趙景鵬　李培勇*　王紅玉　宋益貞　孫淑紅　林　海**

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東省動物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018；2.上海美農(nóng)生物科技股份有限公司，上海 201807)

沙門氏菌病是由沙門氏菌引起的主要人畜共患病和食源性疾病，而家禽被認(rèn)為是沙門氏菌的主要宿主[1]。沙門氏菌既可由患病種雞通過種蛋垂直感染雛雞，也可在雞群中由排泄物、污染物或媒介物經(jīng)消化道、呼吸道等水平傳播。隨著美國國家家禽改良計(jì)劃(NPIP)的實(shí)施，我國國內(nèi)飼養(yǎng)的美國進(jìn)口種雞已較好地控制了雞白痢和雞傷寒這2種血清型沙門氏菌，但在地方品系或國內(nèi)自主培育的品種中，該病還時(shí)有發(fā)生。目前，威脅我國蛋雞群、肉雞群的主要病原之一是禽副傷寒-腸炎沙門氏菌，其不僅降低雞群的生產(chǎn)性能和雞肉、雞蛋品質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還通過禽產(chǎn)品導(dǎo)致人類食物中毒事件，引發(fā)公共衛(wèi)生問題[2-3]。在沙門氏菌防控過程中，抗生素和疫苗發(fā)揮了重要作用，但前者的不合理使用，令抗藥菌株大量出現(xiàn)，而后者的保護(hù)效力僅局限于同種或同一血清型的沙門氏菌感染，且干擾雞群凈化[4-6]。為有效控制沙門氏菌危害，亟需尋找適用于家禽生產(chǎn)的綠色、高效抗沙門氏菌產(chǎn)品。

活體和離體試驗(yàn)都表明，有機(jī)酸如苯甲酸、中短鏈脂肪酸和植物提取物如精油(肉桂醛、香芹酚、丁香酚、百里香酚等)對沙門氏菌有較強(qiáng)的抑制作用，且二者具有協(xié)同功效[7-9]。有機(jī)酸以未解離的分子形式存在時(shí)，能夠穿透菌體細(xì)胞壁，擾亂“pH敏感菌”的正常生理，而精油可以破壞菌體細(xì)胞膜，有利于有機(jī)酸進(jìn)入菌體細(xì)胞質(zhì)。為防止上消化道尤其是嗉囊的吸收，禽用有機(jī)酸或精油產(chǎn)品常被包被，以在通過胃腸道時(shí)緩慢釋放，保證其對小腸末端微生態(tài)平衡的調(diào)控效果[10-11]。有機(jī)酸與精油的組合效應(yīng)不僅取決于它們各自的抗菌活性及配伍，還依賴于二者與包被技術(shù)間復(fù)雜的互作關(guān)系。因此，科學(xué)篩選用以復(fù)配的單體原料至關(guān)重要。本研究設(shè)計(jì)了5個(gè)有機(jī)酸與天然植物精油的組合，經(jīng)緩釋加工，比較評價(jià)了其抗肉仔雞腸炎沙門氏菌感染的作用，以期為今后該系列產(chǎn)品的開發(fā)和使用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

精油與有機(jī)酸各組合試品由上海美農(nóng)生物科技股份有限公司提供，采用自乳化緩釋固體分散技術(shù)生產(chǎn)。腸炎沙門氏菌由本實(shí)驗(yàn)室于2015年從山東泰安地區(qū)肉仔雞病例中分離、鑒定而來，命名為SDBL-1。鹽酸恩諾沙星購自浙江國邦藥業(yè)有限公司，有效成分含量為98%。

