田菊 牛新月 鐵英 林曉飛

(內(nèi)蒙古和盛生態(tài)科技研究院有限公司，呼和浩特，011517) (內(nèi)蒙古大學(xué))

楊樹是我國華北、東北和西北地區(qū)用材林、防護(hù)林、碳匯林建設(shè)的"當(dāng)家"樹種[1]，迄今已栽植約500萬hm2，但相關(guān)區(qū)域楊樹良種選育進(jìn)展緩慢，目前在用材林、防護(hù)林建設(shè)和城鎮(zhèn)綠化中，仍采用20世紀(jì)中期選育出的群眾楊(Populus‘Popularis’)、北京楊(P.pyramidalis×P.cathayana‘Beijingensis’)等雜交品種，以及尚未品種化的新疆楊(P.bolleana)、河北楊(P.hopeiensis)等樹種，嚴(yán)重制約了生態(tài)建設(shè)中樹種多樣性的選擇。楊樹的基因組雜合性非常高，往往在減數(shù)分裂過程中存在著較為復(fù)雜的染色體行為。目前，楊屬白楊派、黑楊派、青楊派中部分樹種在減數(shù)分裂上研究較多，大多集中在減數(shù)分裂進(jìn)程與染色體行為方面[2-4]。毛新楊×銀灰楊二倍體雜種母本是耐寒性較強(qiáng)的毛新楊(P.tomentosa×P.bolleana)，父本為更為耐寒的銀灰楊(P.canescens)，具有速生、耐鹽堿、抗寒、抗旱、抗病蟲害等特點(diǎn)，適宜于內(nèi)蒙古、寧夏、遼寧和吉林南部平原地區(qū)栽培。本研究為了較好地利用毛新楊×銀灰楊雜種的優(yōu)良基因資源，為后期雜交育種、多倍體育種以及分子育種等提供必要的遺傳學(xué)信息，主要開展了花芽外部形態(tài)、花粉形態(tài)的觀測，并利用醋酸洋紅臨時(shí)壓片法對小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程及其染色體行為進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。

1 材料與方法

2017年2月份，于內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市奈曼旗興隆沼林場附近(43°4′5″N，120°49′5″E)，采集花芽飽滿且無病蟲害的毛新楊×銀灰楊雜種雄株花枝，用厚塑料薄膜包裹嚴(yán)實(shí)快遞至內(nèi)蒙古和盛生態(tài)科技研究院進(jìn)行切枝水培，室內(nèi)溫度保持在20～25 ℃，每2～3 d換一次水。為了保證每個(gè)減數(shù)分裂時(shí)期均能被觀察并固定，對枝條進(jìn)行了多批次多時(shí)間段水培。

花序形態(tài)觀察： 從材料水培時(shí)起，每隔1 d觀察一次，每次固定觀察30個(gè)花芽。記錄花芽的長度和寬度(1/2位置為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值)，并選擇具有代表性的花芽拍照。

減數(shù)分裂觀察： 水培開始后，每隔2～4 h采集3～5個(gè)雄花芽，去掉苞片，置于卡諾固定液(V(無水乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)中固定2～24 h后，再放在4 ℃條件下保存，一直固定到花藥成熟散粉時(shí)為止。減數(shù)分裂觀察時(shí)，采用康向陽等[2]的方法進(jìn)行，即夾取卡諾固定液中花芽的小花，置于潔凈載玻片上，除去花盤，滴加2滴醋酸洋紅，用尖嘴鑷子夾碎花藥制作涂片，火焰干燥，晾干后，利用Olympus BX-51光學(xué)顯微鏡觀察，Olympus DP70照相系統(tǒng)數(shù)碼拍照。

花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂特異性統(tǒng)計(jì) ： 在減數(shù)分裂觀察過程中，進(jìn)行特異性統(tǒng)計(jì)，每個(gè)時(shí)期觀察500個(gè)以上的花粉母細(xì)胞，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行減數(shù)分裂特異行為比率計(jì)算。

花粉大小及敗育率統(tǒng)計(jì)： 花序散粉時(shí)，利用干燥的毛筆將花粉收集到放有硅膠的西林瓶中，蓋上蓋子置于冰箱中4 ℃?zhèn)溆??；ǚ鄞笮∮^察測定時(shí)，滴一滴醋酸洋紅在潔凈的載玻片上，用鑷子夾取少量花粉，均勻涂抹在醋酸洋紅中，蓋上蓋玻片，消除氣泡，染色5 min后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，利用Olympus DP70照相系統(tǒng)進(jìn)行隨機(jī)拍照(視野不重復(fù))，觀察花粉粒總數(shù)為1 000個(gè)以上，利用Adobe Photoshop CS3對花粉直徑、敗育花粉率、天然2n花粉率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以花粉直徑大于平均直徑的1.28倍作為未進(jìn)行減數(shù)的2n花粉[3]。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與圖片處理：采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)管理、統(tǒng)計(jì)分析與圖表繪制，采用Adobe Photoshop CS3進(jìn)行圖片制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛新楊×銀灰楊雜種雄株的花序發(fā)育進(jìn)程

