劉顯明，顧焰波，陳冬年，王翼，王華

（南京理工大學(xué)泰州科技學(xué)院 環(huán)境與制藥工程學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

原花青素是一類(lèi)黃烷醇單體及其聚合體的多酚類(lèi)化合物，又稱(chēng)聚黃烷醇類(lèi)多酚，前者為黃烷－4－醇或黃烷－3，4－二醇，后者則為縮合單寧和酚酸，廣泛存在于各類(lèi)植物中［1］，且存在于日常生活的許多食品中，如紅酒等。許多食源性的原花青素在日常生活中被人們攝取，且具有較好的生物活性，原花青素具有抗氧化、清除自由基、防治心血管疾病、抗炎、防癌抗癌等功能［2－6］。目前，原花青素在食品、藥品、保健食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，作為天然食源性防腐劑，主要用于延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，可消除人工合成防腐劑帶來(lái)的安全風(fēng)險(xiǎn)，并對(duì)人體健康具有重要作用；作為食品調(diào)料，廣泛用于各種日常食品如奶酪、蛋糕等以及飲料、酒中，可提升食品的營(yíng)養(yǎng)保健功能。新鮮石榴皮中黃酮含量較高，約為6%，原花青素為其主要的黃酮化合物成分［7，8］，合理利用可變廢為寶，故其分離純化技術(shù)也越來(lái)越受到重視。

目前，植物中原花青素的提取工藝主要有傳統(tǒng)溶劑提取法［9］、微波和超聲波輔助法［10］、酶法輔助提?。?1］等，酶法提取利用酶對(duì)植物細(xì)胞壁進(jìn)行降解和破壞，可增加細(xì)胞內(nèi)容物的溶出，提高有效成分的提取效率。本試驗(yàn)采用蝸牛酶輔助從石榴皮中提取原花青素，并通過(guò)BBD設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化其工藝條件，將會(huì)給石榴皮綜合利用提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴（購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?，產(chǎn)地泰州）；蝸牛酶（破壁率可達(dá)90%以上）；其他生化試劑（上海金穗生物科技有限公司）；其他實(shí)驗(yàn)試劑（均為市售分析純）。

pHS－3C酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE－52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海研承儀器有限公司；SHB－Ⅲ真空泵 鄭州長(zhǎng)城儀器有限公司；DHG－9202－3SA電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；XFB－200微型高速粉碎機(jī) 湖南吉首中誠(chéng)制藥機(jī)械廠；UV754N紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精科儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 石榴皮預(yù)處理

將新鮮石榴洗干凈、手工剝皮，將石榴皮放入烘箱中，設(shè)定溫度60℃、烘干12h。取出之后用微型高速粉碎機(jī)粉碎［12］，過(guò)40目篩子，所得粉末狀經(jīng)50～70℃的烘箱中干燥，粉末密封保存在白色塑料袋里備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

本試驗(yàn)采用正丁醇－鹽酸法測(cè)定原花青素的含量，參考文獻(xiàn)［13］，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪制出原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 原花青素的提取

參考文獻(xiàn)［14］，稱(chēng)取一定量的備用石榴皮粉末置于圓底燒瓶中，在一定的酶用量（%，下同）下，加入一定pH的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液、搖勻，于水浴鍋中加熱攪拌一定時(shí)間后趁熱過(guò)濾、收集濾液?；厥諡V渣并加入100mL 70%乙醇，80℃條件下提取30min后趁熱過(guò)濾，分離并保留濾液，所得濾渣重復(fù)上一次操作，合并所有濾液并再次過(guò)濾、收集濾液，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后（50℃），得到原花青素濃縮液。用甲醇將其定容至50mL容量瓶中，在3500r/min下離心10min，移取1mL上層清液按照原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定其吸光度值，記錄并處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.4 原花青素得率的計(jì)算

式中：V為濃縮液定容后的體積（mL）；C為濃縮液中原花青素的含量（mg/mL）；M為石榴皮粉末質(zhì)量（g）。根據(jù)原花青素含量與吸光度值之間的一元線性回歸方程可得出原花青素的含量，進(jìn)而計(jì)算出得率。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

在固定其他因素相同的條件下，分別考察各單因素：酶用量（%）、提取時(shí)間（min）、提取溫度（℃）和pH值對(duì)得率的影響。

1.2.6 響應(yīng)曲面法優(yōu)化原花青素提取條件

以酶用量（%）、提取時(shí)間（min）、提取溫度（℃）和pH值為單因素試驗(yàn)考察變量，依據(jù)BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以原花青素得率為優(yōu)化響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件，因素水平安排見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度（A550）為縱坐標(biāo)，原花青素濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制曲線。

圖1 原花表素標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，原花青素的濃度與吸光度值之間的一元線性回歸方程為：Y＝0.03745＋2.17233X，R2＝0.9997。結(jié)果表明：采用1.2.2的方法測(cè)得的原青花素濃度在30～300μg/mL范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取備用的石榴皮粉末3.000g進(jìn)行下列單因素試驗(yàn)。

