是對(duì)于維生素A缺乏或過量抑制魚類生長的分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

本研究結(jié)果顯示，飼料中不同維生素A含量對(duì)青魚幼魚全魚的水分、粗灰分和粗脂肪含量影響不顯著。魚體粗蛋白質(zhì)含量在7 662 IU/kg組達(dá)到最大值，與維生素A缺乏組差異顯著，但與其他試驗(yàn)組間無顯著差異，相似的研究結(jié)果也出現(xiàn)在建鯉[3]、大口黑鱸[12]和斜帶石斑魚[27]等魚類中。同樣在這幾種魚類中研究結(jié)果也顯示，魚體粗蛋白質(zhì)含量的變化趨勢(shì)與PER變化趨勢(shì)一致，這說明維生素A的缺乏或過量都會(huì)降低青魚幼魚對(duì)蛋白質(zhì)的利用，并且維生素A參與了魚體營養(yǎng)物質(zhì)的代謝從而影響了魚體組成[12,27]。此外，隨著飼料中維生素A的含量增加，青魚幼魚的粗脂肪含量呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì)，這與在大口黑鱸[12]、花鱸[2]和牙鲆[31]等魚類中的研究結(jié)果一致，但是不同飼料維生素A含量對(duì)團(tuán)頭魴[4]和草魚[5,8]的魚體組成無顯著影響，這可能是魚的種類不同而產(chǎn)生的生物學(xué)差異。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05).

圖2維生素A對(duì)青魚幼魚血細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響

Fig.2Effects of vitamin A on gene expression levels related to immunity in blood cell of juvenile black carp (Mylopharyngodonpiceus)

3.2　維生素A對(duì)青魚幼魚肝臟代謝酶活性的影響

作為儲(chǔ)存和代謝脂溶性維生素A的主要器官[35]，肝臟中代謝酶的活性較高[36]，能夠更好地反映出養(yǎng)殖動(dòng)物的代謝特征。本研究發(fā)現(xiàn)，青魚幼魚中肝臟α淀粉酶活性隨著維生素A含量的升高而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這表明飼料中添加適宜劑量的維生素A能夠改善青魚幼魚對(duì)碳水化合物的消化吸收和利用，這與在高等動(dòng)物中的研究結(jié)論較為一致[37]。此外，隨著飼料維生素A含量的升高，青魚幼魚肝臟中各類蛋白酶活性與魚體粗蛋白質(zhì)含量和PER的變化趨勢(shì)一致，這表明飼料中添加適宜劑量的維生素A能夠促進(jìn)青魚幼魚對(duì)飼料蛋白質(zhì)的消化、吸收和利用，進(jìn)而促進(jìn)魚體的生長和蛋白質(zhì)的沉積[12,27,31]。而維生素A缺乏降低了青魚的消化能力，從而降低其對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)(蛋白質(zhì)等)的利用率，并產(chǎn)生生長抑制現(xiàn)象[3]。但是對(duì)于維生素A調(diào)控動(dòng)物體代謝酶的分子機(jī)制仍需深入研究。

3.3　維生素A對(duì)青魚幼魚肝臟抗氧化能力的影響

與其他耗氧生物一樣，魚類細(xì)胞也極易受到超氧陰離子、過氧化氫等活性氧分子的非特異性攻擊。而魚類在進(jìn)化過程中也產(chǎn)生一系列抗氧化分子來抵御氧化損傷[38-39]，包括非酶性抗氧化分子(GSH等)以及抗氧化酶(如CAT、SOD、GST、GPx和GR等)。SOD主要催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化生成過氧化氫，從而降低超氧陰離子對(duì)細(xì)胞造成的氧化損傷。與在美國紅魚[34]、草魚[8]、大口黑鱸[12]中的研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)SOD活性隨著維生素A含量的增加也呈現(xiàn)先遞增后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，這也表明適量的維生素A有利于青魚幼魚抵抗氧化應(yīng)激[14]。同時(shí)，CAT和GPx可以將過氧化氫催化生成無毒副作用的水和氧氣分子。肝臟CAT、GPx和GR活性在本研究中均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，表明在一定范圍內(nèi)維生素A的添加可以提高抗氧化酶的活性。作為機(jī)體抗氧化能力的一個(gè)綜合指標(biāo)，T-AOC也呈現(xiàn)與CAT、GPx和GR活性相似的變化趨勢(shì)，這表明飼料中添加適量的維生素A能夠更好地清除魚體內(nèi)過多的活性氧自由基分子，進(jìn)而促進(jìn)抗氧化系統(tǒng)平衡[38]。肝臟GST活性和MDA含量的高低能夠直觀地反映動(dòng)物細(xì)胞受到氧化損傷的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，與維生素A缺乏組(290 IU/kg組)相比，1 734、3 835和7 662 IU/kg的維生素A能夠下調(diào)魚體肝臟中GST活性和MDA含量，隨后在過量組(14 943 IU/kg組)又出現(xiàn)升高，這與在大口黑鱸中的研究結(jié)果一致[12]。這表明適量的維生素A可在一定程度上減輕青魚幼魚細(xì)胞內(nèi)過量活性氧自由基攻擊造成的氧化受損[38]。因此，在飼料中適當(dāng)添加維生素A可以提高青魚幼魚抗氧化反應(yīng)能力。