1.2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

從當(dāng)?shù)胤趸瘓鲑徺I1日齡愛拔益加(Arbor Acres)肉仔雞900只，采集泄殖腔棉拭子，檢測有無腸炎沙門氏菌感染，從中選出體重相近的陰性個(gè)體840只，隨機(jī)分為7組，分別飼養(yǎng)在7個(gè)構(gòu)造相同但互不相通的房間內(nèi)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只雞，公母各占1/2。試雞采用疊層(3層，2個(gè)重復(fù)/層)籠養(yǎng)方式，2籠(1.48 m×0.68 m)為1個(gè)重復(fù)，每籠飼養(yǎng)10只雞。1組(對照組)飼喂基礎(chǔ)飼糧(表1)，2組(抗生素組)飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加40 g/t鹽酸恩諾沙星的試驗(yàn)飼糧，3～7組(精油與酸化劑組)飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加800 g/t不同有機(jī)酸與精油組合(表2)的試驗(yàn)飼糧。14日齡時(shí)，每只雞灌服200 μL SDBL-1腸炎沙門氏菌菌液(5×107CFU/mL)。攻毒后2、7和14 d，即16、21和28日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選2只雞(1只/籠，12只/組)，采血、屠宰、取樣。試驗(yàn)期28 d，分1～21日齡和22～28日齡2個(gè)飼養(yǎng)階段。雞群全程自由采食和飲水，各房間溫度、濕度和光照控制一致，符合白羽肉雞對環(huán)境的要求。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items1^21日齡 1 to 21 days of age22^28日齡 22 to 28 days of age鈣 Ca0.900.90非植酸磷 Non-phytate P0.450.42賴氨酸 Lys1.241.10蛋氨酸 Met0.540.45總含硫氨基酸 Total sulfur amino acids0.850.75蘇氨酸 Thr0.820.74色氨酸 Trp0.260.23

1)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供Vitamin premix provided the following per kg of diets：VA (retinyl acetate) 10 000 IU，VD3(cholecalciferol) 2 000 IU，VE (DL-α-tocopheryl acetate) 11.0 IU，VK 1.0 mg，VB11.2 mg，VB25.8 mg，VB62.6 mg,VB120.012 mg，煙酸 niacin 66.0 mg，泛酸 pantothenic acid (calcium pantothenate) 10.0 mg，生物素 biotin 0.20 mg，葉酸 folic acid 0.70 mg。

2)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼飼糧提供Mineral premix provided the following per kg of diets：Mg 100 mg，Zn 75 mg，F(xiàn)e 80 mg，I 0.65 mg，Cu 8.0 mg，Se 0.35 mg。

3)計(jì)算值Calculated values。

表2　不同有機(jī)酸與精油組合

單體原料的選擇基于體外抑菌試驗(yàn)，各組合及配比的確定兼顧抗菌、加工和商品特性。

The selection of individual components was based on bacteriostasis testinvitro. Antimicrobial properties, processing characteristics and commodity features were taken into account in determination of the composition and proportion.

1.3　測定指標(biāo)與方法

1.3.1生產(chǎn)性能

于攻毒前(14日齡)和試驗(yàn)結(jié)束后(28日齡)，以重復(fù)為單位，對雞群進(jìn)行空腹稱重并統(tǒng)計(jì)采食量，以計(jì)算平均日采食量、平均日增重、料重比；同時(shí)記錄死亡和淘汰數(shù)，以計(jì)算死淘率。

1.3.2內(nèi)臟器官指數(shù)

于9、16、21、28日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選2只雞(1只/籠，12只/組)，稱重、屠宰，取肝臟、脾臟和法氏囊，逐一稱重，計(jì)算器官指數(shù)(100×器官重/體重，%)。

1.3.3組織載菌量

于16、21、28日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選2只雞(1只/籠，12只/組)，稱重、屠宰，取適量肝臟、脾臟和盲腸內(nèi)容物，加入3 mL無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，冰浴勻漿2 min并做10倍系列梯度稀釋。取100 μL原液及各濃度稀釋液，均勻涂布于XLT-4瓊脂平板表面，置生化培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取5個(gè)可疑菌落，經(jīng)生化和血清學(xué)鑒定后，計(jì)算腸炎沙門氏菌數(shù)。

1.3.4血清生化指標(biāo)

于16、21、28日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選2只雞(1只/籠，12只/組)，翅下靜脈采血2 mL，分離血清，-20 ℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法(試劑盒購自江蘇雨桐生物科技有限公司)測定血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、免疫球蛋白G(IgG)和分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量。