2.2.1 酶用量對(duì)得率的影響

提取溫度為50℃，pH值為5.0，提取時(shí)間為90min，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 酶用量對(duì)原花青素得率的影響

由圖2可知，隨著酶用量的增多，原花青素得率也逐漸增大，當(dāng)酶用量為1.0%時(shí)得率最大；隨后原花青素的得率隨著酶用量增加而下降。其原因可能是酶用量較低時(shí)，酶與底物結(jié)合較充分，細(xì)胞壁與細(xì)胞間的果膠物質(zhì)水解程度大，進(jìn)而溶出原花青素。當(dāng)酶用量大于1.0%時(shí)，底物濃度不能使酶達(dá)到飽和，從而抑制酶水解果膠成分使原花青素的提取效果下降［15］。因此，酶用量以1.0%為宜。

2.2.2 pH值對(duì)得率的影響

提取溫度為50℃，酶用量為1.0%，提取時(shí)間為90min，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 pH對(duì)原花青素得率的影響

由圖3可知，隨著緩沖液pH值升高，原花青素得率也升高，pH值為5.0時(shí)得率最大，pH值過(guò)高得率反而下降。其原因可能是pH值過(guò)高蝸牛酶的生物活性受到一定抑制作用，不利于提取。因此，本試驗(yàn)選擇pH值5.0左右為宜。

2.2.3 提取溫度對(duì)得率的影響

pH值為5.0，酶用量為1.0%，提取時(shí)間為90min，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取溫度對(duì)得率的影響

由圖4可知，溫度小于50℃時(shí)，原花青素得率隨著溫度的升高而增大，50℃時(shí)得率達(dá)到最大值，繼續(xù)升高溫度后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其原因可能是在50℃前隨著溫度的升高果膠物質(zhì)水解程度增大，反應(yīng)速率較快，使酶水解反應(yīng)較強(qiáng)，原花青素得率不斷增加；溫度超過(guò)50℃時(shí)維系酶空間結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵斷裂，部分蝸牛酶失去活性，水解程度降低，得率下降。因此，提取溫度50℃為宜。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

pH值為5.0，酶用量為1.0%，提取溫度為50℃，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響

由圖5可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，原花青素得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，90min時(shí)達(dá)到最大，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間得率不升反降。這可能是由于原花青素屬于多酚類(lèi)化合物，延長(zhǎng)提取時(shí)間會(huì)使原花青素的穩(wěn)定性下降，原花青素得率進(jìn)而下降，因此，提取時(shí)間90min為宜。

2.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過(guò)Design Expert軟件，建立以原花青素得率為響應(yīng)值的回歸模型：

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸模型分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型結(jié)果分析

由表3可知，模型的p＜0.0001，說(shuō)明式（2）中回歸方差的關(guān)系是顯著的；失擬項(xiàng)的p值為0.2714＞0.05，說(shuō)明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小，式（2）回歸方程的關(guān)系是好的；其R2＝0.9374，表明此模型擬合度較好；回歸模型一次項(xiàng)A，B，D對(duì)原花青素得率影響極顯著，一次項(xiàng)C影響不顯著，二次項(xiàng)BD，CD，A2，B2，C2影響極顯著，交互項(xiàng)AB影響顯著，其余不顯著，說(shuō)明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響比較復(fù)雜，并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，各因素對(duì)原花青素得率的影響次序?yàn)椋篈＞D＞B＞C。

響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖6～圖11。

圖6 Y＝（A，B）的響應(yīng)圖面

圖7 Y＝（A，C）的響應(yīng)圖面

圖8 Y＝（A，D）的響應(yīng)圖面

圖9 Y＝（B，C）的響應(yīng)圖面

圖10 Y＝（B，D）的響應(yīng)圖面

圖11 Y＝（C，D）的響應(yīng)圖面

由圖6～圖11可知，響應(yīng)中心位于所考察區(qū)域內(nèi)，且響應(yīng)曲面坡度越陡，則響應(yīng)值對(duì)試驗(yàn)條件的改變?cè)矫舾?，說(shuō)明在考察區(qū)域范圍內(nèi)存在最大響應(yīng)值。試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件下得出原花青素提取的最佳工藝為：pH值5.0、提取溫度51.58℃、酶用量0.982%、提取時(shí)間95.19min，原花青素得率為0.692%?？紤]到實(shí)際操作條件，在如下條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)：提取溫度50℃、pH值5.0、提取時(shí)間90min、酶用量1.0%，原花青素得率為0.658%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用蝸牛酶輔助提取石榴皮中的原花青素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明：采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化所得到的試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合度良好，具有一定的實(shí)際應(yīng)用和研究參考價(jià)值，結(jié)合試驗(yàn)實(shí)際操作條件，其響應(yīng)面優(yōu)化的提取工藝參數(shù)為：酶解溫度50℃、pH值5.0、提取時(shí)間90min、酶用量1.0%，原花青素得率為0.658%。