付明剛， 迪麗米娜·伊拉木， 郭麗英

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科, 烏魯木齊 830054)

微小RNA (microRNA,miRNA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類廣泛的存在于動物和植物細(xì)胞內(nèi)的非編碼單鏈小分子RNA，其長度約18～25個核苷酸(nucleutide，nt)[1]。目前研究表明，在實(shí)體腫瘤細(xì)胞中，腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展與miRNA表達(dá)水平的異常表達(dá)關(guān)系密切[2-3]，并且直接影響腫瘤的的侵襲性[4-5]。本研究通過原位雜交技術(shù)檢測60例石蠟包埋的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及對應(yīng)的癌旁組織中miR-146a的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與浸潤性乳腺癌相關(guān)的臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，從而探討其是否可作為臨床侵襲性及預(yù)后的的分子標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2014年1月-2016年8月手術(shù)治療的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者標(biāo)本60份，由新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究院標(biāo)本庫提供，入組患者手術(shù)方式為乳腺癌改良根治術(shù)，乳腺腫瘤直徑≤3 cm，癌旁組織為距癌組織>3 cm的乳腺非腫瘤組織，全部病例均經(jīng)病理證實(shí)，病理資料均完整。入組患者均為女性，年齡30～68歲，中位年齡45歲，排除新輔助化療患者；患者均接受規(guī)范化治療，手術(shù)方式為改良根治術(shù)，術(shù)后行表阿霉素+多西他賽(TA)方案輔助化療6個周期，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)≥4枚行規(guī)范化放療，術(shù)后激素受體陽性患者接受內(nèi)分泌治療，2017年7月31日為隨訪截止時間，平均隨訪時間為23個月。所有標(biāo)本常規(guī)4%福爾馬林固定后石蠟包埋，切片厚約4 μm。

1.2主要試劑miR-146a地高辛標(biāo)記探針為Exiqon公司產(chǎn)品；miRNA ISH Buffer Set (FFPE)購自丹麥Exiqon公司；敏感型原位雜交試劑盒(MK1030)購自武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒及其它常規(guī)試劑購自新疆寶信生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗方法

1.3.1 原位雜交檢測miR-146a在乳腺癌組織中的表達(dá) 切片用脫蠟液常規(guī)脫蠟，3%H2O2室溫下浸泡處理切片10 min，采用蒸餾水洗2次；室溫下用3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶消化15 min，PBS洗3次，每次5 min；預(yù)雜交液37℃預(yù)雜交3 h；添加稀釋濃度為40 μg/mL的miR-146a 探針，原位雜交蓋玻片覆蓋后恒溫箱37℃雜交過夜(約16 h)；2×SSC洗滌液梯度充分洗滌；封閉液37℃封閉60 min；滴加生物素化鼠抗地高辛室溫孵育2 h，PBS漂洗4次，每次5 min；滴加SABC 37℃孵育20 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加生物素化過氧化物酶37℃孵育20 min，PBS洗4次，每次5 min；應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，充分水洗，PBS返藍(lán)，常規(guī)酒精梯度脫水，二甲苯透明，封片。以上各項檢測均嚴(yán)格按照試劑盒操作。

1.3.2 原位雜交及免疫組化結(jié)果判斷 由二位高年資的病理醫(yī)師采用雙盲法對原位雜交結(jié)果進(jìn)行評定。Olympus顯微鏡下觀察評分，miR-146a陽性標(biāo)準(zhǔn)為：其陽性表達(dá)于胞漿，呈黃色或棕黃色顆粒狀或團(tuán)塊狀。采用定性法判斷結(jié)果：鏡下觀察5個高倍視野(×200)陽性細(xì)胞數(shù) <10%為(-), 陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為(+)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用χ2檢驗或四格表確切概率法對miR-146a的表達(dá)與臨床病理特診進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中miR-146a表達(dá)水平本研究采用原位雜交技術(shù)檢測60例乳腺癌石蠟組織切片miR-146a的表達(dá)，其陽性表達(dá)于胞漿中，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒狀或團(tuán)塊狀。miR-146a在乳腺癌組織中陽性表達(dá)見圖1a，在癌旁組織陽性表達(dá)見圖1b。

a: 癌組織中miR-146a的陽性表達(dá)

b: 癌旁組織中miR-146a的陽性表達(dá)

