吝常華　劉國華　常文環(huán)　張　姝　鄭愛娟　鄧雪娟　蔡輝益

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實驗室，生物飼料開發(fā)國家工程研究中心，北京 100081)

豆粕作為我國重要的植物性蛋白質(zhì)原料，與其他植物性蛋白質(zhì)原料(棉籽粕、菜籽粕、花生粕等)相比具有氨基酸組成合理、消化利用率高、適口性好的特點(diǎn)[1]，與魚粉等動物性蛋白質(zhì)飼料相比具有資源較為充足、價格相對低廉、不易氧化腐敗、安全系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)[2]。但是，我國作為一個畜牧生產(chǎn)大國，豆粕資源的供需矛盾依然突出，同時豆粕中含有大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制劑、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子[3]，其中大豆球蛋白占總蛋白質(zhì)的40%[4]，是大豆中含量最高的一種球蛋白，同時也是熱穩(wěn)定性最強(qiáng)的抗原蛋白之一，是引起動物過敏反應(yīng)和腹瀉的主要成分，其不僅限制了豆粕在飼糧中的使用，而且對畜禽危害較為嚴(yán)重。因此，充分利用現(xiàn)有豆粕資源，采取一定的技術(shù)途徑提高豆粕飼用價值具有重要意義。近年來，人們對微生物(主要是有益菌)發(fā)酵技術(shù)的關(guān)注度日益提高，并積極探索發(fā)掘菌種資源用于飼料的發(fā)酵生產(chǎn)，其中解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)作為一種益生菌，具有繁殖速度快，穩(wěn)定性好，生命力強(qiáng)[5]，富含淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的特點(diǎn)[6-9]，在固態(tài)發(fā)酵豆粕的應(yīng)用研究中取得了較好的效果[10-12]。有關(guān)微生物發(fā)酵豆粕工藝參數(shù)的研究報道雖然較多，但是目前對于菌種資源和發(fā)酵工藝依然有嚴(yán)格的衡量標(biāo)準(zhǔn)，且微生物單獨(dú)發(fā)酵和混菌發(fā)酵豆粕對比研究較少。因此，本試驗擬分別優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌單菌及其在植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的協(xié)同下混菌發(fā)酵豆粕的工藝參數(shù)，并對豆粕發(fā)酵前后的理化性質(zhì)進(jìn)行分析比較，為發(fā)酵豆粕菌種的選擇和發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料與菌種

豆粕和麩皮：由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所昌平南口基地提供，粉碎過40目篩。

無菌水：蒸餾水分裝，121 ℃滅菌20 min。

解淀粉芽孢桿菌：為本實驗室分離篩選所得。

植物乳桿菌：購自中國普通微生物菌種管理保藏中心，保藏編號為1.557。

釀酒酵母菌：購自中國普通微生物菌種管理保藏中心，保藏編號為2.388。

1.2　培養(yǎng)基

1.2.1液體種子培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：氯化鈉10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)pH至7.4，121 ℃滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏8.0 g、酵母膏4.0 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸錳0.3 g、檸檬酸銨2.0 g、乙酸鈉5.0 g、吐溫-80 1.0 mL，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)pH至6.2～6.6，121 ℃滅菌20 min。

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2斜面培養(yǎng)基

在各個液體種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加20.0 g瓊脂糖。

1.2.3固體發(fā)酵培養(yǎng)基

豆粕45.0 g、麩皮5.0 g，滅菌水適量，自然pH。

1.3　試驗方法

1.3.1發(fā)酵種子液的制備

首先用接種環(huán)從解淀粉芽孢桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母菌斜面培養(yǎng)基上分別接1環(huán)于各菌種的液體種子培養(yǎng)基中，依次為LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基，將解淀粉芽孢桿菌置于37 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，釀酒酵母菌置于30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，植物乳桿菌置于30 ℃靜置培養(yǎng)，3個菌種均培養(yǎng)48 h。然后，將上述培養(yǎng)好的菌液按1%的接種量接種到各菌種液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，制成發(fā)酵種子液。