3.4　維生素A對(duì)青魚幼魚非特異性免疫能力的影響

LYZ在魚類非特異性免疫機(jī)制中擔(dān)負(fù)重要角色，其基因表達(dá)量能夠直接反映魚類免疫反應(yīng)的高低，并且已經(jīng)成為水產(chǎn)動(dòng)物免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)[25,28]。本研究中，維生素A含量為3 835 IU/kg時(shí)，青魚幼魚血細(xì)胞中LYZ基因表達(dá)量以及血清中LYZ活性均達(dá)到最高,此結(jié)果與在羅非魚和建鯉等魚類[3,10,12]中的研究結(jié)果一致，這也證明適量的維生素A能夠通過提高LYZ基因表達(dá)量和LYZ活性來增強(qiáng)動(dòng)物體的免疫力。但Thompson等[40]在大西洋鮭(SalmosalarL.)中未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，這可能是魚類品種差異造成的。干擾素不僅是高等動(dòng)物機(jī)體抵抗病原體尤其是病毒感染的第1道防線，也是低等脊椎動(dòng)物-魚類的重要防御因子和免疫細(xì)胞的激活因子[41]，而且干擾素基因的高表達(dá)量也能夠體現(xiàn)出動(dòng)物體免疫能力的強(qiáng)弱[19]。結(jié)合上述發(fā)現(xiàn)以及本研究結(jié)果，可以進(jìn)一步證明飼料中添加適量的維生素A可以通過提高青魚幼魚INFα基因表達(dá)量提高魚類抗病力。NRAMP和HEPC是動(dòng)物體內(nèi)重要的抗菌肽和殺菌劑，在非特異性免疫調(diào)控和增強(qiáng)獲得性免疫防御中發(fā)揮重要作用[42]。NRAMP還能夠激活巨噬細(xì)胞來提高抗菌劑活性分子——一氧化氮(NO)的生成量進(jìn)而增強(qiáng)動(dòng)物體的免疫力[43]。HEPC能夠通過結(jié)合鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)而提高巨噬細(xì)胞對(duì)病原體的內(nèi)吞作用和蛋白質(zhì)水解作用[42]。因此，飼料中添加適量的維生素A能夠通過提高NRAMP和HEPC基因表達(dá)量來增強(qiáng)青魚的非特異性免疫防御能力[25]。作為動(dòng)物體液免疫系統(tǒng)的重要因子，經(jīng)旁路途徑或裂解途徑激活的補(bǔ)體分子首先與外源細(xì)菌結(jié)合，然后通過吞噬細(xì)胞表面相應(yīng)受體來促進(jìn)吞噬作用，實(shí)施對(duì)外源入侵物的裂解和破壞，進(jìn)而提高動(dòng)物體的免疫防御能力[44-45]。作為激活補(bǔ)體系統(tǒng)的關(guān)鍵分子，青魚幼魚血清中C3和C4含量能夠被適量的維生素A顯著提高，這與在團(tuán)頭魴[4]、大西洋鮭魚[40]、虹鱒[29]、真鯛(SparusaurataL.)[46]、牙鲆[47]和大口黑鱸[12]等魚類中的研究結(jié)果一致。上述研究結(jié)果也顯示，維生素A含量對(duì)青魚幼魚的非特異性免疫指標(biāo)的影響較為一致，這進(jìn)一步證明飼料中適量的維生素A對(duì)于維持青魚幼魚健康和免疫防御具有重要意義。

4　結(jié)　論

① 飼料中添加適量的維生素A能夠顯著促進(jìn)青魚幼魚的生長、代謝并提高其抗氧化能力和非特異性免疫能力。

② 以WGR為判據(jù)，經(jīng)折線模型分析結(jié)果顯示青魚幼魚飼料中維生素A適宜含量為2 246.64 IU/kg。