1.4　統(tǒng)計(jì)分析

使用SAS 9.0軟件中GLM程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，平均值采用Tukey’s HSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1　生產(chǎn)性能

如表3所示，在正常飼養(yǎng)(未攻毒)條件下，與對照組相比，除組合D外，其余組合和鹽酸恩諾沙星均顯著降低1～14日齡肉仔雞的料重比(P<0.05)；其中，組合A效果最好。在平均日采食量不變的前提下(P>0.05)，這主要來源于平均日增重的提高(P<0.05)，提示組合A有促生長作用。

感染腸炎沙門氏菌后，與對照組相比，除組合E顯著降低15～28日齡肉仔雞的平均日采食量(P<0.05)，對生產(chǎn)性能無改善作用外，其余組合和鹽酸恩諾沙星均顯著提高平均日增重(P<0.05)，顯著降低料重比(P<0.05)。相對而言，組合A和D效果較好。

從試驗(yàn)全期(1～28日齡)來看，與對照組相比，鹽酸恩諾沙星和組合A、B、D均顯著提高肉仔雞的平均日增重(P<0.05)；除組合B外，鹽酸恩諾沙星和組合A、D顯著提高平均日采食量(P<0.05)。

表3　不同精油與酸化劑組合對腸炎沙門氏菌感染肉仔雞生產(chǎn)性能的影響

續(xù)表3項(xiàng)目Items1^14日齡(攻毒前)1 to 14 days of age (pre-challenge)平均日采食量 ADFI/(g/d)平均日增重 ADG/(g/d)料重比 F/G死淘率 Mortality/%15^28日齡(攻毒后)15 to 28 days of age (post-challenge)平均日采食量 ADFI/(g/d)平均日增重 ADG/(g/d)料重比 F/G死淘率 Mortality/%1^28日齡(全期)1 to 28 days of age (overall period)平均日采食量 ADFI/(g/d)平均日增重 ADG/(g/d)料重比 F/G死淘率 Mortality/%組合CCombi-nation C24.317.2c1.42b2.5085.2a54.6a1.57bc0.0039.7ab30.3bc1.322.50組合DCombi-nation D26.218.2abc1.45ab2.5088.1a57.5a1.54c2.5043.5a31.8ab1.375.00組合ECombi-nation E25.918.8abc1.38b0.0078.1b46.3b1.70ab0.0040.8ab28.8bc1.430.00集合標(biāo)準(zhǔn)誤Pooled SEM2.631.900.075.595.565.610.136.614.163.010.127.36P值 P-valueNS0.0700.001NS0.0330.0070.016NS0.1340.024NSNS

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。NS表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). NS mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2　內(nèi)臟器官指數(shù)

如表4所示，在正常飼養(yǎng)(未攻毒)條件下，與對照組相比，鹽酸恩諾沙星和組合B顯著降低9日齡肉仔雞的肝臟指數(shù)(P<0.05)，鹽酸恩諾沙星和組合B、C、E顯著降低9日齡的脾臟指數(shù)(P<0.05)。但感染腸炎沙門氏菌后，鹽酸恩諾沙星和上述組合對內(nèi)臟器官發(fā)育的抑制作用減弱，僅發(fā)現(xiàn)鹽酸恩諾沙星和組合E分別降低16和21日齡的肝臟指數(shù)(P<0.05)；28日齡時(shí)，組合C的脾臟指數(shù)高于組合B(P<0.05)。