1.3.2各菌種生長曲線的測定及接種時間的確定

采用分光光度計比濁法[13]，用已經(jīng)滅菌的未接種各菌種的液體種子培養(yǎng)基作為空白對照，取各自相應(yīng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48 h時的3個菌種，分別測定600 nm處的吸光度值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)菌液的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。選擇各菌種處于對數(shù)生長期時的菌液接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，此時菌體活力最強(qiáng)，生長最旺盛[14]。

1.3.3固態(tài)發(fā)酵方法

將固體發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于250 mL三角瓶中，將培養(yǎng)好的發(fā)酵種子液按一定的接種量接種到含豆粕的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，靜置發(fā)酵。

1.3.4單菌發(fā)酵豆粕試驗設(shè)計

1.3.4.1單因素試驗

以接種量(A)、溫度(B)、料水比(C)和發(fā)酵時間(D)這4個因素為研究對象進(jìn)行單因素試驗，以發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量為指標(biāo)，研究單一因素對解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)小肽的影響。

1.3.4.2單菌發(fā)酵豆粕工藝條件的優(yōu)化

為了獲得解淀粉芽孢桿菌單菌發(fā)酵豆粕的最佳發(fā)酵工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵產(chǎn)物小肽含量為指標(biāo)，采用四因素三水平L9(34)的正交試驗對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，每個水平設(shè)3個重復(fù)。優(yōu)化單菌發(fā)酵豆粕工藝條件的正交試驗設(shè)計見表1。

表1　優(yōu)化單菌發(fā)酵豆粕工藝條件的正交試驗設(shè)計

1.3.5混菌發(fā)酵豆粕試驗設(shè)計

1.3.5.1混菌發(fā)酵豆粕菌種比例優(yōu)化

采用L9(34)正交試驗設(shè)計，將3個菌種按3個接種量進(jìn)行三因素三水平正交試驗，每個水平設(shè)3個重復(fù)。在溫度34℃、料水比1.0∶1.0、自然pH條件下發(fā)酵48 h，以發(fā)酵產(chǎn)物小肽含量為指標(biāo)，確定混菌發(fā)酵豆粕時3個菌種的最佳接種比例。優(yōu)化混菌發(fā)酵豆粕菌種比例的正交試驗設(shè)計如表2所示。

表2　優(yōu)化混菌發(fā)酵豆粕菌種比例的正交試驗設(shè)計

1.3.5.2混菌發(fā)酵豆粕工藝條件的優(yōu)化

在確定3個菌種最佳接種比例的基礎(chǔ)上，采用L16(44)正交試驗設(shè)計，將混菌發(fā)酵豆粕的接種量(A)、溫度(B)、料水比(C)、時間(D)4個因素進(jìn)行優(yōu)化，每個因素設(shè)4個水平，每個水平設(shè)3個重復(fù)，進(jìn)行四因素四水平的正交試驗。優(yōu)化混菌發(fā)酵豆粕工藝條件的正交試驗設(shè)計如表3所示。

表3　優(yōu)化混菌發(fā)酵豆粕工藝條件的正交試驗設(shè)計

1.4　測定指標(biāo)與方法

發(fā)酵結(jié)束后，將產(chǎn)物置于50 ℃烘箱中烘至恒重，放于室內(nèi)回潮24 h，然后粉粹過60目篩，進(jìn)行指標(biāo)的測定。

1.4.1小肽及常規(guī)營養(yǎng)成分含量的測定

小肽含量：參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《大豆肽粉》(QB/T 2653—2004)中方法進(jìn)行測定。

粗蛋白質(zhì)含量：參照國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中粗蛋白測定方法》(GB/T 6432—1994)中方法進(jìn)行測定。

粗纖維含量：參照國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中粗纖維的含量測定 過濾法》(GB/T 6434—2006)中方法進(jìn)行測定。

粗灰分含量：參照國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中粗灰分的測定》(GB/T 6438—2007)中方法進(jìn)行測定。

粗脂肪含量：參照國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中粗脂肪的測定》(GB/T 6433—2006)中方法進(jìn)行測定。