圖1miR-146a在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織及癌旁組織中的陽性表達(dá)

2.2miR-146a在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況比較原位雜交結(jié)果顯示，miR-146a在60例乳腺癌組織中有16例呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為23.3%，miR-146a在60例乳腺癌旁組織中有43例呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為71.7%， miR-146a在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率低于癌旁乳腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 乳腺癌組織和癌旁組織中miR-146a的表達(dá)/例

2.3乳腺浸潤性導(dǎo)管癌miR-146a表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系乳腺浸潤性導(dǎo)管癌miR-146a 表達(dá)與患者相關(guān)臨床病理資料之間的關(guān)系見表2。原位雜交結(jié)果顯示，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者miR-146a陽性表達(dá)率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(58.8% vs 14.0%,P=0.001);其表達(dá)水平與患者年齡、乳腺腫瘤大小、組織學(xué)分級、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及C-erbB-2受體等激素受體狀態(tài)等無明顯關(guān)系(P>0.05)。

表2 miR-146a表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系/例(%)

3 討論

目前的研究表明，miRNA作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，通過降解目標(biāo)RNA而控制基因的表達(dá)，參與了生物體的生長、發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等生理病理過程[6-7]；并通過抑制目標(biāo)mRNA翻譯或誘導(dǎo)目標(biāo)mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[8-9]。相關(guān)研究已證實(shí)，miRNA成為乳腺癌相關(guān)生物治療靶點(diǎn)[10-12]。miR-146a為miRNA家族中的成員之一，定位于第5號染色體LOC285628基因上，廣泛參與了人類多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程[13-15]。

許多醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，miR-146a在許多腫瘤中下調(diào)，推測其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在乳腺癌細(xì)胞中明顯下調(diào)，通過改變其表達(dá)可對RhoA蛋白的作用而直接影響MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的遷移和腫瘤細(xì)胞侵襲，提示了miR-146a 作為乳腺癌細(xì)胞中的腫瘤抑制物。

原位雜交技術(shù)通過帶有標(biāo)記物的核酸探針來檢測待測組織中核酸的表達(dá)及分布情況，是對miRNA表達(dá)的定性分析方法之一。本研究通過原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組織，浸潤性乳腺癌組織中miR-146a的表達(dá)明顯下調(diào)，其表達(dá)與患者年齡、乳腺腫瘤的大小、組織學(xué)分級及激素受體狀態(tài)等無明顯關(guān)系(P<0.05)。本研究在檢測浸潤性乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)， miR-146a表達(dá)水平在淋巴結(jié)非轉(zhuǎn)移者中明顯高于轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，提示其表達(dá)下調(diào)在乳腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移中存在相關(guān)性，起到抑制腫瘤侵襲的作用。因此，認(rèn)為miR-146a 可能成為抑制乳腺癌進(jìn)展的潛在的預(yù)后標(biāo)志物，但原位雜交技術(shù)為一種半定量檢測，檢測預(yù)后指標(biāo)的潛在價值有限，仍有待一種定量的方法來佐證。

綜上所述，在本研究發(fā)現(xiàn)相對于乳腺癌癌旁組織，乳腺癌組織中miR-146a的表達(dá)水平呈明顯下調(diào)，通過原位雜交實(shí)驗發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，證明其可能為乳腺癌相關(guān)的一種抑癌基因，可能參與了乳腺癌的進(jìn)展。因本實(shí)驗入選樣本較小，且乳腺癌組織中miR-146a表達(dá)下調(diào)抑制乳腺腫瘤的細(xì)胞通路機(jī)制不明，其具體機(jī)制有待于今后更深入的研究證實(shí)。