表4　不同精油與酸化劑組合對腸炎沙門氏菌感染肉仔雞內(nèi)臟器官指數(shù)的影響

續(xù)表4項(xiàng)目Items9日齡 9 days of age肝臟Liver脾臟Spleen法氏囊Bursa of Fabricius16日齡 16 days of age肝臟Liver脾臟Spleen法氏囊Bursa of Fabricius21日齡 21 days of age肝臟Liver脾臟Spleen法氏囊Bursa of Fabricius28日齡 28 days of age肝臟Liver脾臟Spleen法氏囊Bursa of Fabricius組合ACombina-tion A 5.86ab0.12ab0.156.28a0.190.195.67ab0.190.153.070.13ab0.14組合BCombina-tion B4.90bc0.11b0.135.52ab0.190.175.31ab0.180.183.310.10b0.15組合CCombina-tion C5.56ab0.10b0.146.16a0.190.174.05ab0.150.173.840.16a0.11組合DCombina-tion D5.73ab0.12ab0.175.48ab0.220.184.37ab0.160.173.160.13ab0.14組合ECombina-tion E5.05abc0.09b0.176.67a0.230.153.98b0.160.183.700.14ab0.13集合標(biāo)準(zhǔn)誤Pooled SEM1.160.050.041.620.100.051.690.080.040.880.040.03P值 P-value0.0980.031NS0.123NSNS0.193NSNSNS0.177NS

2.3　組織載菌量

如表5所示，攻毒后2 d(16日齡)，鹽酸恩諾沙星和所有組合均顯著降低肉仔雞的肝臟載菌量(P<0.05)，但組合E顯著增加脾臟載菌量(P<0.05)。攻毒后7 d(21日齡)，除鹽酸恩諾沙星和組合B、D對肝臟載菌量以及組合E對盲腸內(nèi)容物載菌量無顯著影響(P>0.05)外，其余各組合都表現(xiàn)出抑菌作用。攻毒后14 d(28日齡)，鹽酸恩諾沙星和各組合均顯著降低盲腸內(nèi)容物載菌量(P<0.05)；組合A、D對脾臟的抑菌效果優(yōu)于鹽酸恩諾沙星(P<0.05)。

2.4　血清炎性因子與免疫球蛋白含量

如表6所示，在血清炎性因子方面，與對照組相比，組合A和D顯著降低28日齡肉仔雞的血清TNF-α含量(P<0.05)，組合D顯著降低16日齡的血清IL-6含量(P<0.05)，組合E顯著增加21日齡血清TNF-α含量、21和28日齡血清IL-6含量(P<0.05)。在血清免疫球蛋白方面，與對照組相比，組合A顯著增加16日齡的血清IgG含量(P<0.05)，組合C和E分別顯著降低21和28日齡的血清IgG含量(P<0.05)。

3　討　論

本試驗(yàn)中，我們選用SDBL-1腸炎沙門氏菌作為攻毒菌株的目的是：1)區(qū)分沙門氏菌的來源，即弄清由臟器分離得到的腸炎沙門氏菌是來自接種還是外界環(huán)境；2)接種單一血清型的腸炎沙門氏菌，降低多血清型交互干擾的可能性。為防止攻毒菌株在各組間交叉感染，影響研究結(jié)果的可靠性，雞群飼養(yǎng)在7個(gè)互不相通的房間內(nèi)。我們保證房間構(gòu)造、舍內(nèi)布局、飼養(yǎng)方式和設(shè)施管理等一致，盡量使雞群處于相同環(huán)境，以符合隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的要求。攻毒前，肉仔雞預(yù)先飼喂2周抗生素或不同有機(jī)酸與精油組合，使胃腸道系統(tǒng)適應(yīng)飼糧處理。對照組肉仔雞每只灌服107CFU腸炎沙門氏菌后，盲腸內(nèi)容物、肝臟和脾臟中均含有大量的腸炎沙門氏菌，且前者的載菌量遠(yuǎn)高于后二者，提示腸炎沙門氏菌優(yōu)先在盲腸定殖，繼而感染其他臟器。該結(jié)果證明了腸炎沙門氏菌攻毒模型的成功建立。無論是有機(jī)酸還是天然植物精油，都有很多種類，彼此的抑菌效果差異很大。業(yè)內(nèi)不乏關(guān)于不同有機(jī)酸或精油復(fù)合物對肉仔雞沙門氏菌感染的控制效果研究[12-13]，但對二者的疊加效應(yīng)或交互作用考慮較少，尤其是在緩釋處理前提下?；诮M織載菌量，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除組合E外，受測的其他4個(gè)精油與有機(jī)酸組合對腸炎沙門氏菌的抑制作用均強(qiáng)于鹽酸恩諾沙星，其中，組合A的保護(hù)效果最好，其次是組合D。從組成上看，組合A、B、C均含香芹酚、百里香酚和苯甲酸，組合A、D同含苯甲酸和丁酸，而組合B、C、D都含苯甲酸，故我們推測，丁酸與其他精油組分對腸炎沙門氏菌具有協(xié)同抑制功效。丁酸是一種短鏈脂肪酸，與甲酸、乙酸、丙酸同屬一元羧酸。這一推斷與Zhou等[7]的報(bào)道一致，他們發(fā)現(xiàn)，百里香酚與乙酸聯(lián)合使用對鼠傷寒沙門氏菌的殺滅效果優(yōu)于二者單獨(dú)補(bǔ)充。盡管組合E的有效成分與A相同，但各單體原料的添加水平是組合A的1.5倍，結(jié)果對腸炎沙門氏菌的抵抗力不增反降，提示有機(jī)酸與精油的組合效應(yīng)取決于二者劑量的合理搭配。當(dāng)然，我們并不完全排除組合A、D的抗菌性能來自于丁酸的單獨(dú)作用，因?yàn)槎∷岜旧砭途哂泻軓?qiáng)的抗腸炎沙門氏菌能力[14-15]，特別是在包被狀態(tài)下[11,16]?？墒?，鑒于先前研究(1‰)在遠(yuǎn)高于組合E(0.012‰)的劑量條件下，觀察到的都是丁酸的有益作用，上述假設(shè)成立的可能性不大。