1.4.2蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定

采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法[15]測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量：稱取粉碎過60目篩的豆粕1.000 g，用0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)浸提1 h，3 000×g、4 ℃離心10 min，取上清液置于4 ℃冰箱保存待用。電泳時采用5%濃縮膠、15%的分離膠，每條泳道加20 μL上清液，20 mA、80 V恒流電泳2 h后，考馬斯亮藍(lán)染色觀察。

1.4.3大豆球蛋白含量的測定

采用大豆球蛋白檢測試劑盒進(jìn)行大豆球蛋白含量的測定，其主要是利用間接競爭的方法，樣品中的大豆球蛋白與試劑盒中預(yù)包被的抗原競爭大豆球蛋白抗體，然后加入酶標(biāo)二抗后，3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色，使得樣品吸光度值與其所含大豆球蛋白的含量呈負(fù)相關(guān)，因此可通過酶標(biāo)儀檢測吸光度值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出樣品中大豆球蛋白的含量。

1.4.4發(fā)酵豆粕產(chǎn)物干樣pH的測定

稱取3.000 g發(fā)酵豆粕干樣，加入30.0 mL的蒸餾水，攪拌均勻，4 ℃靜置6 h，過濾，用pH計測定上清液的pH。

1.5　數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2016進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。其中正交試驗數(shù)據(jù)采用一般線性模型單變量進(jìn)行極差與方差分析，其他采用單因素方差分析，檢驗組間差異顯著性，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性水平為P<0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1　試驗菌種生長曲線的測定結(jié)果及接種時間的確定

2.1.1解淀粉芽孢桿菌生長曲線

由圖1可以看出，解淀粉芽孢桿菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)33 h時，生長達(dá)到最旺盛期，且在18～24 h這個時間段快速增長，擬為對數(shù)生長期。

圖1　解淀粉芽孢桿菌生長曲線

2.1.2植物乳桿菌生長曲線

由圖2可以看出，植物乳桿菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)時，在3～21 h內(nèi)快速生長繁殖，在27 h時達(dá)到峰值，且于此后生長緩慢，在30 h后生長速度開始下降。

圖2　植物乳桿菌生長曲線

2.1.3釀酒酵母菌生長曲線

由圖3可以看出，釀酒酵母菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)時，前24 h生長速度較快，在27 h時生長達(dá)到峰值，而此后生長進(jìn)入相對穩(wěn)定期。

2.1.4試驗菌種接種時間的確定

為便于比較發(fā)酵所用各菌種的生長周期，將各菌種生長曲線置于同一圖(圖4)中。由圖4可以看出，植物乳桿菌生長較為迅速，在21 h后即進(jìn)入穩(wěn)定期，而解淀粉芽孢桿菌和釀酒酵母菌的生長周期相對較長，分別在27和24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。為便于統(tǒng)一試驗步驟、簡化混菌發(fā)酵操作，選擇培養(yǎng)21 h時作為3個菌種的接種時間，且此時各菌種均處于生長對數(shù)期，菌株呈幾何對數(shù)速度生長，菌體活力強(qiáng)，能保證其在接種到固體培養(yǎng)基后迅速生長。

圖3　釀酒酵母菌生長曲線

圖4　3個試驗菌種的生長曲線

2.2　單因素試驗結(jié)果

2.2.1接種量對小肽含量的影響

由圖5可知，在料水比為1.0∶1.0、溫度為35 ℃、發(fā)酵時間為72 h的條件下進(jìn)行發(fā)酵時，不同接種量對發(fā)酵效果產(chǎn)生了不同的影響。菌種接種量為0時，產(chǎn)物中小肽含量為1.11%，顯著低于其他4個接種量(P<0.05)；隨著接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量先增加后降低，當(dāng)接種量為10%時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量達(dá)到最高值，為11.14%；當(dāng)接種量為15%和20%時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量相同。

2.2.2料水比對小肽含量的影響

由圖6可知，在接種量為10%、發(fā)酵溫度為35 ℃、發(fā)酵時間為72 h的條件下進(jìn)行發(fā)酵時，不同料水比對發(fā)酵效果產(chǎn)生了不同的影響。料水比為1.0∶0.4時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量為5.71%，顯著低于其他4個料水比(P<0.05)；隨著含水量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量先逐漸增加，當(dāng)料水比達(dá)到1.0∶0.8時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量達(dá)到最高，為11.57%；其后，隨著含水量的繼續(xù)增加，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量開始呈現(xiàn)下降趨勢。

數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖6至圖8同。

Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Fig.6 to Fig.8.