通過觀察發(fā)現(xiàn)，毛新楊×銀灰楊雜種雄株花序發(fā)育進(jìn)程分為花蕾期(圖1 a)，這時(shí)花序長度約為1 cm，花芽膨大，花序未露出苞片；伸展期(圖1 b、圖1c)，花序長度快速增加，并露出苞片，每一朵小花逐漸變大，顏色逐漸由淺紅變成深紅，由極度緊縮慢慢變伸展；盛花期(圖1 d)，這時(shí)花序長度仍在伸長，每一朵小花均逐漸開裂散粉，一般是花序基部最先散粉，然后是中部，頂端最后散粉；開花末期(圖1 e)，每朵小花均開裂散粉，散粉完畢后，花盤干枯，花序開始逐漸脫落。

在室內(nèi)20～25 ℃水培條件下，毛新楊×銀灰楊雜種花期為7 d，其花序長度變化范圍為1.00～5.20 cm，呈“S”型增長，在3～4 d ，生長速度加快，第4 d的長度是第3 d的1.36倍，5 d后長度趨于穩(wěn)定，7 d之后花序脫落；寬度變化范圍為0.74～1.00 cm，3 d后寬度趨于穩(wěn)定(表1)。通過方差分析表明，每天的花序長度和寬度之間均差異極顯著(sig≤0.001)，說明在花序發(fā)育過程中，其長度和寬度均有一定程度的增加，但長度的增加量更加明顯。

a.花蕾期(0～1 d)；b、c.伸展期(2～3 d)；d.盛花期(4 d)；e.開花末期(5～7 d)；標(biāo)尺均為1 cm。

圖1 毛新楊×銀灰楊雜種花序發(fā)育進(jìn)程

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 毛新楊×銀灰楊雜種雄株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程及染色體行為

毛新楊×銀灰楊雜種減數(shù)分裂進(jìn)程在花蕾期完成。室溫20～25 ℃條件下，完成減數(shù)分裂大概需要39 h。水培至14 h時(shí)，開始進(jìn)行減數(shù)分裂，花粉母細(xì)胞進(jìn)入細(xì)線期(圖2a)，細(xì)胞核變大，核仁十分明顯，染色質(zhì)逐漸盤旋折疊，變短變粗，并出現(xiàn)極化現(xiàn)象，向核仁一側(cè)聚攏。經(jīng)過28 h后，進(jìn)入粗線期(圖2b)，染色體明顯縮短、變粗，顏色加深，此時(shí)出現(xiàn)了同源染色體配對現(xiàn)象。水培至33 h后，減數(shù)分裂進(jìn)入雙線期，可明顯觀察到，核仁顏色變淺，開始消失，聯(lián)會的兩條同源染色體開始分離，但某些區(qū)段仍黏結(jié)在一起，形成交叉結(jié)(圖2c)。水培35 h后，進(jìn)入終變期(圖2d)，染色體變得非常收縮，更短更粗達(dá)到最小體積，此時(shí)，核仁完全消失。終變期的結(jié)束就標(biāo)志著減數(shù)分裂前期Ⅰ的完成。之后，減數(shù)分裂進(jìn)入一個(gè)較快的變化階段。中期Ⅰ時(shí)(圖2e)，紡錘體出現(xiàn)，在其牽引下，染色體排列在赤道板上，此時(shí)，出現(xiàn)了一些形態(tài)不同的單價(jià)體和二價(jià)體。后期Ⅰ(圖2f)，同源染色體逐漸向兩級移動。末期Ⅰ(圖2g)，在花粉母細(xì)胞兩極各出現(xiàn)1個(gè)核仁，染色體呈染色質(zhì)狀，并開始聚集。末期Ⅰ完成后，標(biāo)志著第一次減數(shù)分裂完成，進(jìn)入第二次減數(shù)分裂。前期Ⅱ(圖2h)，表現(xiàn)為染色體逐漸變粗短，核仁第2次開始消失。中期Ⅱ(圖2i)，染色體顯著縮短，整齊地排列在赤道板上。后期Ⅱ(圖2j)，著絲點(diǎn)分裂為2個(gè)，染色單體在紡錘絲牽引下分別移向兩極。末期Ⅱ(圖2k)，移向兩極的染色體開始聚集，開始解螺旋化，恢復(fù)到染色質(zhì)的形態(tài)，同時(shí)4個(gè)核仁形成。隨著兩次的細(xì)胞質(zhì)分裂，花粉母細(xì)胞形成4個(gè)子細(xì)胞，即“四分體”(圖2l)。

a.細(xì)線期；b.粗線期；c.雙線期；d.終變期；e.中期Ⅰ；f.后期Ⅰ；g.末期Ⅰ；h.前期Ⅱ；i.中期Ⅱ；j.后期Ⅱ；k.末期Ⅱ；l.四分體；標(biāo)尺均為20 μm。