表6　不同精油與酸化劑組合對腸炎沙門氏菌感染肉仔雞血清炎性因子和免疫球蛋白含量的影響

作為革蘭氏陰性菌，腸炎沙門氏菌可能通過脂多糖(LPS)、內(nèi)毒素等抗原分子觸發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)(如巨噬細(xì)胞分泌炎性因子等)，引起免疫應(yīng)答(如漿細(xì)胞或效應(yīng)B細(xì)胞合成抗體等)[17]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染腸炎沙門氏菌后，組合A減少外周血TNF-α和IL-6釋放，增加IgG含量，效果甚至好于鹽酸恩諾沙星，而組合E恰好相反。這與臟器帶菌量的結(jié)果吻合，表明組合A對體液免疫的改善作用。結(jié)合內(nèi)臟器官發(fā)育數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為組合E對腸炎沙門氏菌感染幾乎無控制效果。因?yàn)楦鹘M肉雞的血清SIgA含量無顯著差異，所以，有機(jī)酸與精油組合可能并不影響?zhàn)つっ庖摺?/p>

除抗菌外，有機(jī)酸和精油還參與養(yǎng)分代謝。前者通過降低飼糧pH，促進(jìn)腸道消化；而后者能夠增加膽鹽分泌，提高腸黏膜和胰腺的酶活性[18-20]。最終，這些有益作用都將反映到生產(chǎn)性能上。研究表明精油與有機(jī)酸組合對肉仔雞的飼料轉(zhuǎn)化率有正面影響[21-22]，也有研究未發(fā)現(xiàn)二者的協(xié)同效應(yīng)[23]，這與受試組合的組成有關(guān)。本試驗(yàn)中，無論攻毒前還是攻毒后，組合A都提高平均日增重，改善飼料利用率，而組合D僅在攻毒后起效。由此提示，丁酸與香芹酚、百里香酚組合具有促生長和抗菌雙重功效，而丁酸與肉桂醛組合只具有抗菌作用，故組合A適合長期飼喂，而組合D僅推薦在感染狀態(tài)下使用。事實(shí)上，組合E在攻毒前也能促進(jìn)生長，但在攻毒后效果全無。再次說明，有機(jī)酸與精油的配比影響其組合的抗菌能力。

4　結(jié)　論

① 單就抗菌作用而言，組合A和D對肉仔雞腸炎沙門氏菌都具有良好的抑制功效，提示丁酸與其他精油組分在包被狀態(tài)下的協(xié)同效應(yīng)有劑量依賴性。

② 結(jié)合生產(chǎn)性能來看，組合A適合長期飼喂，而組合D僅推薦在感染狀態(tài)下使用。