圖5接種量對小肽含量的影響

Fig.5Effect of inoculation amount on small peptide content

圖6　料水比對小肽含量的影響

2.2.3溫度對小肽含量的影響

由圖7可知，接種量為10%、料水比為1.0∶1.0、發(fā)酵時間為72 h的條件下進(jìn)行發(fā)酵時，不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果產(chǎn)生了不同的影響。溫度為45 ℃時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量最低，為6.54%，顯著低于其他4個溫度(P<0.05)；溫度為30 ℃時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量達(dá)到最高值， 為11.06%，但在25、30、35、40 ℃條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量無顯著差異(P>0.05)。

2.2.4發(fā)酵時間對小肽含量的影響

由圖8可知，在接種量為10%、料水比為1∶1、溫度為35 ℃的條件下進(jìn)行發(fā)酵時，不同發(fā)酵時間對發(fā)酵效果產(chǎn)生了不同的影響。發(fā)酵時間為24 h時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量為6.30%，顯著低于其他4個發(fā)酵時間(P<0.05)；發(fā)酵時間為72 h時，發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量達(dá)到最高值，為10.37%，但與發(fā)酵時間為48、96、120 h時無顯著差異(P>0.05)。

圖7　溫度對小肽含量的影響

圖8　發(fā)酵時間對小肽含量的影響

2.3　單菌發(fā)酵豆粕工藝條件優(yōu)化的試驗結(jié)果

由表4中正交試驗結(jié)果的極差(R)值分析可以看出，4個因素對發(fā)酵豆粕產(chǎn)小肽的影響程度為B>D>C>A，即溫度對發(fā)酵效果的影響最大，發(fā)酵時間其次，料水比和接種量對發(fā)酵效果的影響較小。接種量對發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量的影響最小，所以將此項作為誤差項進(jìn)行方差分析。進(jìn)一步的方差分析結(jié)果(表5)顯示，溫度和發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量有顯著的影響(P<0.05)。結(jié)合k值大小分析可得，解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕工藝條件的最佳組合為A2B3C3D2，即在接種量為10%、溫度為40 ℃、料水比為1.0∶1.2、發(fā)酵時間為72 h時，發(fā)酵效果最優(yōu)。

2.4　混菌發(fā)酵豆粕的試驗結(jié)果

2.4.1混菌發(fā)酵豆粕菌種比例優(yōu)化結(jié)果

由表6中正交試驗結(jié)果的R值分析可以看出，3個菌種對發(fā)酵豆粕產(chǎn)小肽的影響程度為A>B>C，即解淀粉芽孢桿菌對發(fā)酵效果影響最大，其次是植物乳桿菌，釀酒酵母菌對發(fā)酵效果的影響最小。進(jìn)一步的方差分析結(jié)果(表7)顯示，3個菌種對發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量均沒有顯著影響(P>0.05)。因此，此次試驗中解淀粉芽孢桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母混合發(fā)酵豆粕接種比例的最佳組合為A3B3C2，即解淀粉芽孢桿菌∶植物乳桿菌∶釀酒酵母菌=9∶3∶2。

表4　單菌發(fā)酵豆粕正交試驗結(jié)果

續(xù)表4試驗號Test No.因素 Factors接種量Inoculation quantity (A)/%溫度Temperature (B)/℃料水比Feed∶water (C)發(fā)酵時間Fermentation time (D)/h小肽含量Small peptide content/%K226.4926.0524.7528.70K326.0731.8528.326.88k18.396.618.237.38k28.838.688.259.57k38.6910.629.438.96極差 R0.444.011.202.19因素主次 Primary and secondary factorsB>D>C>A最佳組合 Best combinationA2B3C3D2

表5　方差分析結(jié)果

“*”表示有顯著性差異(P<0.05)。表7和表9同。

“*” mean significant difference (P<0.05). The same as Table 7 and Table 9.