2.3 毛新楊×銀灰楊雜種雄株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常行為

毛新楊×銀灰楊雜種在減數(shù)分裂過程中除了正常的分裂行為外，還會出現(xiàn)一些異常分裂現(xiàn)象(表2)。中期Ⅰ時(shí)，一些染色體不排列在赤道板上，而分散在赤道板外，這些異常類型比率達(dá)17.27%。在后期Ⅰ時(shí)，由于一些染色體分離速度較慢，導(dǎo)致了落后染色體和染色體橋出現(xiàn)，概率分別為7.99%和1.86%。末期Ⅰ時(shí)，占總細(xì)胞17.17%比率的微核出現(xiàn)。中期Ⅱ，紡錘體一般情況下是互呈60°或120°(圖3a)，而在毛新楊×銀灰楊雜種中出現(xiàn)了其他4種紡錘體，它們分別是融合紡錘體(圖3b)、平行紡錘體(圖3c)、垂直紡錘體(圖3d)以及多個(gè)紡錘體，出現(xiàn)概率分別為6.10%、8.01%、8.89%、0.35%，其中以平行紡錘體和垂直紡錘體比率較高。后期Ⅱ時(shí)，同樣有落后染色體和染色體橋出現(xiàn)，但比后期Ⅰ概率低，分別為3.55%和0.39%。末期Ⅱ，微核的出現(xiàn)率也較末期Ⅰ低，為7.84%。在四分體時(shí)期，除了正常形態(tài)的四分體外(77.96%)(圖3 e)，還形成了其他較多種類的減數(shù)分裂產(chǎn)物，總變異率可達(dá)22.04%，其中單分體(圖3 f)、二分體(圖3 g)、三分體(圖3 h)、多分體的概率分別為2.89%、9.19%、2.13%、0.26%，含微核的單分體、二分體(圖3 i)、三分體(圖3 j)、四分體(圖3 k)的概率分別為0.94%、4.77%、0.94%、0.94%，在這幾種特殊"分體"中，屬二分體出現(xiàn)概率高，三分體和多分體出現(xiàn)的概率較低。此外，在單分體中，還存在著細(xì)胞內(nèi)只有1個(gè)細(xì)胞核(圖3 f)、2個(gè)細(xì)胞核(圖3 l)以及細(xì)胞質(zhì)斷裂(圖3 m)的異常情況；在二分體中，出現(xiàn)了細(xì)胞核分裂成2個(gè)(圖3 g)、3個(gè)(即4個(gè)細(xì)胞核中有2個(gè)融合未分離)(圖3 n)的特異情況；在二分體和四分體中，還出現(xiàn)了多個(gè)微核(圖3 i和圖3o)。

2.4 毛新楊×銀灰楊雜種雄株花粉特性

在植物減數(shù)分裂過程中，由于減數(shù)分裂異常情況的出現(xiàn)，會使花粉大小不一。對毛新楊×銀灰楊雜種花粉直徑測量后(共測1 278粒)，發(fā)現(xiàn)其花粉直徑變化明顯，呈高斯分布，變化范圍為15.07～54.61 μm，平均為30.20 μm?；ǚ壑睆酱笮〖蟹植荚?8～34 μm ，該直徑范圍內(nèi)花粉數(shù)占所有被測量花粉數(shù)的86.56%。

表2 毛新楊×銀灰楊雜種減數(shù)分裂異常情況比率

通過對毛新楊×銀灰楊雜種的花粉特性研究表明，其存在花粉敗育情況(圖3 p，箭頭1所示)，敗育率為9.47%，正?；ǚ勐蕿?0.53%(表2)，具有較高的可育性。根據(jù)前人的研究表明，花粉直徑在平均直徑1.28倍(38.67 μm)以上為未進(jìn)行減數(shù)的2n花粉，因此，本研究中毛新楊×銀灰楊雜種也存在大花粉(圖3 p，箭頭2所示)，但出現(xiàn)概率較低，為1.41%。

3 結(jié)論與討論

溫度是影響植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因子。溫度越高，植物的生長速度越快。毛白楊在自然狀態(tài)下，完成減數(shù)分裂時(shí)間為7～8 d，而在溫度為10～25 ℃的環(huán)境下，其完成減數(shù)分裂所需時(shí)間為1～3 d[2]。王君等[4]研究表明，通遼楊在10～20 ℃水培條件下，約7 d完成減數(shù)分裂。本研究中，毛新楊×銀灰楊雜種在室溫20～25 ℃情況下，只需39 h即可完成減數(shù)分裂。由此表明，減數(shù)分裂進(jìn)程主要是受植物自身特性和外部溫度進(jìn)行調(diào)控的。