表6　混菌發(fā)酵豆粕菌種比例正交試驗結(jié)果

續(xù)表6試驗號Test No.因素 Factors解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens (A)植物乳桿菌Lactobacillus plantarum (B)釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae (C)小肽含量Small peptide content/%K119.1520.1320.57K219.4819.6920.62K323.0621.8720.68k16.386.716.86k26.496.566.87k37.697.296.89極差 R1.310.730.03因素主次 Primary and secondary factors A>B>C最佳組合 Best combinationA3B3C2

表7　方差分析結(jié)果

2.4.2混菌發(fā)酵豆粕工藝條件優(yōu)化的試驗結(jié)果

由表8中正交試驗結(jié)果的R值分析可以看出，4個因素對發(fā)酵豆粕產(chǎn)小肽的影響程度為A>D>C>B，即接種量對發(fā)酵效果的影響最大，其次是發(fā)酵時間，料水比和溫度對發(fā)酵效果的影響不大。進(jìn)一步的方差分析結(jié)果(表9)顯示，接種量和發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量有顯著影響(P<0.05)。結(jié)合k值大小分析可得，3個菌種混合發(fā)酵豆粕工藝條件的最佳組合為A4B1C3D4，即在接種量為15%、溫度為31 ℃、料水比為1.0∶1.0、發(fā)酵時間為120 h的條件下，可以取得最優(yōu)發(fā)酵效果。

表8　混菌發(fā)酵豆粕正交試驗結(jié)果

續(xù)表8試驗號Test No.因素 Factors接種量Inoculation quantity (A)/%溫度Temperature (B)/℃料水比Feed∶water (C)發(fā)酵時間Fermentation time (D)/h小肽含量Small peptide content/%69(2)34(2)?倕?倕?倕1.0:0.6(1)72(2)7.5479(2)37(3)1.0∶1.0(3)108(4)8.8889(2)40(4)1.0∶0.8(2)48(1)4.95912(3)31(1)1.0∶0.8(2)108(4)8.871012(3)34(2)1.0∶1.0(3)48(1)5.811112(3)37(3)1.0∶0.6(1)96(3)7.261212(3)40(4)1.0∶1.2(4)72(2)7.381315(4)31(1)1.0∶1.0(3)72(2)8.311415(4)34(2)1.0∶0.8(2)96(3)7.901515(4)37(3)1.0∶1.2(4)48(1)6.531615(4)40(4)1.0∶0.6(1)108(4)9.41K117.3129.5929.4922.57K228.5029.4928.6130.12K329.3229.5629.9021.93K432.1528.6429.2835.40k14.337.407.375.64k27.137.377.157.53k37.337.397.485.48k48.047.167.328.85極差 R3.710.240.333.21因素主次 Primary and secondary factorsA>D>C>B最佳組合 Best combinationA4B1C3D4

表9　方差分析結(jié)果

2.5　豆粕發(fā)酵前后理化性質(zhì)的變化

2.5.1豆粕發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)含量

最佳發(fā)酵條件下，豆粕發(fā)酵前后多肽、粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗灰分和粗脂肪的含量的變化情況如表10所示。豆粕經(jīng)單菌(解淀粉芽孢桿菌)和混菌(解淀粉芽孢桿菌∶植物乳桿菌∶釀酒酵母菌=9∶3∶2)發(fā)酵后，小肽含量分別為12.73%和10.42%，均顯著高于未發(fā)酵組(P<0.05)，而且單菌發(fā)酵組小肽含量要顯著高于混菌發(fā)酵組(P<0.05)；豆粕經(jīng)單菌和混菌發(fā)酵后，粗蛋白質(zhì)含量由未發(fā)酵時的46.70%分別提高到55.31%(P<0.05)和56.14%(P<0.05)，且混菌發(fā)酵組顯著高于單菌發(fā)酵組(P<0.05)；與未發(fā)酵組相比，豆粕經(jīng)單菌和混菌發(fā)酵后粗纖維含量顯著降低(P<0.05)，但單菌發(fā)酵組和混菌發(fā)酵組之間差異不顯著(P>0.05)；豆粕經(jīng)單菌和混菌發(fā)酵后，粗灰分含量由未發(fā)酵時的7.58%分別提高到9.68%(P<0.05)和9.48%(P<0.05)，但單菌發(fā)酵組和混菌發(fā)酵組之間差異不顯著(P>0.05)；同時，豆粕經(jīng)單菌和混菌發(fā)酵后，粗脂肪含量由未發(fā)酵時的1.89%分別提高到2.34%(P<0.05)和2.18%(P<0.05)，但單菌發(fā)酵組和混菌發(fā)酵組之間差異不顯著(P>0.05)。

表10　豆粕發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化(干物質(zhì)基礎(chǔ))

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.5.2豆粕發(fā)酵前后pH的變化

由表11可知，未發(fā)酵豆粕的pH為6.42，豆粕經(jīng)單菌發(fā)酵后，pH上升到6.77，差異不顯著(P>0.05)；而經(jīng)混菌發(fā)酵后，pH下降到5.21，差異顯著(P<0.05)；此外，混菌發(fā)酵組的pH還顯著低于單菌發(fā)酵組(P<0.05)。

表11　豆粕發(fā)酵前后pH

2.5.3豆粕發(fā)酵前后大豆球蛋白含量的變化

由表12可知，豆粕經(jīng)單菌和混菌發(fā)酵后大豆球蛋白含量均顯著降低(P<0.05)，其中單菌發(fā)酵組大豆球蛋白含量由原來未發(fā)酵時的118 mg/g下降到56.12 mg/g，混菌發(fā)酵組大豆球蛋白含量則下降到70.22 mg/g，且單菌發(fā)酵組要顯著低于混菌發(fā)酵組(P<0.05)。

2.5.4蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定結(jié)果

由圖9可以看出，未發(fā)酵豆粕中大分子的蛋白質(zhì)占了一定比例，主要分布在35和45 ku；豆粕經(jīng)發(fā)酵后，樣品中大于35 ku的大分子蛋白質(zhì)明顯減少，主要分布在小于25 ku部分，少數(shù)分布在25 ku；與混菌發(fā)酵組相比，單菌發(fā)酵組蛋白質(zhì)分子質(zhì)量小于15 ku的部分更多。

表12　豆粕發(fā)酵前后大豆球蛋白含量(干物質(zhì)基礎(chǔ))