有關(guān)研究表明，雜種起源的植物種，因?yàn)槠淙旧w來源于不同的物種，會使染色體配對不規(guī)則及染色體分離不平衡，往往會表現(xiàn)出減數(shù)分裂異質(zhì)性[5-6]。楊樹品種在減數(shù)分裂過程中存在著廣泛的染色體異?，F(xiàn)象，往往出現(xiàn)落后染色體、染色體橋、融合紡錘體、單分體、三分體、帶微核的分體等[2，4-6]。本研究中，毛新楊×銀灰楊雜種是由雜種三倍體毛新楊和雜種二倍體銀灰楊進(jìn)行雙雜交獲得的，融合了毛白楊、新疆楊、銀白楊、山楊4個(gè)親本的染色體，雜合程度非常高，因此在其小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中存在著較為復(fù)雜的染色體配對現(xiàn)象，從而導(dǎo)致了上速染色體異常現(xiàn)象的發(fā)生。中期Ⅰ和末期Ⅰ時(shí)異常細(xì)胞比率分別為17.27%和17.17%，兩個(gè)時(shí)期變異率十分接近，說明末期Ⅰ微核的形成可能與中期Ⅰ染色體不在一條直線上有較大關(guān)聯(lián)。

減數(shù)分裂過程中，一般認(rèn)為，融合紡錘體和平行紡錘體可使二分體產(chǎn)生，而三分體的產(chǎn)生可能與三極紡錘體有關(guān)[5]。毛新楊×銀灰楊雜種平行紡錘體和融合紡錘體出現(xiàn)的概率之和為14.11%，而二分體和含微核的二分體概率之和為13.96%，與前述結(jié)論一致。另外，本研究中還出現(xiàn)了較少的多個(gè)紡錘體，概率為0.35%，其與多分體(概率0.26%)的形成息息相關(guān)。此外，互呈一定角度的紡錘體與四分體形成直接相關(guān)，在各自分裂項(xiàng)中出現(xiàn)概率比較接近，分別為76.66%和78.90%。

花粉敗育往往伴隨著減數(shù)分裂異?，F(xiàn)象的出現(xiàn)而出現(xiàn)。毛新楊×銀灰楊雜種敗育花粉率為9.47%，微小孢子出現(xiàn)率總和為7.59%，兩者差異較小。常童潔等[7]指出，BM-1毛白楊不育雄株在花藥發(fā)育過程中，由于脂類營養(yǎng)物質(zhì)匱乏和代謝的紊亂引發(fā)絨氈層非正常死亡，使花粉無法及時(shí)得到營養(yǎng)供給，最終導(dǎo)致花粉敗育。而筆者卻認(rèn)為植物花粉敗育是因?yàn)闇p數(shù)分裂過程中微小孢子體內(nèi)由于沒有整套完整的遺傳物質(zhì)。

A.60°或120°紡錘體；b.融合紡錘體；c.平行紡錘體；d.垂直紡錘體；e.四分體；f.含1個(gè)細(xì)胞核的單分體；g.含2個(gè)細(xì)胞核的二分體；h.三分體；i.含有多個(gè)微核的二分體；j.含1個(gè)微核的三分體；k.含1個(gè)微核的四分體；l.含2個(gè)細(xì)胞核的單分體；m.細(xì)胞質(zhì)分裂的單分體；n.含3個(gè)細(xì)胞核的二分體；o.含多個(gè)微核的四分體；p.花粉形態(tài)；箭頭1示敗育花粉粒；箭頭2示大花粉粒；其他為正常花粉粒；標(biāo)尺為50 μm。

圖3毛新楊×銀灰楊雜種中期Ⅱ和四分體時(shí)期特異情況及花粉形態(tài)

植物界中普遍存在2n花粉，通常單倍性花粉比2n花粉要少一套染色體[3，8]。本研究中天然2n花粉率為1.41%，概率較低。有關(guān)研究推測天然2n花粉的發(fā)生可能與后期Ⅱ紡錘體定位異常有關(guān)[9-10]，而Zhang et al.[11]研究指出，第二次減數(shù)分裂過程中平行紡錘體的極點(diǎn)融合是毛白楊天然2n花粉發(fā)生的主要原因。本研究結(jié)果揭示了毛新楊×銀灰楊雙雜交種減數(shù)分裂的遺傳變異規(guī)律，可為后期倍性育種、誘變育種以及分子育種等研究提供較好的技術(shù)資料。