3　討　論

3.1　豆粕發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化

經(jīng)微生物發(fā)酵處理后，豆粕中部分營養(yǎng)物質(zhì)含量有所提高，抗?fàn)I養(yǎng)因子得到有效降解。本試驗中，豆粕經(jīng)單菌和混菌發(fā)酵后，小肽含量較未發(fā)酵組分別提高了10.61和8.68倍，并且單菌發(fā)酵組小肽含量要顯著高于混菌發(fā)酵組。Hong等[16]的研究顯示，發(fā)酵提高了豆粕中<10 ku小肽的含量，未發(fā)酵豆粕中有22.2%的肽為大肽，而發(fā)酵豆粕中不含有>60 ku的大肽，這與本試驗結(jié)果具有一致性。小肽含量的升高是因為微生物發(fā)酵可以把豆粕中的蛋白質(zhì)水解為氨基酸、多肽和氨等小分子物質(zhì)[17-18]，本試驗中單菌發(fā)酵組和混菌發(fā)酵組小肽含量存在顯著差異可能是因為將豆粕中蛋白質(zhì)降解為小肽的酶主要是由解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的，而在進(jìn)行混菌發(fā)酵時，解淀粉芽孢桿菌的接種量相對低于單菌發(fā)酵時的接種量。馬文強(qiáng)等[19]研究發(fā)現(xiàn)，豆粕經(jīng)微生物發(fā)酵后，粗蛋白質(zhì)含量相較發(fā)酵前提高了13.48%。劉劍飛[20]選用1株厭氧型枯草芽孢桿菌在一定條件下對豆粕進(jìn)行厭氧發(fā)酵，測得粗蛋白質(zhì)含量提高了13.0%，達(dá)到53.27%；經(jīng)枯草芽孢桿菌、酵母菌、植物乳桿菌混菌發(fā)酵后，粗蛋白質(zhì)含量提高了13.5%，達(dá)到53.51%。王洪瑞[21]在研究微生物發(fā)酵豆粕工藝時發(fā)現(xiàn)，豆粕經(jīng)發(fā)酵后，粗蛋白質(zhì)含量最高可達(dá)59.52%。本試驗中，豆粕經(jīng)單菌和混菌發(fā)酵后，粗蛋白質(zhì)含量分別提高了18.44%和20.21%，并且混菌發(fā)酵組粗蛋白質(zhì)含量要顯著高于單菌發(fā)酵組。豆粕固態(tài)發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量都有不同程度提高，這主要是因為在發(fā)酵過程中微生物(主要是有益菌)的呼吸作用消耗了部分有機(jī)物料，從而釋放出二氧化碳(CO2)和水(H2O)，使產(chǎn)物總量減少，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)的“濃縮效應(yīng)”[22]，還有部分增加的蛋白質(zhì)是酵母菌體含有的菌體蛋白質(zhì)和發(fā)酵過程中無機(jī)銨鹽經(jīng)由酵母菌轉(zhuǎn)化而成的，這是發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量提高最有意義的部分[23]。在發(fā)酵過程中，由于微生物大量繁殖，不僅提高了發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)基料的蛋白質(zhì)水平，而且在發(fā)酵過程中，豆粕中的植物性蛋白質(zhì)被微生物代謝利用轉(zhuǎn)化為菌體蛋白質(zhì)，這樣也改變了豆粕中蛋白質(zhì)的品質(zhì)。劉栩州[24]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用復(fù)合微生物發(fā)酵豆粕，產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量略微上升，但粗纖維含量較發(fā)酵前下降了33.7%，而本試驗中豆粕經(jīng)單菌和混菌發(fā)酵后粗纖維含量下降量分別為26.84%和26.05%，可能是因為菌種差異而對粗纖維的降解能力不同。經(jīng)單菌和混菌發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)物中的粗灰分和粗脂肪含量都到了顯著提高，這是由于發(fā)酵過程中豆粕中部分有機(jī)物被微生物生長所利用而造成干物質(zhì)損失，使得它們的含量相對提高，這一結(jié)果與付亭亭[25]和Chi等[10]的研究結(jié)果一致。

3.2　豆粕發(fā)酵前后pH的變化

本試驗中，單菌發(fā)酵組發(fā)酵產(chǎn)物的pH升高，而楊守鳳[26]在乳酸菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的研究中則發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物pH顯著降低，可能是因為解淀粉芽孢桿菌在發(fā)酵豆粕過程中產(chǎn)生蛋白酶，蛋白酶降解豆粕中蛋白質(zhì)產(chǎn)生胺類物質(zhì)，甚至產(chǎn)生一些氨氣使得產(chǎn)物pH升高，而乳酸菌在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生一些乳酸等有機(jī)酸使發(fā)酵基質(zhì)pH降低。本試驗結(jié)果顯示，豆粕經(jīng)混菌發(fā)酵后pH顯著降低，可能是因為在固態(tài)培養(yǎng)基中，解淀粉芽孢桿菌和釀酒酵母菌均為好氧菌，發(fā)酵前期它們的生長代謝為乳酸菌的生長繁殖創(chuàng)造了厭氧環(huán)境，后期乳酸菌大量繁殖代謝產(chǎn)生的乳酸中和掉了一部分胺類物質(zhì)，降低了培養(yǎng)基pH，同時改善了發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味，這就是發(fā)酵飼料成品具有酸香味的一個重要原因[27]，這與劉劍飛[20]、史玉寧等[28]的研究結(jié)果一致。

M:蛋白質(zhì)Marker；0:未發(fā)酵豆粕樣品；1:單菌發(fā)酵豆粕樣品；2:混菌發(fā)酵豆粕樣品。

M: protein marker; 0: unfermented soybean meal sample; 1: single strain fermented soybean meal sample; 2: mixed strains fermented soybean meal sample.

圖9豆粕發(fā)酵前后蛋白質(zhì)分子電泳圖

Fig.9Electrophoretogram of protein molecular for soybean meal before and after fermentation

3.3　豆粕發(fā)酵前后大豆球蛋白含量的變化

大豆球蛋白是熱穩(wěn)定性最強(qiáng)的抗原蛋白之一，同時也是大豆引起動物過敏反應(yīng)和腹瀉的主要成分。付亭亭[25]分別采用4種不同的微生物對豆粕進(jìn)行適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中大豆球蛋白含量均有不同程度的降低，其中大豆球蛋白的含量最低減少6.86%，最高可達(dá)29.25%；混菌發(fā)酵豆粕的結(jié)果表明不同的菌種組合表現(xiàn)出不同的降解能力，但是與單一菌種發(fā)酵結(jié)果相比，效果基本一致。而本試驗中所用菌種對大豆球蛋白降解能力相對較高，豆粕經(jīng)單菌、混菌發(fā)酵后，大豆球蛋白的含量分別降低52.65%和40.75%，且單菌發(fā)酵效果要顯著優(yōu)于混菌發(fā)酵效果。

3.4　豆粕發(fā)酵前后蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的變化

李世豪[29]在微生物對豆粕發(fā)酵的動態(tài)研究中發(fā)現(xiàn)，未發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)主要集中在45～66 ku，經(jīng)微生物發(fā)酵72 h后，20 ku以上的蛋白質(zhì)大量降解，只剩下20 ku以下的蛋白質(zhì)，呈現(xiàn)出大分子蛋白質(zhì)逐漸減少，小分子蛋白質(zhì)逐漸增多的現(xiàn)象。本試驗中，未經(jīng)發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)主要在分布在30 ku以上，集中分布在35和45 ku區(qū)域，而經(jīng)微生物發(fā)酵后，豆粕的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量發(fā)生了明顯變化，大分子蛋白質(zhì)被降解為小分子蛋白質(zhì)，集中分布在15～20 ku，35 ku以上蛋白質(zhì)的被降解完全，這與李世豪[29]的研究結(jié)果一致。大分子蛋白質(zhì)經(jīng)過微生物發(fā)酵后被降解為小分子蛋白質(zhì)、小肽、氨基酸等小分子物質(zhì)，使得其更有利于動物的消化利用，同時豆粕中的抗原蛋白也得到了很好地降解，使得蛋白質(zhì)品質(zhì)得到提升，這也是發(fā)酵豆粕利用率較高的原因之一[11]。

4　結(jié)　論

① 通過研究解淀粉芽孢桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母菌的生長曲線，得出最佳接種時間為21 h。

② 解淀粉芽孢桿菌單菌固態(tài)發(fā)酵豆粕最佳工藝條件為：接種量為10%、溫度為40 ℃、料水比為1.0∶1.2、發(fā)酵時間為72 h；解淀粉芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母混菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的最佳工藝條件為：接種量為15%、溫度為31 ℃、料水比為1.0∶1.0、發(fā)酵時間為120 h，且試驗菌株的接種比例為解淀粉芽孢桿菌∶植物乳桿菌∶釀酒酵母=9∶3∶2。

③ 豆粕經(jīng)過微生物固態(tài)發(fā)酵后小肽含量得到提高，營養(yǎng)價值得到改善，大分子蛋白質(zhì)被降解，pH也發(fā)生了變化，且單菌與混菌發(fā)酵效果存在差異。